Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.
Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.
El cáncer de ovario es el cáncer ginecológico más letal en los Estados Unidos con la mayor causa de morbilidad y mortalidad de ser las características altamente recurrentes, quimiorresistentes de esta enfermedad. El tratamiento primario por lo general comprende la cirugía de citorreducción máxima y la terapia basada en platino posterior, aunque existe cierta evidencia que sugiere la terapia neoadyuvante podría ser beneficioso en algunos casos 1. La mayoría de los pacientes responden favorablemente al tratamiento primario, pero desafortunadamente la mitad recaerá en 18 meses 2.
La mayoría de los tumores malignos de ovario son carcinomas epiteliales y pueden tener su origen en el epitelio superficial del ovario o 3,4 tubo de Falopio. Varios estudios apoyan la existencia de células madre somáticas en el sistema reproductor femenino que, presumiblemente, ayudar en la reparación de los tejidos que se necesita después de la ovulación 5,6. La alta actividad proliferativa, tanto en el ovario y la trompa de Falopio durante ovulación podría ser un factor importante en el desarrollo de cáncer de ovario (Gharwan, et al. manuscrito presentado). La derivación de las células tumorales de formación está claro pero puede surgir a partir de células madre normales, células progenitoras, o células diferenciadas a través de mutaciones que las hacen incapaces de regular la división o el destino. Estas células también se han denominado "células madre del cáncer", o "células iniciadoras del cáncer", y pueden crecer en esferoides multicelulares tumorígenos, bajo condiciones de poca fijación. Aunque el modelo jerárquico de desarrollo TIC puede ser dinámico, TICs comparten muchas de las mismas características que las células madre normales, incluyendo la quietud, la resistencia a la quimioterapia, a largo plazo la auto-renovación y la capacidad de diferenciarse en varios linajes celulares 7,8.
Varios estudios apoyan la existencia de las TICs en el cáncer de ovario y de los esfuerzos actuales están llevando a cabo para aclarar el mecanismo (s) por el cual estas células apoyan tumorigénesis 9-11. Se han propuesto varios marcadores para identificar TIC de ovario con tumorigenicidad mejorada incluyendo CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, y MyD88, aunque la contribución exacta de cada marcador no está clara y puede ser de tipo celular específico 11-16. Mientras que un marcador universal, o conjunto de marcadores no se ha demostrado de manera inequívoca para TICs ováricos, diferentes grupos han aislado TICs ováricos más comúnmente mediante la selección de CD44 +, CD133 + y / o células con alta aldehído deshidrogenasa (ALDH) actividad 13,17-21. CD44 es una glicoproteína transmembrana que actúa como receptor para el ácido hialurónico y regula varios procesos importantes para la progresión tumoral, incluyendo la adhesión, proliferación, migración, la angiogénesis y la diferenciación 22. CD133 es una glicoproteína transmembrana cuya función todavía no está claro, pero los estudios sugieren que organiza topología de la membrana plasmática 23. ALDH, una enzima intracelular que cataliza la oxidación de aldehídos, puede ser la más universal marcador de TIC como alta actividad ha sido identificada en células madre aisladas de una variedad de tejidos y múltiples funciones han sido atribuidas a ALDH en el apoyo a las células madre normales y los tics 24. A partir de ahora, CD133 y ALDH1 parecen ser los marcadores más reproducibles de TICs ovario 13,21.
Además de conocer las características de las TICs, también hay un gran esfuerzo para identificar fármacos que se dirigen específicamente a esta subpoblación. La alta tasa de recaída asociado con el cáncer de ovario puede ser debido al fracaso de las quimioterapias actuales para erradicar con éxito tics. Aunque la mayor parte del tumor es susceptible a las terapias existentes, tics se cree que son resistentes y con una densidad indetectable por métodos estándar. Elucidar los mecanismos de resistencia a la terapia y la recaída del tumor son vitales para mejorar la respuesta y las tasas de supervivencia global de los pacientes con cáncer de ovario.
Aquí, las técnicas de cultivo se describen ésimoa enriquecer para los tics de líneas celulares de cáncer de ovario establecidos y primarios. Las condiciones de cultivo descritas en el presente documento se han usado por varios grupos para inducir la propagación de células tics o esferoide con cualidades de células madre 11,12,14,16,20. Aunque hay varios medios de cultivo de células madre y suplementos comúnmente usados para enriquecer TIC / esferoides se utilizó una fórmula medios libres de suero con EGF y FGF, pero sin la adición de B27 o N-2 suplementos. Estos suplementos, comúnmente utilizados para el cultivo celular neuronal y enriquecedora para las células madre, se han demostrado para promover un fenotipo mesenquimal 25,26 y hay cierta incertidumbre en el campo de si TIC que tienen un fenotipo mesenquimal o epiteliales son más tumorigénico 27-29 . Para minimizar las incertidumbres y las variables se optó por utilizar la fórmula más común, ya que se trata de células de cáncer de ovario epitelial.
El mantenimiento de las células en medio libre de suero en un matraz bajo adjuntofacilita la formación de esferoides y apoya la propagación de células con expresión CD133 y alta actividad ALDH. Nuestro trabajo ha puesto de manifiesto, además, que las células flotantes en condiciones normales adherentes también pueden representar una población TIC más tumorigénico. La inyección de células cultivadas en estas condiciones en ratones desnudos atímicos conduce a un mayor potencial tumorigénico en comparación con las células cultivadas en condiciones adjuntas en presencia de suero. Mucha información sobre el papel de las TICs en la iniciación del cáncer ovárico, la progresión, la respuesta terapéutica, y la recaída de la enfermedad puede ser adquirida a través de la utilización de estas técnicas.
