Localizing gene expression to specific cell types can be challenging due to the lack of specific antibodies. Here we describe a protocol for simultaneous triple detection of gene expression by combining double fluorescence RNA in situ hybridization with immunostaining.
Обнаружение экспрессии генов в различных типах клеток головного мозга , например, нейроны, астроциты, олигодендроциты, олигодендроцитов и микроглии предшественников, может быть затруднено из – за отсутствия конкретных первичных или вторичных антител для иммунологического окрашивания. Здесь мы опишем протокол для определения экспрессии трех различных генов в той же секции головного мозга с использованием двойной флуоресценции в гибридизация с двумя геноспецифических зондов с последующим иммунным окрашиванием с антителом высокой специфичностью , направленной против белка , кодируемого геном третьего. Aspartoacyclase (ООРА) генов, мутации которых могут привести к редкой человеческой болезни белой материи – болезнь Канавана – Считается , что выражается в олигодендроцитов и микроглии , но не в астроциты и нейроны. Тем не менее, до сих пор не установлена точная картина экспрессии ASPA в головном мозге. Этот протокол позволил нам определить, что ООРА выражается в субпопуляции зрелых олигодендроцитов ае он может быть как правило, применяется к широкому спектру исследований характера экспрессии генов.
Глиальные клетки, которые являются наиболее распространенными клеток в центральной нервной системе (ЦНС), включают в себя олигодендроцитов (в myelinating клетки центральной нервной системы), олигодендроциты предшественники (OPS, также известные как "NG2 клетки"), астроциты и микроглии. Существует растущий интерес к функции глиальных клеток и их потенциальной роли в неврологических заболеваний 1. Например, болезнь Канавана (CD) является наследственным нейродегенеративным заболеванием начиная с раннего детства с губчатой Leukodystrophy и прогрессирующей потерей нейронов, что приводит к смерти , как правило , до 10 лет , 2,3. Мутации в гене Aspartoacyclase (ООРА) , которые приводят к значительно сниженную активность ASPA 4 в КР были идентифицированы. ООРА представляет собой фермент , катализирующий деацетилирование N-ацетиласпартата (НАА), молекула высоко концентрированным в головном мозге, генерируя ацетат и аспартат 5-7. Многие пациенты CD показывают более высокие уровни NAA из-за отсутствия ООРА переменного токательность. Некоторые исследования предполагают , что НАА полученный ацетат может быть основным источником жирных кислот / липидов в головном мозге в процессе разработки и CD могут возникнуть в результате снижения синтеза миелина в процессе развития , вызванного отказом НАА быть разбиты 3,5,6.
ООРА встречается преимущественно в почках, печени и белого вещества головного мозга, а также учитывая важную роль в ООРА CD, сотовая экспрессия этого фермента в мозге было изучено несколько лабораторий. Глядя на ферментативную активность ООРА в головном мозге, более ранние исследования показали , что увеличение активности ООРА во время развития мозга параллельно временной ход миелинизации 8-10. На клеточном уровне, анализы для ферментативной активности, а также в гибридизация (МОГ) и иммуногистохимии (IHC) , в анализ позволяет предположить , что ООРА в основном экспрессируется в олигодендроциты в головном мозге , но не в нейронах или астроцитов 11-16. Несколько исследований показали, что ООРА может такжевыражается в микроглии в центральной нервной системе 12,14. До сих пор данные по экспрессии ООРА в ФОС ограничены. Согласно данным недавнего исследования , где Транскриптом различных типов клеток в коре головного мозга мыши , включая нейроны, астроциты, ФОС, новообразованных олигодендроцитов, myelinating олигодендроцитов, микроглии, эндотелиальные клетки, и перицитами анализировали с помощью РНК секвенирования 17, экспрессируется исключительно ООРА в олигодендроциты , в частности, в myelinating олигодендроциты (http://web.stanford.edu/group/barres_lab/brain_rnaseq.html). Несмотря на эти исследования по ООРА паттерна экспрессии в головном мозге, ряд неопределенностей, остаются.
Различные методы могут быть использованы для изучения паттернов экспрессии генов. IHC является широко используемый метод для определения функционального продукта (т.е. белок) генной экспрессии в срезах ткани. Несмотря на большую полезность, этот метод имеет свои ограничения, как его применение и специфичность могут быть тО наличии и специфичности антитела необходимо. Для сравнения, ISH имеет то преимущество, которое позволяет выявить экспрессию любого гена на уровне мРНК. Тем не менее, это может быть технически сложно использовать несколько зондов в то же время для того, чтобы локализовать экспрессию генов в специфических типах клеток. В этой статье мы опишем протокол сочетающую двойной РНК флуоресцентной гибридизации videodan – situ с флуоресцентной immunolabelling белка. Мы использовали этот набор методов для изучения характера экспрессии Aspa в мозге мыши. Этот метод позволяет точно Изучение экспрессии генов с использованием конфокальной микроскопии.
Этот протокол предусматривает процедуру шаг за шагом для двойной РНК гибридизация с последующим иммунным окрашиванием. Мы использовали этот протокол для подтверждения того, что Aspa выражается в зрелых олигодендроцитов в нескольких областях мозга.
Эта процеду…
The authors have nothing to disclose.
Work in the authors’ laboratories was supported by the UK Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BB/J006602/1 and BB/L003236/1), the Wellcome Trust (WT100269MA) and the European Research Council (ERC, “Ideas” Programme 293544). SJ was supported by an EMBO long-term fellowship. The authors thank Stephen Grant for his technical assistance.
QIAprep® Miniprep | Qiagen | 27104 | |
Deionized formamide | Sigma | F9037 | for ISH blocking buffer |
Sodium chloride | Sigma | S3014 | |
Trizma Base | Sigma | T1503 | |
Hydrochloric acid | VWR International | 20252.290 | |
Sodium phosphate monobasic anhydrous | Sigma | S8282 | |
Sodium phosphate dibasic dihydrate | Sigma | 30435 | |
Yeast tRNA | Roche | 10109495001 | |
50x Denhardt's solution | Life Technologies | 750018 | |
Dextran sulfate | Sigma | D8906 | |
Aspa cDNA clone | Source Bioscience | IRAVp968C0654D | |
SalI | New England Biolabs | R0138 | |
Sodium acetate | Sigma | S2889 | |
Equilibrated phenol | Sigma | P4557 | |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
Isoamyl alcohol | Aldrich | 496200 | |
Ethanol | VWR International | 20821.321 | |
T7 RNA polymerase | Promega | P4074 | |
Transcription buffer | Promega | P118B | |
100mM DTT | Promega | P117B | |
UTP-DIG NTP mix | Roche | 11277073910 | |
Rnasin | Promega | N251B | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Filter paper | Fisher scientific | 005479470 | |
Sucrose | Sigma | 59378 | |
Diethyl pyrocarbonate | Sigma | D5758 | |
Pentobarbitone | Animalcare Ltd | BN43054 | |
Dissecting scissors | World Precision Instruments | 15922 | |
25 gauge needle | Terumo | 300600 | |
Peristaltic pump | Cole-Parmer Instrument Co. Ltd | WZ-07522-30 | |
Iris scissors | Weiss | 103227 | |
No.2 tweezers | World Precision Instruments | 500230 | |
Coronal Brain Matrix | World Precision Instruments | RBMS-200C | |
Razor blade | Personna Medical | PERS60-0138 | |
OCT medium | Tissue tek | 4583 | |
Cryostat/microtome | Bright | ||
Superfrost plus slides | Thermo Scientific | J1800AMNZ | |
Sodium citrate | Sigma | S4641 | for 65°C wash buffer |
Formamide | Sigma-Aldrich | F7503 | |
Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
Coverslips | VWR International | 631-0146 | |
Coplin Jar | Smith Scientific Ltd | 2959 | |
Blocking reagent | Roche | 11096176001 | |
Heat-inactivated sheep serum | Sigma | S2263 | |
Hydrophobic pen | Cosmo Bio | DAI-PAP-S | 1:500 |
α-FITC POD-conjugated antibody | Roche | 11426346910 | |
TSA™ Plus Fluorescein System | Perkin Elmer | NEL741001KT | 1:1500 |
α-DIG AP-conjugated | Roche | 11093274910 | |
Fast red tablets | Roche | 11496549001 | |
.22µM filter | Millex | SLGP033RS | |
α-Olig2 Rabbit antbody | Millipore | AB9610 | |
Alexa Fluor® 647-conjugated α-rabbit antibody | Life technologies | A-31573 | 1:1000 |
bisBenzimide H 33258 | sigma | B2883 | |
Mounting medium | Dako | S3023 | |
Leica SP2 confocal microscope | Leica |