Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.
Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.
Eierstockkrebs ist die tödlichste gynäkologischen Malignomen in den Vereinigten Staaten mit der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität als die hochwiederkehrenden, chemoresistenten Merkmale dieser Krankheit. Primäre Behandlung besteht in der Regel maximal onkologischer Chirurgie und anschließender Platin basierende Therapie, allerdings gibt es einige Hinweise auf eine neoadjuvante Therapie nahelegen könnten, in einigen Fällen vorteilhaft 1 sein. Die Mehrzahl der Patienten reagieren positiv auf primäre Behandlung, aber leider die Hälfte wird innerhalb von 18 Monaten 2 Rückfall.
Meist Eierstockmalignitäten epitheliale Karzinome und in der Oberfläche Epithelien des Ovars oder Eileiter 3,4 stammen. Mehrere Studien belegen die Existenz von somatischen Stammzellen in der weiblichen Fortpflanzungsorgane, die vermutlich in die Reparatur von Gewebe, das nach dem Eisprung 5,6 benötigt wird helfen. Die hohe Proliferationsaktivität sowohl am Eierstock und Eileiter während Övülation könnte ein wichtiger Faktor bei der Entwicklung von Eierstockkrebs sein (Gharwan, et al. Manuskript eingereicht). Die Ableitung der tumorbildenden Zellen ist unklar, aber sie durch Mutationen, die sie nicht in der Lage Teilung oder Schicksal zu regulieren machen aus normalen Stammzellen, Vorläuferzellen oder differenzierten Zellen entstehen können. Diese Zellen sind auch "Krebsstammzellen" oder genannt worden "krebsauslösenden Zellen," und kann in tumorigenen, vielzelligen Sphäroide unter niedrigen Anbaubedingungen wachsen. Obwohl das hierarchische Modell der TIC Entwicklung können dynamisch sein, nicht TICs teilen viele der gleichen Funktionen wie normale Stammzellen einschließlich Ruhe, Resistenz gegen Chemotherapie, langfristige Selbsterneuerung und Fähigkeit, sich in verschiedenen Zelllinien 7,8 unterscheiden.
Mehrere Studien belegen die Existenz TICs bei Eierstockkrebs und die derzeitigen Bemühungen sind im Gange, um den Mechanismus (n), mit der diese Zellen unterstützt Tumorgenese 9-11 klären. Mehrere Marker wurden vorgeschlagen, um Eierstock TIC mit verbesserten Tumorigenität einschließlich CD133, ALDH1A1, CD117, CD44 und MyD88 identifizieren, obwohl der genaue Beitrag jeder Marker ist unklar und möglicherweise zelltypspezifische 11-16 sein. Während eine universelle Marker oder ein Satz von Markern wurde nicht eindeutig für Eierstock TIC eingerichtet, verschiedene Gruppen haben ovarian TIC häufiger durch Selektion auf CD44 +, CD133 + und / oder Zellen mit hoher Aldehyddehydrogenase (ALDH) -Aktivität 13,17-21 isoliert. CD44 ist ein Transmembran-Glykoprotein, das als Rezeptor für Hyaluronsäure wirkt und reguliert verschiedene Prozesse wichtig für Tumorprogression, einschließlich Adhäsion, Proliferation, Migration, Angiogenese und Differenzierung 22. CD133 ist ein Trans Glykoprotein, deren Aufgabe es ist noch unklar, aber Studien legen nahe, sie organisiert Plasmamembran-Topologie 23. ALDH, ein intrazelluläres Enzym, das die Oxidation von Aldehyden katalysiert, können die meisten univers seinal Marker TIC hohe Aktivität in Stammzellen, die aus einer Vielzahl von Geweben und mehrere Rollen getrennt haben ALDH unterstützen normale Stammzellen und TIC 24 zurückgeführt identifiziert. Ab sofort CD133 und ALDH1 scheinen die reproduzierbare Markierungen von Eierstock-TICs 13,21 sein.
Zusätzlich zum Verständnis der Merkmale der TIC, gibt es auch einen großen Aufwand, um Medikamente, die speziell auf diese Subpopulation zu identifizieren. Die hohe Rückfallrate mit Eierstockkrebs verbunden kann durch den Ausfall des aktuellen Chemotherapien erfolgreich auszurotten TICs sein. Obwohl der Großteil der Tumor empfänglich ist, um den bestehenden Therapien, werden TIC gedacht beständig und in einer Dichte nachweisbar durch Standardverfahren zu sein. Aufklärung Mechanismen der Therapieresistenz und Tumorrezidiv sind entscheidend für die Reaktion und die allgemeine Überlebensrate von Patienten mit Eierstockkrebs zu verbessern.