El protocolo descrito aquí presenta un método eficiente y consistente para enriquecer cultivos de células con características de células madre a partir de líneas celulares de cáncer de ovario establecidos y es aplicable a muestras primarias de pacientes. Este método enriquece con éxito para los tics a través de una variedad de líneas celulares. Permite la identificación oportuna de las condiciones que enriquecen a un TIC y / o fenotipo tumorigénico, sin tomarse el tiempo para ordenar físicamente las TICs de los no TICs dentro de la población. De esta manera, los niveles relativos de las diferentes vías de señalización pueden ser evaluados por su contribución al fenotipo TIC mediante la comparación de cultivos adherentes tradicionales para Tic culturas que utilizan una variedad de ensayos funcionales. Si se desea una población pura TIC, el aislamiento se puede conseguir fácilmente mediante la incorporación de un paso de fluorescencia asistida o magnético de clasificación en el protocolo de citometría de flujo.
Es importante tener en cuenta, sin embargo, que la expresión del marcador de TICs, tales como CD133, CD44, o ALDH, puede variar entre líneas celulares o muestras incluso del mismo tipo de tumor de pacientes. Por ejemplo encontramos que las células OVCAR-5 tienen una mayor expresión de CD44 en relación con CD133, mientras que lo contrario es cierto para ACI-23. Por tanto, es pertinente que confiar en la iniciación del tumor en ratones y análisis de citometría de flujo como definitiva de la presencia TIC. Siguiendo este protocolo, actividad alta ALDH fue constantemente observada cuando las células de cáncer de ovario se cultivaron en condiciones de células madre. Curiosamente, la expresión CD133 es consistentemente mayor en las células de ACI-23 cultivadas en condiciones tradicionales de cultivo de TIC, mientras que ALDH es mayor en flotador condiciones TIC. En contraste los TGS-3 células de ascitis primarios muestran un pequeño aumento en CD133 positividad bajo condiciones flotador TIC, pero un aumento notable en la actividad ALDH en condiciones TIC tradicionales. Estos resultados ponen de manifiesto la heterogeneidad de las células del cáncer de ovario y la plasticidad comúnmente asociado con las TICs. Para apoyar aún más la claim que estos métodos mejoran TIC, también se observó el enriquecimiento de TRA-1-60 células positivas. TRA-1-60 es un marcador de pluripotencia y se ha utilizado para identificar carcinomas embrionarios del ovario y testículos, así como cáncer de próstata TICS 30-32. Aunque nuestros métodos han tenido éxito con numerosas líneas de células, es posible que las condiciones TIC estándar pueden ser más adecuado para algunas células de cáncer de ovario, mientras que las condiciones flotador modificados mejor enriquecen para los tics en otras poblaciones de células de cáncer de ovario. De nuevo, esto pone de manifiesto la heterogeneidad esperada dentro de las dos líneas celulares de cáncer de ovario-derivados de pacientes y establecidos.
Además de los marcadores de superficie celular hay varios factores de transcripción que se ha demostrado para caracterizar TIC cáncer de ovario incluyendo Nanog, Sox2, Oct-4 11, aunque estos marcadores no son específicos de TIC de cáncer de ovario y más bien representan factores importantes para la pluripotencia de células madre embrionarias y difdiferencia- 33,34. Se examinaron los cambios en los niveles proteicos de estos factores y encontró que los niveles Nanog aumentan en condiciones de cultivo de TIC, de acuerdo con los demás 13,35 así como CD133, TRA-1-60, y CD117. Una matriz de ADNc marcador de células madre humanas mostró además un incremento en los genes CD133, Nanog, Melk y Podxl en las condiciones TIC en comparación con las condiciones adherentes tradicionales. Es importante destacar que, cabe señalar que, como con marcadores de superficie celular, factores de transcripción asociados con tics ováricos pueden variar entre líneas celulares y muestras de pacientes.
Hemos observado que las células pueden ser más tumorigénico y expresan niveles más altos de marcadores de células madre si son inherentemente no adherente in vitro (es decir, células que no se adhieren fácilmente a una placa adherente flotante). En cultivo, líneas celulares tales como ACI-23 normalmente tienen muchas células y / o células viables flotantes que crecen verticalmente en una manera de apilamiento bajo Condit cultura tradicionaliones. Aunque el enriquecimiento exitosa de TICs de las células flotantes y agregados podría ser líneas celulares aplicables a relativamente pocos incluidas las del presente estudio y OVCAR-3 12, nuestros hallazgos sugieren que esto podría representar una población más tumorigénico. Por lo tanto, la recolección de la población "flotante" de las células cultivadas en placas de cultivo de tejidos y medios de comunicación estándar puede servir como un método alternativo de enriquecimiento de TIC, para las células que se adaptan mal a los medios de comunicación de células madre comercial.
El uso de los diferentes métodos de cultivo que se presentan en este manuscrito permitirá el enriquecimiento rápido de las poblaciones de TIC y una mejor comprensión de cuáles son los factores apoyar este fenotipo en diferentes células. Las aplicaciones actuales de este método incluyen caracterizadora que las vías de señalización son vitales para mantener la propagación de esta población única de células. Los resultados de estos estudios ayudarán a aclarar los mecanismos de progresión del tumor y la recaída.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
Epidermal Growth Factor – human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning cellgro | 25-056-CI | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Gemini | 100-106 | |
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) | Nalgene | 450-0045 | |
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |