An easy-to-use, cell-free expression protocol for the residue-specific incorporation of noncanonical amino acid analogs into proteins, including downstream analysis, is presented for medical, pharmaceutic, structural and functional studies.
O conjunto canónico de aminoácidos leva a uma excepcionalmente ampla gama de funcionalidades proteína. No entanto, o conjunto de resíduos ainda impõe limitações sobre os pedidos de proteínas potenciais. A incorporação de aminoácidos noncanonical pode ampliar este âmbito. Existem duas abordagens complementares para a incorporação de aminoácidos não-canónicos. Para a incorporação específica do local, para além dos mecanismos endógenos de translação canónicos, um par aminoacil-ARNt-sintetase-ARNt ortogonal deve ser desde que não interage com os canónicas. Por conseguinte, um codão que não é atribuído a um aminoácido canónica, geralmente um codão de terminação, também é necessário. Esta expansão código genético permite a incorporação de um aminoácido não-canônico a uma única, dado local no interior da proteína. O trabalho aqui apresentado descreve a incorporação específica do resíduo onde o código genético é transferido dentro do sistema translacional endógeno. A maquinaria de tradução umccepts o aminoácido não-canônico como um substituto para incorporá-lo em locais canonicamente prescrita, ou seja, todas as ocorrências de um aminoácido na proteína canónica são substituídos por um não-canônico. A incorporação de aminoácidos noncanonical pode alterar a estrutura da proteína, fazendo com que as propriedades físicas e químicas consideravelmente modificadas. Análogos de aminoácidos noncanonical muitas vezes actuam como inibidores de crescimento de células de hospedeiros de expressão, uma vez que modificar proteínas endógenas, o que limita na produção de proteínas in vivo. In vivo, a incorporação de aminoácidos em proteínas tóxicas noncanonical permanece um desafio especial. Aqui, é apresentada uma abordagem isenta de células para uma completa substituição de L-arginina por o aminoácido L-canavanina não-canônico. Isso evita as dificuldades inerentes de expressão in vivo. Além disso, um protocolo para a preparação de proteínas alvo para a análise de espectro de massa está incluído. Mostra-se que a L-lisina pode ser substituída por L-hidroxi-lisina,embora com menor eficiência. Em princípio, qualquer análogo de aminoácido não-canônico podem ser incorporados utilizando o método apresentado enquanto o endógena in vitro sistema de tradução que reconhece.
O código genético é universal para a biosfera. Ele codifica para um conjunto de 20 aminoácidos canónicos, que às vezes é prorrogado por selenocisteína 1 ou 2 pyrrolysine. É o que se traduz ribossoma do código genético, com a ajuda de ARNt em cadeias de aminoácidos que se dobram em proteínas. Os grupos funcionais dos aminoácidos canónicos, em combinação com modificações pós-tradução, contribuem para uma gama excepcionalmente ampla de 3,4 a função da proteína. Em princípio, as limitações funcionais devido ao conjunto limitado de aminoácidos canónicos pode ser superado mediante a incorporação de mais, aminoácidos não-canónicos (NCAAs) que permitem novos produtos químicos e novas funcionalidades 3,4.
Existem duas abordagens complementares para a incorporação de: a NCAAs site- ou a incorporação específica do resíduo. O primeiro método implica dificuldades técnicas consideráveis, uma vez que o conjunto de canônica de aminoacil-tRNA-synthetases (RAA) e tRNAs deve ser expandido por um par RAA-ARNt ortogonal que não deve interagir com o endógena máquinas de tradução. Com base em engenharia cuidadosa, esta abordagem incorpora os NCAAs como mutações pontuais nos locais de proteína desejada. Incorporação específica do local de NCAAs é geneticamente codificado por um codão que não é atribuído a um ácido amino canónica (CAA), normalmente um codão de terminação a 5-9. Este método implica alterações na função em um determinado site, em vez de ao longo de toda a proteína 10-13.