Dabei werden Kulturmethoden th beschriebenbei bereichern für TICs von etablierten und primären Eierstockkrebszelllinien. Die hierin beschriebenen Kulturbedingungen wurden von mehreren Gruppen verwendet worden, um die Ausbreitung von Tics oder Sphäroid Zellen mit Stammzelleigenschaften 11,12,14,16,20 induzieren. Obwohl es mehrere Stammzellkultur-Medien und Ergänzungen üblicherweise zur Anreicherung TIC verwendet / Sphäroide verwendeten wir eine serumfreie Medien Formel mit EGF und FGF, jedoch ohne Zusatz von B27 oder N-2 ergänzt. Diese Zusätze, die üblicherweise für die neuronale Zellkultur und Anreicherung von Stammzellen verwendet werden, haben gezeigt, dass eine mesenchymale Phänotyp 25,26 fördern und es verbleibt eine gewisse Unsicherheit im Bereich, ob TIC mit einem mesenchymalen oder epithelialen Phänotyp tumorigener 27-29 . Um Unsicherheiten und Variablen zu minimieren wir entschieden, die häufigste Formel zu verwenden, da es sich um epithelialen Eierstockkrebszellen zu tun haben.
Aufrechterhalten Zellen in serumfreiem Medium in einem Niedrigbefestigungskolbenerleichtert Sphäroid Bildung und unterstützt die Ausbreitung der Zellen mit CD133-Expression und hohe ALDH Aktivität. Unsere Arbeit hat sich weiter gezeigt, dass Zellen unter normalen Schwimm adhärenten Bedingungen können auch eine tumorerzeugende TIC Bevölkerung. Injektion von Zellen unter diesen Bedingungen in athymischen Nacktmäusen gewachsen zu höheren tumorigenes Potential verglichen mit Zellen in entsprechenden Bedingungen in Anwesenheit von Serum gezüchtet. Viel Information über die Rolle des TIC bei Ovarialkarzinom Initiation, Progression, therapeutische Reaktion und Krankheitsrückfall kann durch die Verwendung dieser Techniken gewonnen werden.
Das hier beschriebene Protokoll stellt eine effiziente und konsistente Methode zur Anreicherung von Kulturen für Zellen mit Stammzelleigenschaften von etablierten Ovarialkrebs-Zelllinien und ist an die Primärpatientenproben. Diese Methode erfolgreich bereichert für TIC in einer Vielzahl von Zellinien. Es ermöglicht die rechtzeitige Identifikation von Bedingungen, die für eine TIC und / oder tumorerzeugenden Phänotyp zu bereichern, ohne die Zeit nehmen, körperlich sortieren die TICs aus Nicht-TICs in der Bevölkerung. Auf diese Weise kann eine relative Niveaus verschiedener Signalwege für ihren Beitrag zu dem TIC Phänotyp durch Vergleichen traditionellen adhärenten Kulturen Kulturen mit einer Vielzahl von funktionellen Tests TIC beurteilen. Wenn ein reines TIC Population gewünscht ist, kann Isolierung leicht durch Einbau eines Fluoreszenz-unterstützte oder magnetischen Sortierschritt in der Durchflusszytometrie-Protokoll erreicht werden.
