אנו מתארים פרוטוקול לבחון את התפתחותם של hyperalgesia מושרה אופיואידים וסובלנות בעכברים. המבוסס על המדידה של תגובות nociceptive תרמיים ומכאניות של בעלי חיים תמימים וטופל במורפיום, היא מאפשרת לכמת את העלייה ברגישות לכאב (hyperalgesia) ולהפחית בכאבים (סובלנות) הקשורים לממשל אופיום כרוני.
hyperalgesia מושרה אופיואידים וסובלנות להשפיע קשות את היעילות הקלינית של אופיאטים כמשככי כאבים בבעלי חיים ובבני אדם. המנגנונים המולקולריים שבבסיס שני התופעות אינם מובנים היטב וההבהרה שלהם צריכה להפיק תועלת מהמחקר של מודלים של בעלי חיים ומהעיצוב של פרוטוקולי ניסוי מתאימים.
אנו מתארים כאן גישה מתודולוגית לגרימה, הקלטה וכימות hyperalgesia-Induced מורפין, כמו גם עבור המעיד על סובלנות משכך כאבים, תוך שימוש בבדיקות לחץ זנב הטבילה והזנב בwild-type עכברים. כפי שניתן לראות בווידאו, הפרוטוקול מחולק לחמישה שלבים עוקבים. שלבי טיפול והתרגלות לאפשר קביעה בטוחה של תגובת nociceptive הבסיסית של בעלי החיים. ממשל מורפיום כרוני גורם hyperalgesia המשמעותי כפי שמוצג על ידי גידול בשניהם רגישות התרמית ומכנית, ואילו ההשוואה של זמן קורסי שיכוך כאבים לאחר אקוטי או נציגטיפול מורפיום eated מצביע בבירור על ההתפתחות של הסובלנות באה לידי ביטוי בירידה במשרעת תגובת כאבים. פרוטוקול זה יכול להיות מותאם באופן דומה לעכברים מהונדסים גנטי כדי להעריך את תפקידם של גנים בודדים באפנון של nociception ושיכוך כאבים מורפין. הוא גם מספק מערכת מודל לחקור את האפקטיביות של סוכנים טיפוליים פוטנציאליים כדי לשפר את יעילות שיכוך כאבים נרקוטיים.
hyperalgesia מושרה אופיואידים (OIH) וסובלנות משכך כאבים מגבילים את היעילות הקלינית של אופיאטים בבעלי חיים ובבני האדם 1-3. מעורבותם של 4,5 הפרו דלקתי או של (אנטי אופיואידים) 6,7 מערכות התומכות nociceptive כיום נחקרת השערות. הבהרה של המנגנונים OIH וסובלנות מחייבת שילוב של in vivo ו בגישות חוץ גופית, תוך שימוש במודלים מתאימים של בעלי חיים, פרוטוקולי ניסוי וכלים מולקולריים.
פרמקולוגיה התנהגות היא הפרדיגמה הדומיננטית כדי לפקח ולכמת מדינות משכך כאבים וhyperalgesic בחיות מעבדה (חולדות, עכברים). היישום של גירוי מזיק (כימי תרמי, מכאני או) לחלק נוח גוף (hindpaw, זנב) של בעלי החיים מוביל לנסיגת nocifensive שיכול להיות הבקיע בקלות.
אנו מציעים כאן גישה מתודולוגית לגרימה, הקלטה וכימות OIH וסובלנות בwild-type עכברים, תוך שימוש בבדיקות לחץ זנב הטבילה וזנב. ההליך מאפשר קביעה קלה, רגישה ושחזור של ערכי תגובת nociceptive תרמיים ומכאניים בעכברים. כפי שמודגם בפרוטוקול וידאו, עכברי C57BL / 6 לחוות hyperalgesia המשמעותי הבאים ממשל מורפיום כרוני ולשמור על זה במשך כמה ימים. שני ערכי nociceptive התרמיים ומכאניים מופחתים באופן משמעותי, בהשוואה למדידות בסיס על בעלי חיים תמימים. יתר על כן, ניסיוני ההגדרה שלנו מאפשרת לעקוב, בנוסף לפיתוח של OIH, הירידה של תגובת כאבים למורפיום (סובלנות). הנתונים שהוצגו תומכים בדעה שhyperalgesia וסובלנות עשוי להיות כרוכה במנגנונים תאיים ומולקולריים נפוצים 8,9, למרות שזה שנוי במחלוקת בספרות 1,10-12. לבסוף, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם באופן דומה לעכברים מהונדסים גנטי כדי להעריך את תפקידם של גנים בודדים בModulation של כאב. הוא גם מספק מערכת מודל כדי להעריך את האפקטיביות של סוכנים טיפוליים פוטנציאליים כדי לשפר את ההשפעות משכך כאבים נרקוטיים.
שלבים קריטיים
בחירה של מודל החיה למדידות nociception
השתנות ברגישות nociceptive ושיכוך כאבים בקרב זני עכברים נבדקה (14-16 ביקורות) ביקורות תוך שימוש במודלים שונים לכאב שונה באטיולוגיה שלהם (nociceptive, דלקתי, נוירופתי), אפנות (תרמי, כימי, מכאני), המשך (חריף, טוניק, כרוני) ואתר של ממשל (עורית, תת עורי, בטן). בהשוואה לזנים אחרים, C57BL/6J ("J" למעבדת ג'קסון) עכברים הפך למודל חיה פופולרי ללימודי כאב כפי שהם מפגינים רגישות גבוהה הבזליים nociceptive 17,18 ותגובת כאבים בינוני עד אופיאטים 14,19. בעקבות טיפול מורפיום כרוני, הם גם לפתח סובלנות משמעותית משכך כאבים 20,21, hyperalgesia 21,22 ותלות 20,23.
NT "> הנה, ניסויים בוצעו על עכברי C57BL/6N טק (" N "למכון לאומי לבריאות ו" טק 'עבור חוות Taconics) השייכים לסניף נפרד של שושלת B6. למרות שעכברי C57BL / 6 כבר זמן רב נחשב כלימודים להחלפה, אחרונים הצביעו על הבדלים משמעותיים בין התנהגותי C57BL/6J וC57BL/6N זני 24. בפרט, הרגישות נמוכה יותר של substrains שלוש C57BL/6N (כולל טק אחד) לאקוטיים כאב תרמית עשויה להיחשב יתרון לבדיקת פנוטיפ זה.עכברי זכרים נבחרו כרוב המכריע של מחקרי כאב, תוך שימוש בעכברים כמודל חיה, מבוצעים בגברים לנוער 25. בידיים שלנו, הם סיפקו נתונים חזקים ושחזור כאשר נבחנו מנקודות שיכוך כאבים או hyperalgesia מבט. מדי פעם, שם לב לנטייה נקבות C57BL/6N לספק יותר תגובות משתנים, שניהם במידה כנגד המידה ובדיקות TPT. אם כי ייתכן שתצפית זומשקפים הבדלים טבעיים צמודים למצב הורמונלי של נקבות, מנגנונים הכלליים שבבסיס הבדלים בין מינים בכאב ושיכוך כאבים עדיין נשארים שנויה במחלוקת. היבטים מסוימים של הוויכוח הלוהט הזה יוצגו בקצרה ב'המגבלות של הטכניקה 'הבאות הסעיף.
התרגלות בעלי חיים
עכברים הורשו ראשון כדי להתרגל למתקן בעלי החיים במהלך שבוע אחד. בדומה לכל מחקר התנהגותיות אחר, בדיקה בוצעה לאחר תקופה של 3 ימי התאקלמות (איור 1, צעד). כמו בדיקות nociceptive רגישות ללחץ, צעדים הראשונים עשויים לתת שיהוי ארוך יותר מאלה הבאים, במיוחד בעכברים שאינם מורגלים 26,27. צעד ההתרגלות מאפשר גם obtention של ערכי תגובת nociceptive יציבים יותר באותו היום ובין ימי איורים 2 ו 4. כדי להפחית את ההשפעות ביולוגי על nociceptive ומשכך כאביםרגישות 28,29, כל הבדיקות של התנהלו 10:00-04:00.
מבחר של בדיקות nociceptive
בדיקות nociceptive להשתמש גם תרמי, מכאני, כימית או גירויים חשמליים (ביקורת 26,27,30. הבחירה שלהם היא קריטית כמו עשויות להיות מעובד שיטות nociceptive שונים באמצעות nociceptors וסיבים 18,31,32 שונים.
אנחנו בחרנו את מבחן טבילת זנב (מידה כנגד מידה) 33, גרסה שונה של המבחן קפיצי זנב הקלאסי שפותח על ידי amour ד 'וסמית 34, ובדיקת לחץ זנב (TPT), מותאם מרנדל ו35 Selitto, כדוגמאות לתרמית ו שיטות מכאניות ללמוד שיכוך כאבים הנגרם מורפיום, hyperalgesia וסובלנות בעכברים. שני הבדיקות היו בשימוש נרחב בחולדות. זמן מנותק הוגדר באופן שיטתי, כדי למנוע או להגביל את הסיכון לניזק לרקמות.
מורפין-inducשיכוך כאבים ed, hyperalgesia וסובלנות
מורפיום, אגוניסט mu-אופיום הטיפוסי, נבחר כאן כפי שהוא משככת כאבים חזקים וOIH-משדל, הן בבני אדם ועכברים 1,2,36. עוצמת משכך כאבים מורפין ידועה להשתנות עם זני עכברים, מסלולים של ממשל ושיטות nociceptive. בעכברי C57BL / 6, שיכוך כאבים אמינים מתקבלים בדרך כלל לאחר זריקות תת עורית של מורפיום בטווח 1-20 מינון מ"ג / קילוגרם 14,21. בהתאם לכך, בחרנו ללמוד שיכוך כאבים אקוטיים הבאים ממשל יחיד (SC) של מורפיום ב5 מ"ג / קילוגרם, קרוב לערכו ED 50 (7-20 מ"ג / קילוגרם) העריך מnociception תרמית 19,21.
ממשל מורפיום חוזר ונשנה לעתים קרובות מלווה בסובלנות משכך כאבים (שמעידה או מתזוזה ימינה של עקומת מנת התגובה או מירידה במשרעת תגובת כאבים או משך זמן) וhyperalgesia (רגישות החריפה לStimul הכואבאני מעיד מירידה בערך nociceptive הבסיסי). שני תופעות הלוואי תלויות בזנים של מכרסמים, באופי של מתחם האופיום שנבחר ואת המינון שלה, על משך טיפול ועל שיטות nociceptive 21. לדוגמא, פרדיגמות ניסוי ללמוד סובלנות וhyperalgesia מורכבות בניהול היומיומי של גבוה וקבוע (20-40 מ"ג / קילוגרם ליום) או 22 של הסלמה (עד 50 או אפילו 200 מ"ג / קילוגרם) 20,21 מנות מורפיום. בהתאם לכך, אנו מקדמים את הפיתוח של hyperalgesia וסובלנות בC57BL / 6 עכברים באמצעות ממשל מורפיום יומי (5 מ"ג / קילוגרם; sc) על פני תקופה בת 8 ימים. מינון מורפיום מתון זו היה עדיף על פני אלה גבוהים יותר לשימוש במרפאה לחקות טובה יותר.
הגדרה של חלון מבצעי TIT
מכשול אפשרי במידה כנגד המידה עשוי להיות קשור לתפקידו של הזנב בויסות החום של מכרסמים 26,37. כטמפרטורת סביבה היא גורם מפתח בnociceptive וריאציות תגובה, זה חייב להישמר קבוע (כאן ב21 מעלות צלזיוס) לאורך כל ניסויים 38. עוצמת חום מוגדרת בדרך כלל כדי לזהות תגובת nociceptive בתוך 5 עד 10 שניות 27. אכן, שיהוי גדול יותר עלול להגביר את הסיכון לניטור תנועות של בעלי חיים שאינן קשורות לגירוי nociceptive, ואילו קצרים יותר עשוי להפחית את כוח ההפרש של הבדיקה. ביצענו מדידות TIT בטמפרטורה קבועה של 48 ° C. שיהוי נסיגת זנב היה קרוב ל -9 שניות (ערך nociceptive הבזליים) ומגוון מ 4 שניות (hyperalgesia) ל25 שניות (שיכוך כאבים מרביים; מנותק). בנוסף לסיבות מעשיות, מדידות של ערכי תגובת nociceptive בטמפרטורה קבועה עשויים פריורי לערב את אותו הרפרטואר של nociceptors ומעגלים, ובכך מסייע לפרשנות הנתונים.
שינויים אפשריים
אופטימיזציה של החלון המבצעי המידה כנגד measureme שיכוך כאבים וOIHNTS
כאשר מתמקדים בתגובת כאבים, ערכים נמוכים בסיסיים (עוצמת חום גבוהה יותר) עשויים להעדיף את זיהוי של עיכוב בתגובה. בתורו, כדי לטפל בתוצאה של גירוי מכאיב או הפיתוח של OIH, ערכים גבוהים יותר בסיסיים (עוצמת חום נמוכה יותר; כאן 48 ° C) עשוי להקל על זיהוי של תגובות מהירות יותר איור 4.
למרות שמצאנו מורפין ב5 מ"ג / ק"ג מינון נוח כדי לגרום לאיור תגובת כאבים חזק 3 ועל מנת לקדם (על ממשל חוזר ונשנה) איור hyperalgesia משמעותי 4, המינון שלה עשוי להיות מותאם כפי שהוזכר קודם (שלב קריטי: שיכוך כאבים הנגרמים מורפיום, hyperalgesia וסובלנות). לדוגמא, ניתן להשתמש במינונים נמוכים יותר כדי להפחית את המשרעת שיכוך כאבים (ובכך להימנע מגבלות חתך) ואילו עשויים להיבחר במינונים גבוהים יותר כדי להאיץ את התפרצות hyperalgesia ולהגדיל את המשרעת שלה.
אובהRall, אופטימיזציה של 'חלון nociceptive' צריך להיות מותאם לרקע הגנטי של עכברים תחת מחקר ולקחת בחשבון את האפשרות למעורבותם של מערכים שונים של nociceptors ומעגלים.
אגוניסטים אופיום אלטרנטיביים (פנטניל, remifentanyl)
למרות אופיאטים ביותר בשימוש קליני למקד את הקולטן mu-אופיואידים כאגוניסטים, הם שונים במידה ניכרת ביחס לתכונות פרמקולוגיות שלהם הן במבחנה in vivo. לדוגמא, remifentanyl ופנטניל, בניגוד בולט עם מורפיום, להתנהג אגוניסטים מלאים וכלקדם הפנמה של קולטני mu-אופיואידים 39. יש משככי כאבים נרקוטיים כמו מורפין ופנטניל מחצית חיים בטווח של שעות 40, בעוד remifentanyl יש זמן מחצית חיים אולטרה קצר של כמה דקות 41. בבני אדם, העדות הטובה ביותר לOIH היא מחולים שקיבלו אופיאטים במהלך ניתוח, כולל קצר משחק גompounds כגון remifentanyl 2,42. לפיכך, פנטניל וremifentanyl עשוי להיות כלי בעל ערך גם ללמוד פיתוח hyperalgesia והסובלנות בעכברים, תחת TIT ופרדיגמות TPT.
