Se describe un protocolo para examinar el desarrollo de la hiperalgesia y la tolerancia en ratones inducida por opioides. Sobre la base de la medición de las respuestas nociceptivas térmicas y mecánicas de los animales no tratados previamente y tratados con morfina, que permite cuantificar el aumento en la sensibilidad al dolor (hiperalgesia) y disminuir en la analgesia (tolerancia) asociada con la administración de opiáceos crónica.
Hiperalgesia y tolerancia inducida por opioides afectan gravemente la eficacia clínica de los opiáceos como analgésicos en animales y humanos. Los mecanismos moleculares que subyacen a ambos fenómenos no son bien entendidos y su elucidación deberían beneficiarse del estudio de modelos animales y desde el diseño de protocolos experimentales apropiadas.
Se describe aquí un enfoque metodológico para la inducción, el registro y la cuantificación de la hiperalgesia inducida por la morfina, así como para evidenciar la tolerancia analgésica, utilizando las pruebas de presión de la cola-inmersión y de la cola en ratones de tipo salvaje. Como se muestra en el video, el protocolo se divide en cinco pasos secuenciales. Fases de manipulación y de habituación permiten una determinación segura de la respuesta nociceptiva basal de los animales. La administración crónica de morfina induce hiperalgesia significativa como se muestra por un aumento tanto en sensibilidad térmica y mecánica, mientras que la comparación de la analgesia cursos temporales después de aguda o representantetratamiento con morfina eated indica claramente el desarrollo de la tolerancia se manifiesta por una disminución de la amplitud de la respuesta analgésica. Este protocolo se puede adaptar de manera similar a los ratones modificados genéticamente con el fin de evaluar el papel de los genes individuales en la modulación de la nocicepción y analgesia de la morfina. También proporciona un sistema modelo para investigar la eficacia de agentes terapéuticos potenciales para mejorar la eficacia analgésica de los opiáceos.
Hiperalgesia inducida por opiáceos (HIO) y la tolerancia analgésica limitan la eficacia clínica de los opiáceos en los animales y los seres humanos 1-3. La participación de los pro-inflamatoria de 4,5 o de pro-nociceptivos (anti-opioide) 6,7 sistemas están actualmente explorando hipótesis. La elucidación de los mecanismos subyacentes HIO y la tolerancia requiere una combinación de in vivo e in vitro enfoques, usando modelos animales adecuados, protocolos experimentales y herramientas moleculares.
Farmacología del comportamiento es el paradigma dominante para controlar y cuantificar los estados analgésicas y hiperalgésicas en animales de laboratorio (ratas, ratones). La aplicación de un estímulo nocivo (térmica, mecánica o química) a una parte del cuerpo conveniente (pata trasera, cola) del animal conduce a una retirada nocifensive que puede ser fácilmente anotó.
Proponemos aquí un enfoque metodológico para la inducción, el registro y cuantificación de OIH ytolerancia en ratones de tipo salvaje, utilizando las pruebas de presión de la cola-inmersión y de la cola. El procedimiento permite una determinación fácil, sensible y reproducible de los valores de respuesta nociceptivas térmicas y mecánicas en ratones. Como se demuestra en el protocolo de video, C57BL / 6 ratones experimentan hiperalgesia significativa después de la administración crónica de morfina y mantener esto durante varios días. Ambos valores nociceptivas térmicas y mecánicas se reducen significativamente, en comparación con las mediciones de línea de base en los animales no tratados previamente. Por otra parte, nuestro montaje experimental permite monitorear, además del desarrollo de OIH, la disminución de la respuesta analgésica de la morfina (tolerancia). Los datos presentados respaldan la opinión de que la hiperalgesia y la tolerancia pueden involucrar mecanismos celulares y moleculares comunes 8,9, aunque esto es discutido en la literatura 1,10-12. Finalmente, este protocolo se puede adaptar de manera similar a los ratones modificados genéticamente con el fin de evaluar el papel de los genes individuales en la modulaciónción del dolor. También proporciona un sistema modelo para evaluar la eficacia de agentes terapéuticos potenciales para mejorar los efectos analgésicos opiáceos.
Pasos críticos
Elección de la modelo animal para las mediciones de la nocicepción
La variabilidad en la sensibilidad nociceptiva y analgésico entre las cepas de ratones se ha examinado (opiniones 14-16) En el uso de diversos modelos de dolor que difieren en su etiología (nociceptivo, inflamatorio, neuropático), modalidad (térmica, química, mecánica), la duración (aguda, tónico, crónica) y sitio de administración (cutánea, subcutánea, visceral). En comparación con otras cepas, C57BL/6J ("J" de Jackson Laboratory) los ratones se convirtió en un modelo animal muy popular para los estudios del dolor, ya que muestran una alta sensibilidad nociceptiva basal 17,18 y una respuesta analgésica moderada a los opiáceos 14,19. Después del tratamiento crónico con morfina, también desarrollan tolerancia analgésica significativa 20,21, 21,22 hiperalgesia y la dependencia 20,23.
nt "> En este caso, los experimentos se realizaron en ratones C57BL/6N Tac (" N "para el Instituto Nacional de Salud y" Tac 'para Taconics granja) que pertenecen a una rama separada del linaje B6. Aunque C57BL / 6 ratones han sido durante mucho tiempo considerados como intercambiables, estudios recientes apuntan a diferencias de comportamiento significativas entre las cepas C57BL/6J y C57BL/6N 24. En particular, la menor sensibilidad de las tres subcepas C57BL/6N (incluyendo el Tac uno) a dolor agudo térmico puede ser considerado como un ventaja para las pruebas de este fenotipo.Los ratones machos fueron seleccionados como la gran mayoría de los estudios del dolor, utilizando ratones como modelo animal, se realiza en varones menores de 25. En nuestras manos, que proporcionaron datos robusta y reproducible cuando se examina desde los analgesia o hiperalgesia puntos de vista. De vez en cuando, nos dimos cuenta de una tendencia a que las mujeres C57BL/6N para proporcionar respuestas más variables, tanto en el TIT y pruebas TPT. Aunque esta observación puedereflejan variaciones naturales vinculados a la condición hormonal de las mujeres, los mecanismos generales que subyacen diferencias de sexo en el dolor y la analgesia todavía siguen siendo motivo de controversia. Algunos aspectos de este debate caliente se presentarán brevemente en los próximos "Limitaciones de la técnica de la" sección.
Habituación Animal
Ratones primero se les permitió familiarizarse con las instalaciones de animales durante una semana. Similar a cualquier otro estudio de comportamiento, se realizó la prueba tras un período de 3 días de aclimatación-(Figura 1, etapa A). Como pruebas nociceptivas son sensibles al estrés, primero medidas pueden dar latencias más largas que las subsiguientes, especialmente en los ratones no habituado 26,27. El paso de la habituación permite también la obtención de valores de respuesta nociceptivas más estable dentro del mismo día y entre días Figuras 2 y 4. Para reducir los efectos circadianos en nociceptivo y analgésicosensibilidad 28,29, se llevaron a cabo todos los testeos 10 a.m.-04:00 h.
Selección de pruebas nociceptivas
Pruebas nociceptivas utilizan ya sea térmica, mecánica, química o estímulos eléctricos (revisión 26,27,30. Su elección es fundamental, ya diferentes modalidades nociceptivas pueden ser procesados a través de diferentes nociceptores y fibras 18,31,32.
Seleccionamos la prueba de inmersión de la cola (TIT) 33, una versión modificada de la prueba de retirada de la cola clásica desarrollada por D'amour y Smith de 34 años, y la prueba de presión de la cola (TPT), una adaptación de Randall y Selitto 35, como ejemplos de térmica y modalidades mecánicas para estudiar la analgesia inducida por la morfina, la hiperalgesia y la tolerancia en ratones. Ambas pruebas se han utilizado ampliamente en ratas. Un tiempo de corte se definió sistemáticamente para evitar o limitar el riesgo de daños en los tejidos.
La morfina-induccióned la analgesia, la hiperalgesia y la tolerancia
La morfina, la-mu-opiáceos prototípico agonista, se seleccionó aquí, ya que es un potente analgésico y HIO-inductor, tanto en seres humanos y ratones 1,2,36. La morfina analgésico potencia se sabe que varían con cepas de ratones, vías de administración y las modalidades nociceptivas. En ratones C57BL / 6, la analgesia fiable se obtiene por lo general después de las inyecciones subcutáneas de morfina en el intervalo de 1-20 mg / kg de dosis 14,21. De acuerdo con ello, se optó por estudiar la analgesia aguda después de una sola administración (sc) de morfina a 5 mg / kg, cercano a su valor ED50 (7-20 mg / kg) evaluaron de nocicepción térmica 19,21.
La administración repetida de morfina se acompaña a menudo con la tolerancia analgésica (evidenciado ya sea desde un desplazamiento hacia la derecha de la curva dosis-respuesta o de una disminución de la amplitud de la respuesta analgésica o duración) y la hiperalgesia (una sensibilidad exacerbada a stimul dolorosai se evidencia de una disminución en el valor nociceptivo basal). Ambos fenómenos adversos dependen de cepas de roedores, de la naturaleza del compuesto que se selecciona de opiáceos y su dosificación, la duración del tratamiento y sobre las modalidades nociceptivas 21. Por ejemplo, los paradigmas experimentales para estudiar la tolerancia y la hiperalgesia consisten en la administración diaria de alta y constante (20 a 40 mg / kg por día) 22 o de la escalada (hasta 50 o incluso 200 mg / kg) 20,21 dosis de morfina. De acuerdo con ello, impulsamos el desarrollo de la hiperalgesia y la tolerancia en C57BL / 6 ratones a través de la administración de morfina diaria (5 mg / kg; sc) durante un período de 8 días. Se prefirió este dosis moderada de morfina durante más altos a una mejor utilización clínica de mímica.
Puesta en marcha de la ventana operativa TIT
Una posible escollo en TIT podría estar relacionado con el papel de la cola en la termorregulación de roedores 26,37. Cuando la temperatura ambiente es un factor clave en nociceptive variaciones en la respuesta, que debe mantenerse constante (aquí a 21 ° C) a lo largo de los experimentos 38. La intensidad del calor se suele crear para detectar una respuesta nociceptiva dentro de 5 a 10 seg 27. De hecho, las latencias mayores pueden aumentar el riesgo para el seguimiento de los movimientos de animales no relacionados con el estímulo nociceptivo, mientras que los más cortos pueden reducir la diferencia de poder de la prueba. Se realizó mediciones TIT a una temperatura fija de 48 ° C. Latencias de retirada de la cola estaban cerca de 9 segundos (valor basal nociceptivo) y varió de 4 seg (hiperalgesia) a 25 seg (analgesia máxima; cortado). Además de razones prácticas, las mediciones de valores de respuesta nociceptiva a una temperatura fija pueden implicar a priori el mismo repertorio de los nociceptores y circuitos, facilitando de este modo la interpretación de datos.
Modificaciones Posibles
Optimización de la ventana operativa TIT para la analgesia y la OIH MeasureMents
Al centrarse en una respuesta analgésica, los valores de referencia de baja (intensidad de calor superior) pueden favorecer la detección de un retraso en la respuesta. A su vez, para hacer frente a la consecuencia de un estímulo doloroso o el desarrollo de HIO, los valores de línea de base más altas (de intensidad de calor inferior; aquí 48 ° C) puede facilitar la detección de respuestas más rápidas Figura 4.
Aunque hemos encontrado morfina a 5 mg / kg una dosis conveniente para inducir una respuesta analgésica robusta Figura 3 y para promover (después de la administración repetida) hiperalgesia significativa la Figura 4, su dosificación se puede adaptar como se ha mencionado antes (paso crítico: la analgesia inducida por morfina-, hiperalgesia y la tolerancia). Por ejemplo, las dosis inferiores pueden ser utilizados para reducir la amplitud de la analgesia (evitando de este modo las limitaciones de corte), mientras que dosis más altas pueden ser elegidos para acelerar la aparición de hiperalgesia y aumentar su amplitud.
OveRall, la optimización de la "ventana nociceptivo 'debe adaptarse a los antecedentes genéticos de los ratones en estudio y tener en cuenta la posibilidad de que la participación de las matrices distintas de los nociceptores y circuitos.
Agonistas opiáceos alternativos (fentanilo, remifentanilo)
Aunque opiáceos utilizados clínicamente más dirigen a los receptores mu-opioide como agonistas, difieren considerablemente con respecto a sus propiedades farmacológicas, tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, el remifentanilo y el fentanilo, en contraste marcado con la morfina, se comportan como agonistas completos y promover la internalización de los receptores mu-opioides 39. Los analgésicos opiáceos, como la morfina y el fentanilo tiene una vida media en el rango de 40 horas, mientras que el remifentanilo tiene un ultra-corta vida media de varios minutos 41. En los seres humanos, la mejor evidencia para OIH es de los pacientes que recibieron opiáceos durante la cirugía, incluyendo acción corta compounds como remifentanilo 2,42. Por lo tanto, fentanilo y remifentanilo pueden ser herramientas valiosas también para estudiar el desarrollo de la hiperalgesia y la tolerancia en ratones, en virtud de teta y paradigmas TPT.
Modos alternativos de inducción de OIH (crónica vs administración aguda)
HIO se ve en los seres humanos y en modelos animales como consecuencia de la administración de opiáceos, ya sea en dosis muy bajas o extremadamente altas 1,2. Se presenta aquí en el desarrollo OIH tras el tratamiento crónico de los ratones con dosis moderadas de la morfina. Varios días de tratamiento de ratones C57BL/6N eran necesarias para evidenciar una hiperalgésico clara y reproducible Figura estado 4 inyecciones diarias de morfina podría ser sustituido adecuadamente con pellets de morfina implantados:. Sobre su eliminación, tanto de hiperalgesia térmica y alodinia mecánica han sido ya reportado en ratones 43. La infusión de opiáceos a través de una bomba de micro-osmótica es otra posibilidad 44. En roedores, la hiperalgesia de larga duración está también alcanzable después de la administración aguda de fentanilo utilizando un protocolo de imitar el uso de esta-agonista opioide mu en cirugía humana 36,45,46.
Limitaciones de la Técnica
Las especies animales y modelos para el dolor
Estudios comparativos de numerosas cepas de ratón aporta evidencia para grandes variaciones en las respuestas nociceptivas a estímulos dolorosos 17,31,47 y en los niveles de OIH después del tratamiento de 4 días morfina 22. Ya sea que los mecanismos subyacentes de procesamiento y modulación del dolor en modelos animales (ratones y ratas) son relevantes para los pacientes con dolor crónico sigue siendo una cuestión fundamental y se abrió. Por lo tanto, mucho cuidado debe prestarse a la interpretación de los datos de los animales y para su validez predictiva para los seres humanos 16.
Las diferencias de sexo en el dolor y la analgesia
ntent "> mayoría de los estudios preclínicos en modelos animales para el dolor han llevado a cabo en roedores machos 16,25,48. pesar de este sesgo de selección, la vista emergente fue considerar machos como mejores respondedores a analgésicos opiáceos 49,50, menos propensos a desarrollar opioide hiperalgesia 51,52 y más tolerantes a la morfina analgesia 53 que sus contrapartes femeninas (revisión 54)-inducida. Sin embargo, las diferencias entre sexos en cuanto a la nocicepción y fármacos analgésicos eficacia no se reanudan en tal "una talla única para todos" paradigma. De hecho, una gran cantidad de datos indica ahora que numerosas variables que pueden influir en la magnitud y dirección de las diferencias de sexo como la eficacia de opiáceos de drogas y la selectividad, ensayo nociceptivo, antecedentes genéticos, la edad, el estado-gonado hormonal o la interacción social 48,54. En los seres humanos, la clínica del dolor es más frecuente en las mujeres, pero si este hecho refleja las diferencias de sexo reales sigue siendo motivo de debate 48,55,56. For ejemplo, el análisis global de cincuenta ensayos clínicos, mostró que no hay diferencias significativas en las propiedades analgésicas entre géneros, mientras que el meta-análisis realizados en sujetos pacientes controlados señalado una eficacia significativamente mayor de opiáceos en mujeres 57. Esta última observación, lo que contrasta notablemente con lo que ha sido que se encuentra en los roedores, plantea de nuevo varias preguntas sobre el origen de tales divergencias 16,48,55,57. En total, existen diferencias de sexo en la analgesia y el mérito se centran más en los mecanismos subyacentes e implicaciones clínicas.Acerca de las pruebas nociceptivas
