Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.
השילוב של הקלטות מהדק תיקון משני (או יותר) נוירונים בשילוב synaptically (הקלטות לזווג) בהכנות פרוסה מוח חריפות עם מילוי biocytin תאיים בו זמנית מאפשר ניתוח מתואם של התכונות המבניות והתפקודיות שלהם. בשיטה זו אפשר לזהות ולאפיין את שני נוירונים טרום postsynaptic על ידי המורפולוגיה שלהם ודפוס תגובת אלקטרו. הקלטות לזווג מאפשרות ללמוד את דפוסי הקישוריות בין תאי העצב האלה, כמו גם את המאפיינים של שני שידור סינפטי הכימי וחשמלי. הנה, אנחנו נותנים תיאור צעד-אחר-צעד של ההליכים הנדרשים להשגת הקלטות לזווג אמינות יחד עם התאוששות אופטימלית של מורפולוגיה תא העצב. אנו מתארים כיצד זוגות של הנוירונים המחוברים דרך סינפסות כימיות או צמתים פער מזוהים בהכנות פרוסה מוח. אנו מתארים כיצד תאי עצב משוחזרים להשיג מורפולוגיה 3D של dendritic ותחום axonal ואיך הסינפטי קשר מזוהה ומקומי. נדונו גם באזהרות ומגבלות של טכניקת ההקלטה לזווג, בפרט אלה הקשורים לtruncations הדנדריטים וaxonal במהלך תקופת ההכנה של פרוסות המוח כי אלה חזקים משפיעים הערכות קישוריות. עם זאת, בגלל הרבגוניות של גישת ההקלטה לזווג הוא יישאר כלי רב ערך באפיון היבטים שונים של העברת הסינפטית בשבבים עצביים מזוהים במוח.
שבבים עצביים בין שני תאי עצב בשילוב synaptically הם אבני הבניין של רשתות בקנה מידה גדולה במוח והם היחידות הבסיסיות של עיבוד מידע הסינפטי. תנאי מוקדם לאפיון של שבבים עצביים כזו הוא לדעת את המורפולוגיה ותכונות פונקציונליות של שני נוירונים השותף טרום postsynaptic, הסוג של החיבור הסינפטי (ים) ואת המבנה שלה ומנגנון תפקודי. עם זאת, במחקרים רבים של קשרים סינפטיים לפחות אחד מתאי העצב בmicrocircuit אינו מאופיין היטב. זה נובע מפרוטוקולי הגירוי יחסית הנוקבים המשמשים לעתים קרובות במחקרים של קישוריות הסינפטי. לכן, התכונות המבניות ותפקודיות של נוירון presynaptic הם גם לא זיהו כלל או רק במידה קטנה למדי (כלומר, הביטוי של חלבוני סמן וכו '). הקלטות מותאמים בשילוב עם מכתים תאיים על ידי סמנים שלuch כמו biocytin, Neurobiotin או צבעי ניאון מתאים יותר ללימוד שבבים עצביים קטנים. טכניקה זו מאפשרת לחקור פרמטרים רבים מבניים ותפקודיים של חיבור הסינפטי זיהה מורפולוגית באותו הזמן.
מה שנקרא חיבורים 'אחידים' monosynaptic בין שני תאי עצב נחקרו בשני אזורים במוח בקליפת המוח וקורטיקליים 1-10 באמצעות הכנות פרוסה חריפות. בתחילה, microelectrodes החדה שימשה בניסויים אלה; מאוחר יותר, הקלטת מהדק התיקון הועסקה כדי להשיג הקלטות של אותות הסינפטי עם רמת רעש נמוכה ורזולוציה של זמן השתפרה.
מראש טכניים משמעותיים היה השימוש בניגוד להפרעות ההפרש אינפרא אדום (IR-DIC) אופטיקה 11-14, טכניקה מיקרוסקופית ששיפרה באופן משמעותי את הנראות וזיהוי של תאי עצב במוח הפרוסה כך שהוא הפך t האפשריo להשיג הקלטות מקשרים סינפטיים מזוהים מבחינה ויזואלית 15-17. באופן כללי, הקלטות לזווג נעשות בהכנות פרוסה חריפות; רק מעט מאוד פרסומי הקלטות דיווח זמינות מהנוירונים מחוברים synaptically in vivo 18-20.
היתרון החשוב ביותר של הקלטות לזווג הוא העובדה שאפיון פונקציונלי יכול להיות משולב עם ניתוח מורפולוגי בשני האור ורמה מיקרוסקופית אלקטרונים (ראה, למשל., 7,16,21). לאחר עיבוד histochemical, המורפולוגיה הדנדריטים וaxonal של זוג נוירון מחובר synaptically היא לייחס. בהמשך לכך, ניתן לכמת תכונות מורפולוגיות כגון אורך, צפיפות מרחבית, אורינטציה, הסתעפות דפוס וכו 'פרמטרים אלה עשויים לאחר מכן לספק בסיס לסיווג אובייקטיבי של קשר הסינפטי ספציפי. יתר על כן, בניגוד לרוב הטכניקות אחרות המשמשות ללימוד connecti העצביהקלטות vity, לזווג גם לאפשר זיהוי של קשרים סינפטיים לקשרים סינפטיים יחידתי. ניתן לעשות זאת ישירות באמצעות שילוב של אור ומיקרוסקופ אלקטרונים 16,21-27 או באמצעות ההדמיה סידן 28,29 של קוצים הדנדריטים. עם זאת, עם הגישה השנייה רק מעורר אבל ניתן ללמוד לא קשרים מעכבים כפי שהוא דורש זרימת סידן באמצעות ערוצי קולט postsynaptic.
בנוסף לניתוח מפורט של העברת הסינפטית בהקלטות microcircuit לזווג עצביות מוגדרות גם לאפשר המחקר של כללי פלסטיות הסינפטית 30,31 או – בשילוב עם יישום אגוניסט / אנטגוניסט – האפנון של שידור סינפטי על ידי נוירוטרנסמיטרים כגון אצטילכולין 32 ואדנוזין 33.
הקלטות לזווג ממעורר בשילוב synaptically ו / או נוירונים מעכבים הן גישה מאוד תכליתית ללימוד שבבים עצביים. לא רק בגישה זו אינה מאפשרת אחד כדי להעריך קישוריות הסינפטי בין סוגי תאי עצב, אלא גם מאפשרת קביעת המאפיינים הפונקציונליים של החיבור והמורפולוגיה של תאי עצב טרום postsynaptic. ?…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).
Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2-3 preamplifiers |
Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective |
Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers |
Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
Patchmaster | HEKA | ||
Microtome | Microm International | HM650V | |
Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |