Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.
Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent ‘floater’ cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.
Cancer de l'ovaire est le cancer gynécologique le plus mortel aux États-Unis avec la principale cause de morbidité et de mortalité étant les très récurrentes, les caractéristiques de chimiorésistantes de cette maladie. Le traitement primaire comprend habituellement la chirurgie de réduction tumorale maximale et la thérapie à base de platine ultérieure, bien qu'il y ait des preuves pour suggérer traitement néoadjuvant pourrait être bénéfique dans certains cas une. La majorité des patients répondent favorablement au traitement primaire, mais malheureusement la moitié rechute dans les 18 mois 2.
La plupart des tumeurs malignes de l'ovaire sont des carcinomes épithéliaux et peuvent provenir de l'épithélium de surface du tube 3,4 ovaires ou de Fallope. Plusieurs études confirment l'existence de cellules souches somatiques dans le système reproducteur femelle qui aident probablement dans la réparation des tissus qui est nécessaire après l'ovulation 5,6. L'activité de prolifération élevé à la fois l'ovaire et trompe de Fallope pendant Övülation pourrait être un facteur important dans le développement du cancer de l'ovaire (Gharwan, et al. manuscrit soumis). La dérivation des cellules tumorales de formation ne est pas claire, mais ils peuvent provenir de cellules souches normales, des cellules progénitrices ou des cellules différenciées par des mutations qui les rendent incapables de réguler ou de division sort. Ces cellules ont également été appelés «cellules souches cancéreuses», ou «cellules cancéreuses initiatrices," et peut devenir, sphéroïdes multicellulaires tumorigènes dans des conditions de fixation faibles. Bien que le modèle hiérarchique du développement TIC peut être dynamique, TIC ne partagent bon nombre des mêmes caractéristiques que les cellules souches normales, y compris quiescence, résistance à la chimiothérapie, à long terme d'auto-renouvellement et la capacité de se différencier en diverses lignées cellulaires 7,8.
Plusieurs études confirment l'existence des TIC dans le cancer de l'ovaire et les efforts actuels sont en cours pour clarifier le mécanisme (s) par lequel ces cellules soutiennent la tumorigenèse 9-11. Plusieurs marqueurs ont été proposées pour identifier les TIC de l'ovaire avec tumorigénicité accrue y compris CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, et MyD88, bien que la contribution exacte de chaque marqueur est pas claire et peut être de type spécifique de cellules 11-16. Alors un marqueur ou un ensemble de marqueurs universelle n'a pas été clairement établi pour TIC de l'ovaire, les différents groupes ont isolé TIC de l'ovaire plus communément en sélectionnant avec une grande aldéhyde déshydrogénase (ALDH) 13,17-21 activité pour CD44 +, CD133 + et / ou de cellules. CD44 est une glycoprotéine transmembranaire qui agit comme un récepteur de l'acide hyaluronique et régule divers processus importants pour la progression tumorale, y compris l'adhérence, la prolifération, la migration, l'angiogenèse et la 22 différenciation. CD133 est une glycoprotéine transmembranaire dont la fonction est encore incertain, mais des études suggèrent qu'il organise topologie de la membrane plasmique 23. ALDH, une enzyme intracellulaire qui catalyse l'oxydation d'aldéhydes, peut être le plus universal marqueur des TIC comme une activité élevée a été identifié dans les cellules souches isolées à partir d'une variété de tissus et de multiples rôles ont été attribués à ALDH en soutenant les cellules souches normales et TIC 24. A partir de maintenant, CD133 et ALDH1 semblent être les marqueurs les plus reproductibles de TIC de l'ovaire 13,21.
En plus de comprendre les caractéristiques des TIC, il ya aussi un grand effort pour identifier les médicaments qui ciblent spécifiquement cette sous-population. Le taux de rechute élevé associé à un cancer de l'ovaire peut être dû à l'échec de chimiothérapies actuelles pour éradiquer avec succès TIC. Bien que la majeure partie de la tumeur est sensible aux thérapies existantes, les tics sont pensés pour être résistant et à une densité indétectable par des procédés classiques. Mécanismes élucider de résistance de la thérapie et de rechute de la tumeur sont essentiels pour améliorer la réponse et les taux de survie globale des patients atteints de cancer de l'ovaire.
