Nós descrevemos um protocolo para examinar o desenvolvimento da hiperalgesia e tolerância em ratos induzida por opióides. Com base na medição das respostas nociceptivas térmicas e mecânicas de animais naive e tratados com morfina, que permite quantificar o aumento da sensibilidade à dor (hiperalgesia) e diminuir na analgesia (tolerância) associada à administração de opiáceos crónica.
Hiperalgesia e tolerância induzida por opióides influenciar severamente a eficácia clínica de opiáceos, analgésicos em animais e seres humanos. Os mecanismos moleculares subjacentes ambos os fenômenos não são bem compreendidos e sua elucidação deverá beneficiar a partir do estudo de modelos animais e para o projeto de protocolos experimentais apropriados.
Descrevemos aqui uma abordagem metodológica para a indução, gravação e quantificar hiperalgesia induzida por morfina, bem como para evidenciar tolerância analgésico, usando os testes de pressão rabo-de imersão e de cauda em camundongos selvagens. Como mostrado no vídeo, o protocolo é dividida em cinco etapas sequenciais. Fases de manipulação e de habituação permitir uma determinação segura da resposta nociceptiva basal dos animais. A administração de morfina crónica induz hiperalgesia significativa como mostrado por um aumento tanto em sensibilidade térmica e mecânica, em que a comparação do tempo de analgesia pratos após aguda ou reptratamento morfina eated indica claramente o desenvolvimento de tolerância que se manifesta por uma diminuição na amplitude da resposta analgésica. Este protocolo pode ser igualmente adaptado para ratinhos geneticamente modificados de modo a avaliar o papel dos genes individuais na modulação da nocicepção e analgesia da morfina. Ele também proporciona um sistema modelo para investigar a eficácia de potenciais agentes terapêuticos para melhorar a eficácia do analgésico opiáceo.
Hiperalgesia induzida por opióides (OIH) e tolerância analgésica limitar a eficácia clínica de opiáceos em animais e seres humanos 1-3. O envolvimento de pró-inflamatória de 4,5 ou de pró-nociceptivos (anti-opióide) 6,7 sistemas são atualmente exploradas hipóteses. A elucidação dos mecanismos subjacentes OIH e tolerância exige uma combinação de in vivo e in vitro abordagens, usando modelos animais apropriados, protocolos experimentais e ferramentas moleculares.
Farmacologia comportamental é o paradigma dominante para monitorar e quantificar estados analgésicas e hiperalgésicos em animais de laboratório (ratos, camundongos). A aplicação de um estímulo nocivo (térmica, mecânica ou química) para uma parte do corpo conveniente (pata traseira, cauda) de que o animal leva a uma retirada defensivas que podem ser facilmente marcados.
Propomos aqui uma abordagem metodológica para a indução, gravação e quantificar OIH etolerância em ratinhos de tipo selvagem, utilizando os testes de pressão e de imersão de cauda-cauda. O procedimento permite uma determinação fácil, sensível e reprodutível de valores de resposta nociceptivos térmicos e mecânicos em ratinhos. Como demonstrado no protocolo de vídeo, ratinhos C57BL / 6 experimentar hiperalgesia significativo após a administração de morfina crónico e manter esta durante vários dias. Ambos os valores nociceptivos térmicas e mecânicas são significativamente reduzidos, em comparação com as medições da linha de base em animais ingênuos. Além disso, a instalação experimental permite monitorar, para além do desenvolvimento de OIH, a diminuição da resposta analgésica de morfina (tolerância). Dados apresentados suportam a ideia de que a hiperalgesia e tolerância pode envolver mecanismos celulares e moleculares comuns 8,9, embora isso seja contestado na literatura 1,10-12. Finalmente, este protocolo pode ser igualmente adaptado para camundongos geneticamente modificados, a fim de avaliar o papel de genes individuais na modulaçãoção da dor. Ele também proporciona um sistema modelo para avaliar a eficácia de potenciais agentes terapêuticos para melhorar os efeitos analgésicos opiáceos.
Etapas críticas
A escolha do modelo de animal para medições de nocicepção
A variabilidade na sensibilidade nociceptiva e analgésico entre linhagens de camundongos foi examinado (comentários 14-16) comentários usando vários modelos de dor que diferem em sua etiologia (nociceptivos, inflamatória, neuropática), modalidade (térmica, química, mecânica), duração (aguda, tônico, crónica) e local de administração (injecção cutânea, subcutânea, visceral). Quando comparado com outras cepas, C57BL/6J ("J" para Jackson Laboratory) ratos tornou-se um modelo animal popular para estudos da dor como eles apresentam alta sensibilidade nociceptiva basal 17,18 e uma resposta analgésica moderada a opiáceos 14,19. Após o tratamento morfina crônica, eles também desenvolvem tolerância analgésico significativo 20,21, 21,22 e hiperalgesia dependência 20,23.
nt "> Aqui, os experimentos foram realizados em ratos C57BL/6N Tac (" N "para Instituto Nacional de Saúde e" Tac "para Taconics fazenda), que pertencem a um ramo separado da linhagem B6. Apesar de camundongos C57BL / 6 têm sido considerada, estudos recentes apontaram para intercambiáveis significativas diferenças comportamentais entre C57BL/6J e C57BL/6N cepas 24. Em particular, a menor sensibilidade para os três subcepas C57BL/6N (incluindo o Tac) com uma dor aguda térmica pode ser considerado como um vantagem para testar este fenótipo.Ratos machos foram seleccionados como a grande maioria dos estudos sobre a dor, utilizando ratinhos como modelo animal, são realizadas em machos juvenis 25. Em nossas mãos, forneceram dados robusto e reprodutível quando examinados a partir de analgesia ou hiperalgesia pontos de vista. Ocasionalmente, notamos uma tendência para as mulheres C57BL/6N para dar respostas mais variável, tanto no TIT e testes TPT. Embora esta observação poderefletir as variações naturais ligados ao status hormonal das fêmeas, os mecanismos gerais subjacentes diferenças sexuais na dor e analgesia ainda permanecem um assunto de controvérsia. Alguns aspectos deste debate quente será brevemente apresentado nos próximos "Limitações da técnica de 'seção.
Habituação Animais
Ratos foram os primeiros autorizados a se acostumar com a facilidade animal durante uma semana. Semelhante a qualquer outro estudo comportamental, o teste foi realizado após um período de 3 dias de aclimatação, (Figura 1, passo A). Como os testes nociceptivos são sensíveis ao estresse, primeiras medidas podem dar latências mais longas do que as posteriores, especialmente em camundongos não habituado 26,27. O passo de habituação permite também a obtenção de valores de resposta nociceptiva mais estáveis dentro do mesmo dia e entre os dias Figuras 2 e 4. Para reduzir os efeitos circadianos sobre nociceptiva e analgésicosensibilidade 28,29, todos os testes foram realizados 10:00-16:00.
Seleção de testes nociceptivos
Testes nociceptivos usar térmica, mecânica, química ou estímulos elétricos (revisão 26,27,30. Sua escolha é crítica como diferentes modalidades nociceptivos podem ser processados através de diferentes nociceptores e fibras 18,31,32.
Foi selecionado o teste de imersão da cauda (TIT) 33, uma versão modificada do teste de retirada da cauda clássica desenvolvido por D'Amour e Smith, 34, e o teste de pressão da cauda (TPT), adaptado de Randall e Selitto 35, como exemplos de térmica e modalidades mecânicos para estudar a analgesia induzida por morfina, hiperalgesia e tolerância em ratinhos. Ambos os testes têm sido amplamente utilizados em ratos. Uma vez cortado foi sistematicamente definido para evitar ou limitar o risco de danos nos tecidos.
Morphine-induçãoed analgesia, hiperalgesia e tolerância
Morphine, o agonista mu-opióide protótipo, foi selecionado aqui, pois é um potente analgésico e OIH-indutor, tanto em humanos e camundongos 1,2,36. A potência analgésica da morfina é conhecida por variar de acordo com estirpes de ratinhos, as vias de administração e formas nociceptivos. Em ratinhos C57BL / 6, a analgesia de confiança é normalmente obtido após injecções subcutâneas de morfina na gama de 1-20 mg / kg de dose de 14,21. Assim, optou-se por estudar analgesia aguda após uma única administração (sc) de morfina a 5 mg / kg, perto de seu valor de ED 50 (7-20 mg / kg) avaliou de nocicepção térmica 19,21.
Administração repetida de morfina é muitas vezes acompanhada com tolerância analgésica (evidenciado a partir de um desvio para a direita da curva de dose-resposta ou a partir de um decréscimo na amplitude da resposta analgésica ou duração) e hiperalgesia (sensibilidade exacerbada dolorosa para stimuli evidenciado a partir de uma diminuição do valor basal nociceptivo). Ambos os fenómenos adversos dependem estirpes de roedores, da natureza do composto de ópio, que é seleccionado e da sua dosagem, da duração do tratamento e em modalidades nociceptivos 21. Por exemplo, os paradigmas experimentais para o estudo de tolerância e hiperalgesia consistem na administração diária de alta e constante (20 a 40 mg / kg por dia) ou 22 de escalada (até 50 ou até 200 mg / kg) 20,21 doses de morfina. Dessa forma, promoveu o desenvolvimento de hiperalgesia e tolerância em ratinhos C57BL / 6 por meio de administração de morfina por dia (5 mg / kg; sc) durante um período de 8 dias. Esta dose de morfina foi moderada preferência sobre os mais elevados para um melhor uso clínica imitar.