Es ist wichtig zu beachten Sie jedoch, dass der Ausdruck der TIC-Markers wie CD133, CD44 oder ALDH kann unter Zelllinien oder Patientenproben sogar aus dem gleichen Tumor-Typ variieren. Zum Beispiel haben wir festgestellt, dass die OVCAR-5-Zellen haben eine höhere Expression von CD44 in Bezug auf CD133, während der umgekehrte gilt für ACI-23. Insofern ist konkret auf Tumorinitiation bei Mäusen verlassen und Durchflusszytometrie-Analyse als endgültig von TIC Präsenz. Nach diesem Protokoll wurde Hoch ALDH Aktivität konsequent beobachtet, wenn Eierstockkrebszellen wurden in der Stammzellbedingungen angezogen. Interessant ist, dass CD133-Expression in ACI-23-Zellen in der traditionellen TIC Kulturbedingungen gewachsen durchweg höher, während ALDH ist am höchsten in Floater TIC Bedingungen. Im Gegensatz dazu die TGS-3 primären Aszites-Zellen zeigen einen geringen Anstieg der CD133 Positivität unter Floater TIC Bedingungen, aber eine bemerkenswerte Zunahme ALDH Aktivität unter traditionellen Bedingungen TIC. Diese Ergebnisse unterstreichen die Heterogenität der Eierstockkrebszellen und die Plastizität häufig mit TICs verbunden. Zur weiteren Unterstützung der claim, die diese Methoden verbessern TICs wurde die Anreicherung von TRA-1-60-positiven Zellen beobachtet. TRA-1-60 ist eine Pluripotenz Marker und verwendet wurde, um die embryonale Karzinome der Eierstöcke und Hoden identifizieren sowie Prostatakrebs TICS 30-32. Obwohl unsere Methoden sind erfolgreich mit zahlreichen Zelllinien ist es möglich, dass die Standard-TIC Bedingungen möglicherweise besser zu einigen Eierstockkrebszellen geeignet sein, während die modifizierten Schwimmer Bedingungen besser für TIC in anderen Eierstockkrebszellpopulationen anzureichern. Dies unterstreicht erneut die erwartete Heterogenität innerhalb der beiden Patienten stammende und etablierte Eierstockkrebszelllinien.
Zusätzlich zu Zelloberflächenmarker sind mehrere Transkriptionsfaktoren, die gezeigt haben, Ovarialkarzinom TIC einschließlich Nanog Sox2, Oct-4 11 zu charakterisieren, wobei diese Marker sind nicht spezifisch für Ovarialkrebs Tics und eher Faktoren, die für die embryonale Stammzelle Pluripotenz darstellen und difzierung 33,34. Wir untersuchten die Veränderungen in der Protein-Ebene dieser Faktoren und festgestellt, dass Nanog Spiegel erhöhen in TIC Kulturbedingungen im Einvernehmen mit anderen 13,35 sowie CD133, TRA-1-60 und CD117. Ein menschlicher Stammzellmarker cDNA-Array gezeigt weiter eine Erhöhung der CD133, Nanog, Melk und PODXL Gene in den TIC Bedingungen im Vergleich zu herkömmlichen haftenden Bedingungen. Wichtig ist, darauf hinzuweisen, daß, wie mit Zelloberflächenmarkern, Transkriptionsfaktoren mit Eierstock TIC verbunden kann unter Zelllinien und Patientenproben variieren.
Wir haben beobachtet, dass Zellen können tumorigener sein und Express höhere Stammzellmarker, wenn sie von Natur aus nicht haft in vitro (dh, schwimmende Zellen, die nicht leicht zu befestigen, um eine haftende Platte). In Kultur, Zelllinien, wie ACI-23 haben in der Regel viele lebensfähige Schwimmzellen und / oder Zellen, die vertikal in einer Stapel Mode unter traditionellen Kultur condit wachsenIonen. Obwohl erfolgreiche Anreicherung von TICs von schwimmenden Zellen und Aggregate können für relativ wenige Zelllinien sein, einschließlich der in der vorliegenden Studie und OVCAR-3-12, unsere Ergebnisse deuten darauf könnte dies eine tumorigene Bevölkerung. Daher Ernte der "schwebenden" Population von Zellen in Standardgewebekulturplatten und Medien gezüchtet kann als alternative Methode zur TIC Bereicherung für Zellen, die schlecht zu kommerziellen Stammzellmedien anzupassen dienen.
Die Nutzung der verschiedenen Kulturmethoden in dieser Handschrift vorgestellt wird ermöglichen eine schnelle Bereicherung der TIC Bevölkerung und ein besseres Verständnis für welche Faktoren unterstützen diese Phänotyp in verschiedenen Zellen. Gegenwärtige Anwendungen dieser Methode sind kennSignalWege sind entscheidend, um die Ausbreitung dieser einzigartigen Zellpopulation zu unterstützen. Die Ergebnisse dieser Studien werden dazu beitragen, zu klären Mechanismen der Tumorprogression und Rückfall.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
Epidermal Growth Factor – human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning cellgro | 25-056-CI | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Gemini | 100-106 | |
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) | Nalgene | 450-0045 | |
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |