Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings
Özet
Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.
Abstract
De combinatie van patch clamp opnamen van twee (of meer) synaptically gekoppeld neuronen (gepaarde opnames) bij acute hersenen slice bereidingen met gelijktijdige intracellulaire biocytine vulling maakt een gecorreleerde analyse van hun structurele en functionele eigenschappen. Met deze methode is het mogelijk om zowel pre- en postsynaptische neuronen identificeren en karakteriseren door hun morfologie en elektrofysiologische respons patroon. Gepaarde opnames toe de connectiviteitspatronen tussen deze neuronen alsook de eigenschappen van zowel chemische en elektrische synaptische transmissie. Hier geven we een stap-voor-stap beschrijving van de vereiste om betrouwbare gepaarde opnames samen te verkrijgen met een optimaal herstel van het neuron morfologie procedures. We zullen beschrijven hoe paren van neuronen die via chemische synapsen of gap junctions zijn geïdentificeerd in de hersenen slice preparaten. We zullen aangeven hoe neuronen worden gereconstrueerd om hun 3D-morfologie van de Dendrit verkrijgenic en axonale domein en hoe synaptische contacten worden geïdentificeerd en gelokaliseerd. We bespreken ook de valkuilen en beperkingen van de gepaarde opnametechniek, met name die in verband met dendritische en axonale afknottingen tijdens de voorbereiding van de hersenen plakjes, omdat deze sterk beïnvloeden connectiviteit schattingen. Vanwege de veelzijdigheid van de gepaarde opname benadering zal een waardevol hulpmiddel bij het karakteriseren van verschillende aspecten van synaptische transmissie bij die neuronale microcircuits in de hersenen blijft.
Introduction
Neuronale microschakelingen tussen twee synaptically gekoppeld neuronen zijn de bouwstenen van grootschalige netwerken in de hersenen en zijn de fundamentele eenheden van synaptische informatieverwerking. Voorwaarde voor het karakteriseren van dergelijke neuronale microcircuits is de morfologie en functionele eigenschappen van zowel de pre- en postsynaptische neuronen partner, het type synaptische verbinding (en) en de structuur en werkingsmechanisme kennen. In veel studies van synaptische verbindingen ten minste één van de neuronen in een microschakeling niet goed gekarakteriseerd. Dit resulteert uit de betrekkelijk onspecifieke stimulatieprotocollen vaak gebruikt in studies van synaptische connectiviteit. Daarom worden de structurele en functionele eigenschappen van het presynaptische neuron ofwel niet geïdentificeerd of slechts een vrij klein gedeelte (bijvoorbeeld, de expressie van merker eiwitten etc.). Gepaarde opnames in combinatie met intracellulaire kleuring door markers sUch als biocytine, neurobiotin of fluorescerende kleurstoffen zijn beter geschikt voor het bestuderen van kleine neuronale microschakelingen. Deze techniek maakt het mogelijk om vele structurele en functionele parameters van een morfologisch geïdentificeerd synaptische verbinding tegelijkertijd te onderzoeken.
Zogenaamde 'unitaire' monosynaptic verbindingen tussen twee neuronen zijn onderzocht in zowel corticale en subcorticale hersengebieden 1-10 behulp van acute slice voorbereiding. Aanvankelijk werden scherpe micro-elektroden gebruikt in deze experimenten; later werd patch clamp toegepast om opname van synaptische signalen te verkrijgen met een lager geluidsniveau en een verbeterde tijdsresolutie.
Een belangrijke technische vooruitgang is het gebruik van infrarode differentiële interferentie contrast (IR-DIC) optiek 11-14, microscopische techniek die aanzienlijk verbeterd de zichtbaarheid en de identificatie van neuronen in de hersenen slice zodat het mogelijk werd to verkrijgen opnames van visueel geïdentificeerde synaptische verbindingen 15-17. In het algemeen gepaard opnamen uitgevoerd bij acute slice preparaten; slechts zeer weinig publicaties zijn verkrijgbaar rapportage opnamen van synaptically verbonden neuronen in vivo 18-20.
Het belangrijkste voordeel van gepaarde opnames is het feit dat een functionele karakterisering kan worden gecombineerd met een morfologische analyse op zowel het licht en elektronen microscopisch niveau (zie bv., 7,16,21). Na histochemische verwerking, wordt de dendritische en axonale morfologie van de synaptically verbonden neuron paar getraceerd. Vervolgens is het mogelijk om morfologische kenmerken zoals lengte, ruimtelijke dichtheid, oriëntatie, vertakking enz kwantificeren Deze parameters kunnen dan een basis voor een objectieve classificatie van een specifiek synaptische verbinding. Bovendien, in tegenstelling tot de meeste andere technieken voor het bestuderen van neuronale verbviteit, gepaarde opnames toestaan ook de identificatie van synaptische contacten voor unitaire synaptische verbindingen. Dit kan direct worden gedaan met behulp van een combinatie van licht en elektronenmicroscopie 16,21-27 of met behulp van calcium beeldvorming 28,29 van dendritische spines. Echter, met deze benadering enige prikkelende maar niet remmende verbindingen kunnen worden bestudeerd als het vereist calcium influx via de postsynaptische receptor kanalen.
Naast een gedetailleerde analyse van synaptische transmissie bij een bepaalde neuronale microcircuit gepaarde opnames ook de studie van synaptische plasticiteit regels 30,31 toestaan of – in combinatie met agonist / antagonist toepassing – de modulatie van synaptische transmissie door neurotransmitters zoals acetylcholine 32 en adenosine 33.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gepaarde opnames van synaptisch gekoppelde prikkelende en / of remmende neuronen een zeer veelzijdige benadering voor de studie van neuronale microschakelingen. Niet alleen heeft deze benadering mogelijk maken om schatten synaptische verbindingen tussen soorten neuronen, maar maakt ook de bepaling van de functionele eigenschappen van de verbinding en de morfologie van pre- en postsynaptische neuronen. Bovendien kunnen agonist en / of antagonist eenvoudig worden toegepast op neuronen in slice preparaat. Hierdoor kan men …
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank all members of ‘Function of Neuronal Microcircuits’ Group at Institute of Neuroscience and Medicine, INM-2, Research Centre Jülich and the ‘Function of Cortical Microcircuits’ Group in the Dept. of Psychiatry, Psychotherapy and Psychosomatics, Medical School, JARA, RWTH Aachen University for fruitful discussions. This work was supported by the DFG research group on Barrel Cortex Function (BaCoFun).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Yorumlar |
| Amplifier | HEKA | EPC 10 USB Triple | with 2-3 preamplifiers |
| Microscope | Olympus | BX51WI | with 2 camera ports and a 4× objective, a 40× water-immersion objective |
| Camera | TILL Photonics | VX55 | infrared CCD camera |
| Workstation | Luigs & Neumann | Infrapatch 240 | with a motorized x-y stage and a motorized focus axis for the microscope |
| Micromanipulator | Luigs & Neumann | SM-5 | x-y-z manipulators for 2-3 preamplifiers |
| Faraday cage | Luigs & Neumann | ||
| Anti-vibration table | Newport Spectra-Physics | ||
| Patchmaster | HEKA | ||
| Microtome | Microm International | HM650V | |
| Micropipette puller | HEKA | Sutter P-97 | |
| Neurolucida system | Microbrightfield | with Neurolucida and Neuroexplorer softwares |
Referanslar
- Hughes, G. M., Tauc, L. A direct synaptic connexion between the left and right giant cells in Aplysia. J Physiol. 197 (3), 511-527 (1968).
- Korn, H., Triller, A., Mallet, A., Faber, D. S. Fluctuating responses at a central synapse: n of binomial fit predicts number of stained presynaptic boutons. Science. 213 (4510), 898-901 (1981).
- Miles, R. Synaptic excitation of inhibitory cells by single CA3 hippocampal pyramidal cells of the guinea-pig in vitro. J Physiol. 428 (1), 61-77 (1990).
- Malinow, R. Transmission between pairs of hippocampal slice neurons: quantal levels, oscillations and LTP. Science. 252 (5006), 722-724 (1991).
- Mason, A., Nicoll, A., Stratford, K. Synaptic transmission between individual pyramidal neurons of the rat visual cortex in vitro. J Neurosci. 11 (1), 72-84 (1991).
- Thomson, A. M., West, D. C. Fluctuations in pyramid-pyramid excitatory postsynaptic potentials modified by presynaptic firing pattern and postsynaptic membrane potential using paired intracellular recordings in rat neocortex. Nörobilim. 54 (2), 329-346 (1993).
- Buhl, E. H., Halasy, K., Somogyi, P. Diverse sources of hippocampal unitary inhibitory postsynaptic potentials and the number of synaptic release sites. Nature. 368 (6474), 823-828 (1994).
- Bolshakov, V. Y., Siegelbaum, S. A. Regulation of hippocampal transmitter release during development and long-term potentiation. Science. 269 (5231), 1730-1734 (1995).
- Debanne, D., Guerineau, N. C., Gahwiler, B. H., Thompson, S. M. Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures. J Neurophysiol. 73 (3), 1282-1294 (1995).
- Miles, R., Toth, K., Gulyas, A. I., Hajos, N., Freund, T. F. Differences between somatic and dendritic inhibition in the hippocampus. Neuron. 16 (4), 815-823 (1996).
- MacVicar, B. A. Infrared video microscopy to visualize neurons in the in vitro brain slice preparation. J Neurosci Methods. 12 (2), 133-139 (1984).
- Dodt, H. U., Zieglgansberger, W. Visualizing unstained neurons in living brain slices by infrared DIC-videomicroscopy. Brain Res. 537 (1-2), 333-336 (1990).
- Stuart, G. J., Dodt, H. U., Sakmann, B. Patch-clamp recordings from the soma and dendrites of neurons in brain slices using infrared video microscopy. Pflugers Arch. 423 (5-6), 511-518 (1993).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled cortical and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat Protoc. 3 (10), 1559-1568 (2008).
- Gulyas, A. I., et al. Hippocampal pyramidal cells excite inhibitory neurons through a single release site. Nature. 366 (6456), 683-687 (1993).
- Silver, R. A., Lubke, J., Sakmann, B., Feldmeyer, D. High-probability uniquantal transmission at excitatory synapses in barrel cortex. Science. 302 (5652), 1981-1984 (2003).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Quantal size is independent of the release probability at hippocampal excitatory synapses. J Neurosci. 25 (1), 223-232 (2005).
- Crochet, S., Chauvette, S., Boucetta, S., Timofeev, I. Modulation of synaptic transmission in neocortex by network activities. Eur J Neurosci. 21 (4), 1030-1044 (2005).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Constantinople, C. M., Bruno, R. M. Deep cortical layers are activated directly by thalamus. Science. 340 (6140), 1591-1594 (2013).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Roth, A., Sakmann, B. Physiology and anatomy of synaptic connections between thick tufted pyramidal neurones in the developing rat neocortex. J Physiol. 500 (Pt 2), 409-440 (1997).
- Gray, E. G. Axo-somatic and axo-dendritic synapses of the cerebral cortex: an electron microscope study). J Anat. 93 (Pt 4), 420-433 (1959).
- Uchizono, K. Characteristics of excitatory and inhibitory synapses in the central nervous system of the cat). Nature. 207 (997), 642-643 (1965).
- Tamas, G., Buhl, E. H., Lorincz, A., Somogyi, P. Proximally targeted GABAergic synapses and gap junctions synchronize cortical interneurons. Nat Neurosci. 3 (4), 366-371 (2000).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Silver, R. A., Sakmann, B. Synaptic connections between layer 4 spiny neurone-layer 2/3 pyramidal cell pairs in juvenile rat barrel cortex: physiology and anatomy of interlaminar signalling within a cortical column. J Physiol. 538 (Pt 3), 803-822 (2002).
- Feldmeyer, D., Lubke, J., Sakmann, B. Efficacy and connectivity of intracolumnar pairs of layer 2/3 pyramidal cells in the barrel cortex of juvenile rats). J Physiol. 575 (Pt 2), 583-602 (2006).
- Helmstaedter, M., Staiger, J. F., Sakmann, B., Feldmeyer, D. Efficient recruitment of layer 2/3 interneurons by layer 4 input in single columns of rat somatosensory cortex). J Neurosci. 28 (33), 8273-8284 (2008).
- Oertner, T. G., Sabatini, B. L., Nimchinsky, E. A., Svoboda, K. Facilitation at single synapses probed with optical quantal analysis. Nat Neurosci. 5 (7), 657-664 (2002).
- Koester, H. J., Johnston, D. Target cell-dependent normalization of transmitter release at neocortical synapses. Science. 308 (5723), 863-866 (2005).
- Markram, H., Lubke, J., Frotscher, M., Sakmann, B. Regulation of synaptic efficacy by coincidence of postsynaptic APs and EPSPs. Science. 275 (5297), 213-215 (1997).
- Egger, V., Feldmeyer, D., Sakmann, B. Coincidence detection and changes of synaptic efficacy in spiny stellate neurons in rat barrel cortex. Nat Neurosci. 2 (12), 1098-1105 (1999).
- Eggermann, E., Feldmeyer, D. Cholinergic filtering in the recurrent excitatory microcircuit of cortical layer 4. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (28), 11753-11758 (2009).
- Feldmeyer, D., van Aerde, K. I., Qi, G. . Society for Neuroscience. , 335.313 (2012).
- Radnikow, G., Gunter, R. H., Marx, M., Feldmeyer, D., Fellin, T., Halassa, M. . Neuronal Network Analysis : Concepts and Experimental Approaches. 67, 405-431 (2012).
- Feldmeyer, D., Egger, V., Lubke, J., Sakmann, B. Reliable synaptic connections between pairs of excitatory layer 4 neurones within a single ‘barrel’ of developing rat somatosensory cortex. J Physiol. 521 (Pt 1), 169-190 (1999).
- Koelbl, C., Helmstaedter, M., Lubke, J., Feldmeyer, D. A Barrel-Related Interneuron in Layer 4 of Rat Somatosensory Cortex with a High Intrabarrel Connectivity). Cereb Cortex. , (2013).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Biro, A. A., Holderith, N. B., Nusser, Z. Release probability-dependent scaling of the postsynaptic responses at single hippocampal GABAergic synapses. J Neurosci. 26 (48), 12487-12496 (2006).
- Huang, C. H., Bao, J., Sakaba, T. Multivesicular release differentiates the reliability of synaptic transmission between the visual cortex and the somatosensory cortex. J Neurosci. 30 (36), 11994-12004 (2010).
- Helmstaedter, M., et al. Connectomic reconstruction of the inner plexiform layer in the mouse retina. Nature. 500 (7461), 168-174 (2013).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Laminar sources of synaptic input to cortical inhibitory interneurons and pyramidal neurons. Nat Neurosci. 3 (7), 701-707 (2000).
- Schubert, D., et al. Layer-specific intracolumnar and transcolumnar functional connectivity of layer V pyramidal cells in rat barrel cortex. J Neurosci. 21 (10), 3580-3592 (2001).
- Schubert, D., Kotter, R., Zilles, K., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Cell type-specific circuits of cortical layer IV spiny neurons. J Neurosci. 23 (7), 2961-2970 (2003).
- Schubert, D., Kotter, R., Luhmann, H. J., Staiger, J. F. Morphology, electrophysiology and functional input connectivity of pyramidal neurons characterizes a genuine layer va in the primary somatosensory cortex. Cereb Cortex. 16 (2), 223-236 (2006).
- Yoshimura, Y., Dantzker, J. L., Callaway, E. M. Excitatory cortical neurons form fine-scale functional networks. Nature. 433 (7028), 868-873 (2005).
- Yoshimura, Y., Callaway, E. M. Fine-scale specificity of cortical networks depends on inhibitory cell type and connectivity. Nat Neurosci. 8 (11), 1552-1559 (2005).
- Shepherd, G. M., Svoboda, K. Laminar and columnar organization of ascending excitatory projections to layer 2/3 pyramidal neurons in rat barrel cortex. J Neurosci. 25 (24), 5670-5679 (2005).
- Bureau, I., von Saint Paul, F., Svoboda, K. Interdigitated paralemniscal and lemniscal pathways in the mouse barrel cortex. PLoS Biol. 4 (12), e382 (2006).
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nat Neurosci. 10 (5), 663-668 (2007).
- Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. The subcellular organization of neocortical excitatory connections. Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).
- Adesnik, H., Scanziani, M. Lateral competition for cortical space by layer-specific horizontal circuits. Nature. 464 (7292), 1155-1160 (2010).
- Molnar, Z., Cheung, A. F. Towards the classification of subpopulations of layer V pyramidal projection neurons. Neurosci Res. 55 (2), 105-115 (2006).
- Doyle, J. P., et al. Application of a translational profiling approach for the comparative analysis of CNS cell types. Cell. 135 (4), 749-762 (2008).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Intracortical circuits of pyramidal neurons reflect their long-range axonal targets. Nature. 457 (7233), 1133-1136 (2009).
- Groh, A., et al. Cell-type specific properties of pyramidal neurons in neocortex underlying a layout that is modifiable depending on the cortical area. Cereb Cortex. 20 (4), 826-836 (2010).
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr Opin Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