Ici, les techniques de culture sont décrits eà enrichir en TIC provenant de lignées cellulaires de cancer ovarien établies et primaires. Les conditions de culture décrites ici ont été utilisés par plusieurs groupes pour induire la propagation des tics ou des cellules sphéroïdes ayant des qualités de cellules souches 11,12,14,16,20. Bien qu'il existe plusieurs supports de culture de cellules souches et des suppléments couramment utilisés pour enrichir TIC / sphéroïdes nous avons utilisé une formule de milieu sans sérum avec de l'EGF et le FGF, mais sans l'addition d'B27 ou N-2 complète. Ces suppléments, couramment utilisés pour la culture de cellules neuronales et enrichissante pour les cellules souches, ont été montré pour favoriser un phénotype mésenchymateuses 25,26 et il reste une certaine incertitude dans le domaine de savoir si TIC ayant un phénotype mésenchymateuses ou épithéliales sont plus tumorigène 27-29 . Pour minimiser les incertitudes et les variables nous avons opté pour utiliser la formule la plus courante, puisque nous traitons avec des cellules de cancer ovarien épithélial.
Le maintien des cellules dans un milieu sans sérum dans un flacon de fixation basfacilite la formation sphéroïde et soutient la propagation des cellules avec une expression de CD133 et une forte activité de ALDH. Notre travail a en outre montré que les cellules flottantes dans des conditions normales adhérentes peuvent également représenter une population de TIC plus tumorigène. L'injection de cellules cultivées dans ces conditions sur des souris nude athymiques conduit à potentiel tumorigène élevé par rapport à des cellules cultivées en conditions liées à la présence de sérum. Beaucoup d'informations sur le rôle des TIC dans l'initiation de cancer ovarien, la progression, la réponse thérapeutique, et de rechute de la maladie peut être obtenue par l'utilisation de ces techniques.
Le protocole décrit ici présente une méthode efficace et cohérente pour enrichir les cultures des cellules avec des caractéristiques de cellules souches à partir de lignées cellulaires de cancer ovarien établies et est applicable aux échantillons primaires de patients. Cette méthode avec succès pour enrichit TIC à travers une variété de lignées cellulaires. Il permet d'identifier en temps opportun des conditions qui enrichissent une TIC et / ou phénotype tumorigène, sans prendre le temps de trier physiquement les TIC de non-TIC au sein de la population. De cette manière, les niveaux relatifs des différentes voies de signalisation peuvent être évalués pour leur contribution au phénotype TIC en comparant les cultures adhérentes traditionnelles pour Tic cultures en utilisant une variété de tests fonctionnels. Si une population pure TIC est désiré, l'isolement peut être facilement obtenu en incorporant une étape assistée par fluorescence ou tri magnétique dans la cytométrie de flux de protocole.
Il est important de garder à l'esprit, cependant, que l'expression de marqueur TICs, comme CD133, CD44, ou ALDH, peut varier selon les lignées cellulaires ou des échantillons de patients, même du même type de tumeur. Par exemple, nous avons constaté que les cellules OVCAR-cinq ont une plus forte expression de CD44 par rapport à CD133, alors que l'inverse est vrai pour l'ACI-23. Il est donc pertinent de se appuyer sur l'initiation de la tumeur chez les souris et analyse par cytométrie de flux comme définitive présence de TIC. À la suite de ce protocole, une forte activité de ALDH est constamment observée lorsque les cellules du cancer des ovaires ont été cultivées dans des conditions de cellules souches. Fait intéressant, l'expression CD133 est systématiquement plus élevée dans l'ACI-23 cellules cultivées dans des conditions traditionnelles de culture TIC, alors que ALDH est le plus élevé dans flottaison conditions TIC. En revanche, les cellules TGS-3 ascitiques primaires présentent une légère augmentation de la positivité CD133 flottaison sous conditions TiC, mais une augmentation remarquable de l'activité de ALDH dans des conditions de TIC traditionnelles. Ces résultats mettent en évidence l'hétérogénéité des cellules de cancer ovarien et la plasticité communément associé à tics. Pour soutenir davantage la claim que ces méthodes améliorent TIC, l'enrichissement de la TRA-1-60 cellules positives a également été observée. TRA-1-60 est un marqueur de la pluripotence et a été utilisé pour identifier les carcinomes embryonnaires de l'ovaire et les testicules ainsi que le cancer de la prostate TICS 30-32. Bien que nos méthodes ont été couronnés de succès avec de nombreuses lignées cellulaires, il est possible que les conditions de TIC standards peuvent être mieux adaptées à certaines cellules de cancer de l'ovaire, tandis que les conditions de flottaison modifiés meilleur enrichissement en TIC dans d'autres populations de cellules de cancer de l'ovaire. Cela souligne à nouveau l'hétérogénéité attendue dans les deux lignées cellulaires de cancer ovarien provenant de patients et établis.