Em contraste, a incorporação específica do resíduo baseia-se no reconhecimento erróneo do aminoácido não-canônico pela maquinaria de tradução canónica. A incorporação ocorre devido à falta de especificidade para o substrato das RAA. A incorporação específica do resíduo de NCAAs, construída sobre o trabalho de Cohen e colegas de trabalho de 14, levou a aplicações importantes 3,10, entre eles rotulagem bio-ortogonal 15-17 de proteínasou elucidação da estrutura de proteínas em cristalografia de raios X 18.
Como RAA naturais geralmente preferem sua aminoácido cognato mais de uma NCAA isoestrutural, eficientes na incorporação específica do resíduo vivo geralmente requer um hospedeiro de expressão auxotr�ica não é capaz de sintetizar o analógico canônica da NCAA. As células hospedeiras são cultivadas em meio de crescimento, que proporciona apenas uma baixa concentração do análogo CAA. Seu esgotamento em combinação com a suplementação consecutivo, com a NCAA força o hospedeiro de expressão para incorporar o NCAA na proteína modelo em vários locais, canonicamente prescritos. Em contraste com a abordagem de local específico, este geralmente tem um profundo impacto sobre toda a estrutura da proteína, conduzindo a modificado consideravelmente as propriedades físicas e químicas de proteínas 19,20. No entanto, a maior parte do NCAAs são inibidores do crescimento para o hospedeiro de expressão a 3, em que são incorporados em muitos outros Proteins, além daqueles de interesse durante a expressão do gene recombinante. Isto limita claramente a abordagem in vivo. A incorporação in vivo de aminoácidos que são tóxicos ou têm uma forte influência sobre a estrutura da proteína permanece um desafio especial. No entanto, estas moléculas estão entre os mais promissores para a engenharia de proteínas com funções extraordinárias.
Um exemplo é o tóxico, não-canônico, que ocorrem naturalmente L-canavanina (CAN), um análogo da L-arginina (Arg). Ela afeta e blocos Arg caminhos de reação de regulação e catalíticos associados, e sua presença na célula viva pode levar a morte imediata 3,21-23. A sua incorporação em proteínas nas posições de arginina pode reduzir a estabilidade da proteína 21-23. Devido à toxicidade resultante, a expressão de proteínas contendo canavanina em Escherichia coli (E. coli) e outros hospedeiros de expressão comum continua a ser um desafio. Por estas razões, completo in vivo, incorporation de Can em todas as posições Arg foi adequadamente confirmada apenas uma vez 24, utilizando um sistema de produção de single-proteína elaborado. No entanto, pode tem sido proposta como um agente anti-cancro 25-27, e como um estimulador de doenças autoimunes em seres humanos 28. Além disso, é objecto de vários estudos sobre a sua actividade anti-metabólica, antibacteriano, antifúngico e as propriedades antivirais 25. Estas propriedades levantar uma demanda por eficiente e fácil de executar métodos para expressar Pode contendo proteínas para farmácias e estudos funcionais.
Apesar de muitos problemas que estão ligados à produção in vivo pode ser contornado usando sistemas de expressão livre de células, nas abordagens específicas de resíduos in vitro só foram pouco explorados. A incorporação específica do resíduo isento de células de um análogo de L-triptofano e 29 múltiplos NCAAs 30 têm sido relatados. Estes métodos baseiam-se no altamente effictário polimerase de ARN de T7. A polimerase de ARN T7 de bacteriófago implica a transcrição semelhante, reduzindo assim a funcionalidade genético em comparação com a transcrição endógena.
A incorporação específica do resíduo completo de lata em um modelo de proteína em todas as posições Arg Recentemente, foi relatado 31, utilizando um sistema de expressão isento de células 32. Uma ligeira modificação do mesmo sistema permitiu a incorporação específica do local de diferentes análogos de pirrolisina em um modelo de proteína através de codão de terminação de supressão de 33. O sistema livre de células empregadas 31-33 é baseado em um todo E. coli sistema de transcrição-tradução. No entanto, permite a expressão da proteína de forma tão eficiente como nos sistemas actuais de bacteriófagos (0,5 – 1 mg / ml de proteína recombinante) 32, enquanto retém a maior parte do original modularidade de transcrição-tradução.