La prueba de retirada de la cola es un reflejo espinal, pero puede estar sujeto a influencias supraespinales 58. TIT es relativamente fácil de realizar en ratas, pero requiere más experiencia en ratones. Una dificultad potencial es la de mantener el ratón en una postura correcta sin inducir estrés no deseado. El protocolo propuesto puede ser ajustado de acuerdo atamaño de la cohorte. 16 animales (8 de control y 8 tratadas) se manejan fácilmente en cuanto a la medición de sus valores de respuesta nociceptivas basales (utilizando TIT primero, a continuación, TPT para toda la serie de los ratones) se encuentra bajo preocupación. Monitoreo de cursos de tiempo de analgesia requiere el establecimiento de un horario de tiempo precisa y la evaluación del número máximo de animales que pueden ser probados (TIT primero, a continuación, TPT) dentro del intervalo de tiempo impartida (aquí 30 min). Toda la cohorte de animales puede así ser dividido en subgrupos para permitir que el experimentador de respetar las limitaciones cinéticas.
Importancia de la técnica con respecto a los métodos existentes / Alternative
HIO en ratas frente a ratón
Las ratas se han utilizado ampliamente para estudiar la analgesia opioide, la hiperalgesia y la tolerancia, después de la administración de opiáceos aguda o crónica 46,59-61. De hecho, por varias razones prácticas, se les puede considerar superior aratones como un modelo animal para los experimentos de dolor 16,61. Sin embargo, hasta hace poco, la generación de ratas modificadas genéticamente no era un procedimiento sencillo. Como numerosas cepas de ratones genéticamente modificados que ya están disponibles, el modelo ofrece la oportunidad de estudiar la contribución de numerosos genes individuales en OIH y el desarrollo de tolerancia en ratones.
TIT y TPT en comparación con otras pruebas nociceptivas
TIT es una variante de la prueba de retirada de la cola, la diferencia más evidente es la zona de estimulación. En contraste con el calor radiante, inmersión de la cola en agua caliente conduce a un aumento rápido y uniforme en su temperatura. En comparación con otras formas de pruebas nocicepción térmica (placa caliente o Hargreaves pruebas), TIT proporciona resultados bastante reproducibles tanto entre como dentro de los sujetos.
TPT es una prueba muy popular para el estudio de la nocicepción mecánica 26,27,35 lo que probablemente implicafibras nociceptivas distintas y transductores moleculares entonces TIT 32. Proporciona mediciones rápidas y fiables 59 pero requiere un poco de experiencia en el experimentador y grandes cohortes de animales. Como una alternativa a la analgesímetro utilizado en el presente estudio, otros procedimientos o aparatos depender de medidores de deformación no existe (revisión 27). TPT es el más adecuado para el estudio de la hiperalgesia mecánica mientras que los filamentos de von Frey se toman habitualmente para evaluar la alodinia mecánica (revisión 27).
Aplicaciones futuras o llegar después de dominar esta técnica
El modelo HIO / tolerancia experimental se presenta aquí se puede adaptar de manera similar a los ratones modificados genéticamente con el fin de evaluar el papel de los genes individuales en la modulación del dolor. También proporciona un sistema modelo para investigar la eficacia de agentes terapéuticos potenciales para aliviar el dolor crónico.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS; Illkirch, Francia) por su apoyo.
Este trabajo fue apoyado por el CNRS, INSERM, Universidad de Estrasburgo, Alsacia BioValley y por subvenciones de Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014,02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Comunidad Urbana de Estrasburgo (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direction Générale des Entreprises (Pharmadol).
Name | Company | Catalog Number | Comments/description |
C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30g) |
Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS n° 52-26-6 | Delivered with special authorization |
Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml |
Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | G26 ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
Mouse restrainer | Home-made | – | Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples. |
Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
STATview software | Free download; Statistics |