En plus des marqueurs de surface cellulaire, il existe plusieurs facteurs de transcription qui ont été montrés pour caractériser tics cancer de l'ovaire, y compris Nanog, Sox2, Oct-4 11, bien que ces marqueurs ne sont pas spécifiques à des tics cancer de l'ovaire et représentent plutôt des facteurs importants pour embryonnaire pluripotence des cellules souches et difdifféren- 33,34. Nous avons examiné les changements dans les niveaux de ces facteurs protéiques et a constaté que les niveaux augmentent Nanog dans des conditions de culture TIC, en accord avec les autres 13,35 ainsi que CD133, TRA-1-60, et CD117. Un marqueur de cellules souches matrice d'ADNc humain en outre montré une augmentation dans les gènes CD133, Nanog, Melk, et dans les conditions PODXL TIC adhérentes par rapport aux conditions traditionnelles. Fait important, il convient de noter que, comme avec des marqueurs de surface cellulaire, des facteurs de transcription associés à CIT ovariens peuvent varier entre les lignées cellulaires et des échantillons de patients.
Nous avons observé que les cellules peuvent être plus tumorigène et expriment des niveaux plus élevés de marqueurs de cellules souches se ils sont par nature non adhérente in vitro (par exemple, les cellules qui ne se fixent pas facilement à une plaque adhérente flottante). En culture, les lignées cellulaires telles que les ACI-23 ont typiquement beaucoup de cellules et / ou flottantes de cellules viables qui croissent verticalement dans un mode d'empilage sous condit de culture traditionnelions. Bien que l'enrichissement réussie des TIC à partir de cellules flottantes et agrégats pourrait être applicables à relativement peu de lignées cellulaires, y compris ceux de la présente étude et OVCAR-3 12, nos résultats suggèrent que cela pourrait représenter une population plus tumorigène. Par conséquent, la récolte de la population "flottante" des cellules cultivées en plaques et les milieux de culture de tissus standards peut servir une autre méthode d'enrichissement TIC, pour les cellules qui se adaptent mal aux médias sur les cellules souches commerciale.
L'utilisation de différentes méthodes de culture présentées dans ce manuscrit permettra l'enrichissement rapide des populations TIC et une meilleure compréhension de ce que les facteurs soutenir ce phénotype dans des cellules différentes. Les applications actuelles de cette méthode comprennent caractérisation des voies de signalisation qui sont essentiels pour soutenir la propagation de cette population unique de cellules. Les résultats de ces études aideront à clarifier les mécanismes de progression de la tumeur et de rechute.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
75 cm2 Ultra – Low Attachment Flask | Corning | 3814 | |
75 cm2 Tissue Culture Flask | Sarstedt | 83.1813.002 | |
Aldefluor Kit | Stemcell Technologies | 1700 | |
CD133-APC | Miltenyi Biotec Inc. | 130-090-826 | |
Fibroblast Growth Factor – Basic human recombinant | Sigma-Aldrich | F0291 | Prepared according to manufacturer's instructions |
Epidermal Growth Factor – human recombinant | Sigma-Aldrich | E9644 | Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS |
DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES) | Gibco | 11330-032 | |
1X Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium) | Corning cellgro | 21-031-CV | |
0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution | Corning cellgro | 25-056-CI | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
Insulin-Transferrin-Selenium | Gibco | 51500-056 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828010 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated) | Gemini | 100-106 | |
Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron) | Nalgene | 450-0045 | |
15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube | Corning | 430052 | |
50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube | Falcon | 352098 | |
Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl | Lonza | 17-942E |