מצבים אלטרנטיביים של גיוס של OIH (כרוני לעומת ממשל חריף)
OIH הוא ראה בבני אדם ומודלים של בעלי החיים כתוצאה מממשל אופיום, בין אם במינונים נמוכים מאוד או גבוהים מאוד 1,2. אנו מדווחים כאן על פיתוח OIH לאחר טיפול כרוני בעכברים עם מינונים מתונים של מורפיום. כמה ימים של טיפול בעכברי C57BL/6N היו צורך ראיות איור מדינת hyperalgesic ברור ולשעתק 4 זריקות מורפיום יומיים יכולה להיות מוחלפות במידה מספקת עם כדורי מורפיום מושתלים:. על הסרתם, שניהם hyperalgesia התרמי ומכאנית אלודיניה כבר כבר דיווחו בעכברים 43. עירוי של אופיאטים באמצעות משאבת מייקר האוסמוטי אפשרות נוספת 44. במכרסמים, hyperalgesia לטווח ארוך הוא גם בר השגה בעקבות ממשל חריף של פנטניל באמצעות פרוטוקול מחקה את השימוש באגוניסט mu-אופיואידים זה בניתוח אנושי 36,45,46.
מגבלות של הטכניקה
מיני בעלי חיים ומודלים לכאב
מחקרים השוואתיים של זני עכבר רבים סיפקו ראיות לוריאציות רבות בתגובות nociceptive לגירויים מכאיבים 17,31,47 וברמות OIH לאחר טיפול מורפיום 4 ימים-22. אם מנגנוני עיבוד כאב ואפנון במודלים של בעלי חיים (עכברים וחולדות) רלוונטיים לחולי כאב כרוניים נותר שאלה בסיסית ונפתחה. לכן, הרבה זהירות צריכה להיות משולמת על הפרשנות של נתונים בבעלי חיים ולתוקף הניבוי שלהם לבני אדם 16.
הבדלים בין מינים בכאב ושיכוך כאבים
ntent "> רוב המחקרים פרה במודלים של בעלי חיים לכאב שנערכו על מכרסמים זכר 16,25,48. למרות הטיית בחירה זו, התצוגה המתעוררות הייתה לשקול גברים כמגיבים טובים יותר למשככי כאבים נרקוטיים 49,50, נוטה פחות לפתח אופיואידים מושרה hyperalgesia 51,52 וסובלני יותר לשיכוך כאבים מורפין 53 מאשר עמיתיהם הנשיים (ביקורת 54). עם זאת, הבדלים בין מינים בכל קשור לnociception ויעילות משככי כאבים לא יתחדשו בכזה "מידה אחת מתאים לכולם 'פרדיגמה. אכן, שפע של נתונים כעת עולה כי משתנים רבים עשויים להשפיע על הגודל והכיוון של הבדלים בין מינים, כגון יעילות אופיואידים סמים וסלקטיביות, assay nociceptive, רקע גנטי, גיל, מצב gonado-הורמונליים או אינטראקציה חברתית 48,54. בבני אדם כאב, קליני הוא נפוץ יותר בנשים, אך אם עובדה זו משקפת הבדלי מין בפועל נשאר עניין של 48,55,56 דיון. For דוגמא, ניתוח הגלובלי של חמישים ניסויים קליניים לא הצביע על הבדלים משמעותיים במאפייני כאבים בין מינים ואילו meta-מנתח ביצע בנושאים-חולים מבוקרים הצביע על יעילות אופיואידים באופן משמעותי יותר בנשים 57. התצפית האחרונה, שבו במידה ניכרת בניגוד למה שהיה מצא במכרסמים, שוב מעלה כמה שאלות בנוגע למקור ל16,48,55,57 סטיות כאלה. בסך הכל, הבדלים בין מינים בשיכוך כאבים אכן קיימים וראויים להתמקד עוד יותר על מנגנונים הבסיסיים והשלכות קליניות.אודות בדיקות nociceptive
מבחן נסיגת הזנב הוא רפלקס השדרה אבל זה עשוי להיות נתונות להשפעות supraspinal 58. מידה כנגד המידה היא קלה יחסית לביצוע על חולדות, אך דורשת יותר מומחיות בעכברים. קושי אפשרי הוא לשמור על העכבר ביציבה נכונה ללא גרימת לחץ לא רצוי. הפרוטוקול המוצע עשוי להיות מותאם על פיגודל מדגם. 16 בעלי חיים (שטופלו 8 שליטה ו8) הם הצליחו בקלות עד כמה שמדידה של ערכיהם הבסיסיים nociceptive תגובה (באמצעות TIT הראשון, ולאחר מכן TPT לסדרה השלם של עכברים) הוא מתחת לדאגה. ניטור קורסי זמן שיכוך כאבים דורש את הקמתה של לוח זמנים מדויק והערכה של המספר המקסימאלי של בעלי חיים שעשויים להיבדק (מידה כנגד המידה ראשונה, ולאחר מכן TPT) בתוך מרווח הזמן לחלוק ב( כאן 30 דקות). הקבוצה של בעלי חיים כל כך עשויה להיות מחולקת לקבוצות כדי לאפשר הנסיין לכבד מגבלות קינטית.