Neste trabalho, um protocolo detalhada é fornecida sobre a forma como o residincorporação de UE específicos de NCAAs pode ser realizado, utilizando tudo isto E. sistema livre de células coli 32. Além disso, são propostas novas medidas para preparar as proteínas expressas para avaliação adequada via espectroscopia de massa HPLC-ESI. Para expandir as propriedades deste sistema isento de células, este trabalho não se refere apenas à incorporação publicada de Can 31, mas também apresenta novos dados relacionados com a não-canônico L-lisina analógico L-hidroxi-lisina.
O protocolo seguinte para a incorporação específica do resíduo de NCAAs é uma adaptação de um protocolo recentemente publicado em 34 JoVE. O último protocolo descreve como realizar a expressão isento de células altamente eficiente com aminoácidos padrão. Além disso, apresenta-se a preparação do extracto em bruto livre de células, a solução de amino ácido, a solução de reserva de energia e o tampão de energia utilizada nesta abordagem. O protocolo seguinte concentra-se em passos modificados em comparação com o anterior Protocolo, a fim de permitir a incorporação específica do resíduo de NCAAs. pipetas calibradas, dicas de ligação baixas pipetas e tubos de micro-centrífuga são recomendados para a preparação. No que se segue, as abreviaturas IUPAC para os aminoácidos são utilizados.
An-fácil de usar sistema de expressão livre de células como uma estratégia viável ao resíduo especificamente incorporar NCAAs em proteínas, é apresentado. Para este fim, o extracto em bruto é suplementado com codificação de ADN do vector para a proteína de interesse, o acumulador de energia e os aminoácidos correspondentes. Note-se que o volume da alíquota de extracto em bruto depende da concentração de proteína extracto em bruto 34. A eficiência de expressão isento de células é optimizado dependendo da concentração construção de ADN vector. Os volumes dos componentes do tampão de energia variam em função da optimizado Mg- e concentrações de K-glutamato a fim de permitir rendimentos elevados da proteína expressa modelo livre de células.
Uma avaliação preliminar da experiência de incorporação pode ser obtida através da realização de SDS-PAGE do meio reaccional isento de células não purificado. Para uma análise mais detalhada, espectroscopia de massa HPLC-ESI é proposto como um meio para verificar se há incor completa, específica do resíduoporação da NCAA. Como preparação para o último, sistemas de colunas de spin são utilizados para permitir a purificação His-tag e troca de tampão com os pequenos volumes que usamos neste protocolo.
Incluindo espectroscopia de massa de HPLC-ESI, todo o protocolo pode ser realizado no prazo de 2 dias. Ele não inclui quaisquer medidas particularmente críticos. No entanto, optimizações concentração de Mg e K-glutamato, bem como de um vector de ADN são cruciais, de modo a expressar altos rendimentos de proteína modelo. A utilização do vector de expressão altamente eficiente pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 é fortemente recomendado. Eluição de marcadas com His proteínas é geralmente devido à alta concentração de imidazol (> 150 mm) e outros sais, tais como NaH 2 PO 4 (> 300 mm) ou NaCl (> 50 mM) que geram alto ruído de fundo na análise espectroscópica de massa 49 . Intercâmbio desses buffers de eluição com um tampão de armazenamento de proteína adequado estabiliza o modelo protee reduz drasticamente o ruído de fundo durante a análise espectroscópica de massa.
Como resultado, é possível substituir Arg na todas as seis posições dentro do modelo de proteína. No sistema de expressão, não há resíduos de Arg pode ser detectada. Isto simplifica a incorporação específica do resíduo de Arg análogos em comparação com outros sistemas de expressão que necessitam de novas estratégias de depleção 29,30. A abordagem livre de células apresentou contorna as limitações inerentes in vivo abordagens que são devido à toxicidade Can, ou a forte dependência da sequência de mRNA em estratégias de produção única de proteínas 24,31. Contrariamente à empregada no sistema videodan vitro, a clivagem in vivo de Can para homosserina e hydroxyguanidine ocorre 31.
No entanto, o sistema isento de células retém uma quantidade suficiente de Lys para competir com análogos tais como Hyl. A análise de espectroscopia de massa de HPLC-ESI mostra que a proteína modelo contém ambos, a Canonical, bem como o análogo não-canônico em diferentes proporções. A incorporação específica do resíduo de Lys é possível em geral, mas por substituição completa, novas estratégias de esgotamento, ou RAA especialmente projetados e ARNt optimizado para o reconhecimento de NCAAs precisa ser desenvolvida.
Obtivemos excelentes rendimentos de proteínas expressas, modelo modificados isentos de células por adição do NCAA na mesma concentração que os canónicas. A eficácia de incorporação depende da natureza do NCAA a ser incorporados. Mesmo rendimentos mais elevados ainda pode ser realizável através da optimização da concentração da NCAA.
Os resultados apresentados demonstram a aplicabilidade do sistema utilizado para a incorporação específica do resíduo de NCAAs enquanto eles são aceitos pelo sistema translacional endógena canônico. Para a incorporação específica do resíduo de NCAAs específicos, mais um necessidades para verificar se os resíduos da distur CAA análogaB, o sistema de expressão.
Sistemas de transcrição-tradução isentos de células podem ser manipuladas de diferentes organismos que respondem a diferentes exigências 54. O toda E. coli mecanismos de transcrição-tradução do sistema isento de células aqui apresentadas permitir a utilização do bacteriófago e E. os promotores de E. coli, e que pode actuar em paralelo ou consecutivamente nas cascatas de 55. A aplicabilidade geral e usabilidade tornar o método uma potente ferramenta para futuras pesquisas em toxicidade de aminoácidos e aplicação terapêutica.
The authors have nothing to disclose.
E.G. Worst and A. Ott acknowledge financial support by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) within the collaborative research center SFB 1027 as well as Saarland University. E.G. Worst, A. Ott and V. Noireaux further acknowledge financial aid by the Human Frontiers Science Program Organization (HFSPO). The authors thank Tobias Baumann and Stefan Oehm (Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin) for critical reading.
Protective eyewear | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z758841 | |
Nitrile gloves (size S) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z768960 | Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL |
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30123.328 | |
Microbalance Discovery DV114CM | Ohaus, Greifensee, Switzerland | 80104140 | |
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z243213 | |
L-Canavanine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C9758 | Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves |
Hydroxylysine (racemic mixture) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H0377 | |
Cryo-gloves (size S, water resistent) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z183490 | Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL |
RTS Amino Acid Sampler | Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany | BR1401801 | For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G) (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) |
HEPES | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H6147 | |
ATP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A8937 | |
CTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 14121 | |
GTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 16800 | |
UTP | Affymetrix, Santa Clara, USA | 23160 | |
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 10109541001 | Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001 |
CoA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C4282 | |
NAD (from yeast ) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | N6522 | |
cAMP | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | A9501 | |
Folinic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | F7878 | |
3-PGA | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8877 | |
Mg-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 49605 | |
K-glutamate | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | G1149 | |
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 | Addgene, Cambridge, USA | Plasmid #40019 | |
4-20 % precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 81610 | |
SDS running buffer (10 x concentrate, 5000 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 50001 | |
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | TG 05002 | |
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) | New England Biolabs, Ipswich, USA | P7702S | |
Methanol | Merck, Darmstadt, Germany | 1060091011 | Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood |
Acetic acid (99.8 %) | VWR International, Darmstadt, Germany | 20104.447 | |
Coomassie Blue G-250 (10 g) | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 902120 | |
His-Spin Protein Miniprep kit | Zymo Research Europe, Freiburg, Germany | P2002 | Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA |
Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | T1503 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | H1758 | |
Glycerol, 99 % | VWR International, Darmstadt, Germany | 24397.296DB | |
CentriPure Z25 mini spin columns | Genaxxon bioscience, Ulm, Germany | CP-0205-Z100 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | S9888 | |
Concentrator 5301 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5301 000.210 | |
2xYT | MP biomedicals, Santa Ana, USA | 113012032 | |
Bacto-Agar | BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA | 214010 | |
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) | Biospec, Bartlesville, USA | 522S | |
Beads, 0.1mm dia. | Biospec, Bartlesville, USA | 11079101 | |
BL21 Rosetta 2 E. coli strain | Merck, Darmstadt, Germany | 71402 | |
Bradford BSA protein assay Kit | Bio-Rad, München, Germany | 500-0201 | |
Chloramphenicol | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | C1919 | |
Cuvettes, 1.5ml | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 14-955-127 | |
DTT | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | D0632 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Bio-Rad, München, Germany | 732-6204 | |
Nunc 384-well optical bottom plates | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 142761 | |
Nunc sealing tape | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 232701 | |
PEG-8000 | Promega, Madison, USA | V3011 | |
Potassium phosphate dibasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8584 | |
Potassium phosphate monobasic solution | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | P8709 | |
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 66382 | |
Spermidine | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 85558 | |
1L centrifuge bottle | Beckman-Coulter, Brea, USA | A98813 | |
4L Erlenmeyer flask | Kimble Chase, Vineland (NJ), USA | 26500-4000 | |
Avanti J-26XP centrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 393127 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 1 l bottles. |
Forma 480 orbital shaker | Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA | 480 | Or shaker equivalent being able to shake chest-size 6 x 4 L . |
JLA-8.1000 rotor | Beckman-Coulter, Brea, USA | 363688 | Or 5000 x g rotor equivalent for above centrifuge equivalent being able to centrifuge 1L-bottles. |
Mini-Beadbeater-1 | Biospec, Bartlesville, USA | 3110BX | |
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge | Beckman-Coulter, Brea, USA | 368831 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
Heating block HLC HBT 130 | Labexchange, Burladingen, Germany | 24465 | Or heating block equivalent being able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C |
Eppendorf MiniSpin centrifuge | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5452000018 | Or centrifuge equivalent being able to centrifuge 2 ml reaction tubes. |
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 – 2500 rpm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z654760 | Or vortex equivalent |
Scotsman AF103 ice flaker machine | Kälte-Berlin, Berlin, Germany | AF103 | Or ice flaker machine equivalent |
MyTemp mini digital incubator | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z763314 | Or incubator equivalent being able to heat samples at 29 °C |
EcoCell electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12005 | Or electrophoresis chamber equivalent being able to perform vertical gel electrophoresis with above precast gels or other used gels |
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber | Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany | AN12001 | Or power supply equivalent being able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5278 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 | VWR International, Darmstadt, Germany | 613-5279 | Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 – 10 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171101 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 – 200 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171301 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 – 1000 µl) | Gilson, Middleton, USA | F171501 | Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision |
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 50-0156 | |
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) | VWR International, Darmstadt, Germany | 525-0150 | |
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany | 187262 | |
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 567227-U | |
Agilent 1260 HPLC machine | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G1312B | |
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS | Agilent Technologies, Santa Clara, USA | G6530BA | |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 270717 | |
FLUOstar Omega microplate reader | BMG Labtech, Ortenberg, Germany | 415-101 | Or microplate reader equivalent being able to measure the fluorescence of the expressed model protein |
Hanna Checker pH meter | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | Z351091 | |
Formic acid eluent additive for LC-MS | Sigma-Aldrich, St. Louis, USA | 56302 |