משמעות של הטכניקה ביחס לשיטות קיימות / אלטרנטיביים
OIH בחולדות לעומת עכבר
חולדות היו בשימוש נרחב כדי ללמוד שיכוך כאבים אופיואידים, hyperalgesia וסובלנות, בעקבות ממשל אופיום אקוטי או כרוני 46,59-61. ואכן, מכמה סיבות מעשיות, הם עשויים להיחשב עדיפים עלעכברים כמודל חיה לניסויי כאב 16,61. עם זאת, עד לאחרונה, הדור של חולדות מהונדסים גנטי לא היה הליך פשוט. כמו זני עכבר מהונדסים גנטי רבים כבר זמינים, המודל שלנו מציע את ההזדמנות כדי ללמוד את התרומה של גנים בודדים רבים בOIH ופיתוח סובלנות בעכברים.
מידה כנגד מידה וTPT לעומת בדיקות nociceptive אחרות
מידה כנגד המידה הינה נגזרת של המבחן קפיצי זנב, להיות באזור של גירוי ההבדל הברור ביותר. בניגוד לקרינת חום, טבילה של הזנב למים חמים גורמת לעלייה מהירה ואחידה בטמפרטורה שלו. בהשוואה לצורות אחרות של בדיקות תרמית nociception (בדיקות פלטה חמה או הארגריבס), מידה כנגד מספקת תוצאות די לשעתק גם על פני ובתוך נושאים.
TPT הוא מבחן מאוד פופולרי ללימוד nociception המכני 26,27,35 שכנראה כרוךסיבי nociceptive מובחנים ומתמר מולקולריים אז TIT 32. הוא מספק מדידות מהירות ואמינות 59 אבל דורש מומחיות כלשהי מהניסוי וקבוצות בעלי חיים גדולים. כחלופה לanalgesimeter השתמש במחקר הנוכחי, הליכים אחרים או מכשירים להסתמך על מודד מתח קיימת (ביקורת 27). TPT הוא מתאים ביותר ללימוד hyperalgesia המכני ואילו חוטי פון פריי נלקחים בדרך כלל כדי להעריך אלודיניה מכאנית (ביקורת 27).
יישומים או כיוונים לעתיד לאחר השליטה בטכניקה זו
מודל OIH / הסובלנות הניסיונית אנו מציגים כאן עשוי להיות מותאם באופן דומה לעכברים מהונדסים גנטי כדי להעריך את תפקידם של גנים בודדים באפנון של כאב. הוא גם מספק מערכת מודל לחקור את האפקטיביות של סוכנים טיפוליים פוטנציאליים כדי להקל על כאב כרוני.
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים לד"ר JL. Galzi (UMR7242 CNRS; Illkirch, צרפת) על תמיכתו.
עבודה זו נתמכה על ידי CNRS, INSERM, אוניברסיטת דה שטרסבורג, אלזס BioValley ועל ידי מענקים מConectus, סוכנות הידיעות הלאומית דה לה משוכלל ונדיר (ANR 08 EBIO 014.02) Conseil d'Alsace האזורי (Pharmadol), Communauté Urbaine דה שטרסבורג (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), כיוון Entreprises ז'נרל דה (Pharmadol).
Name | Company | Catalog Number | Comments/description |
C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30g) |
Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS n° 52-26-6 | Delivered with special authorization |
Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml |
Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | G26 ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
Mouse restrainer | Home-made | – | Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples. |
Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
STATview software | Free download; Statistics |