Criação de TIT janela operacional
Uma possível armadilha em TIT pode estar relacionado com o papel da cauda na termorregulação de roedores 26,37. Como a temperatura ambiente é um fator chave na nociceptive variações de resposta, que deve ser mantida constante (aqui a 21 ° C) ao longo de 38 experiências. Intensidade de calor geralmente é configurado para detectar uma resposta nociceptiva dentro de 5 a 10 seg 27. Com efeito, latências maiores pode aumentar o risco para monitorizar os movimentos dos animais não relacionados com o estímulo nociceptivo, ao passo que os mais curtos pode reduzir o poder do diferencial de teste. Foram realizadas medições TIT a uma temperatura fixa de 48 ° C. Latência de retirada da cauda eram cerca de 9 segundos (valor nociceptiva basal) e variou de 4 seg (hiperalgesia) a 25 seg (analgesia máxima; cortadas). Em adição a razões de ordem prática, as medições de valores da resposta nociceptiva, a uma temperatura fixa, a priori, pode envolver o mesmo reportório de nociceptores e circuitos, facilitando assim a interpretação de dados.
Possíveis Modificações
Otimização da janela operacional TIT para analgesia e OIH MeasureMents
Ao focalizar uma resposta analgésica, valores basais baixos (maior intensidade de calor) pode favorecer a detecção de um atraso na resposta. Por sua vez, para enfrentar a conseqüência de um estímulo doloroso ou o desenvolvimento de OIH, os valores basais mais elevados (intensidade menor calor; aqui 48 ° C) pode facilitar a detecção de respostas mais rápidas Figura 4.
Embora tenham sido encontrados morfina a 5 mg / kg uma dose conveniente para induzir uma resposta analgésica robusta Figura 3 e para promover (com a administração repetida) hiperalgesia significativa Figura 4, a sua dosagem pode ser adaptada conforme mencionado antes (passo crítico: a analgesia induzida por morfina, hiperalgesia e tolerância). Por exemplo, doses mais baixas podem ser usadas para reduzir a amplitude da analgesia (evitando assim as limitações de corte), enquanto que doses mais elevadas podem ser escolhidos para acelerar o início da hiperalgesia e aumentar a sua amplitude.
Overall, otimização da "janela nociceptiva" deve ser adaptado para o fundo genético dos ratos em estudo e levar em conta a possibilidade de envolvimento de matrizes distintas de nociceptores e circuitos.
Agonistas opiáceos alternativos (fentanil, remifentanil)
Embora opiáceos mais clinicamente como alvo o receptor mu-opióides como agonistas, que diferem consideravelmente no que diz respeito às suas propriedades farmacológicas, tanto in vitro como in vivo. Por exemplo, remifentanil e fentanil, em contraste marcado com a morfina, se comportam como agonistas completos e promover a internalização dos receptores mu-opióides 39. Analgésicos opiáceos, tais como morfina e fentanil tem uma meia-vida na gama de 40 horas, enquanto remifentanil tem uma ultra-curta meia vida de vários minutos, 41. Em humanos, a melhor evidência para OIH é de pacientes que receberam opiáceos durante a cirurgia, incluindo a curto atuação compounds como remifentanil 2,42. Assim, fentanil e remifentanil podem ser ferramentas valiosas demais para estudar o desenvolvimento de hiperalgesia e tolerância em ratos, sob TIT e paradigmas TPT.
Modos alternativos de indução de OIH (crónica vs administração aguda)
OIH é observada nos seres humanos e em modelos animais, como consequência da administração de opiáceos, mesmo a muito baixas ou muito altas dosagens de 1,2. Registramos aqui o desenvolvimento OIH após o tratamento crônico de ratos com doses moderadas de morfina. Vários dias de tratamento de ratinhos C57BL/6N foram necessárias para evidenciar uma hiperalgesia Figura estado claro e reprodutível 4 injecções diárias de morfina pode ser adequadamente substituído com pastilhas de morfina implantados:. Após a sua remoção, tanto a hiperalgesia térmica e alodinia mecânica foram já relatadas em murganhos 43. A infusão de opiáceos, através de uma bomba de micro-osmótico é outra possibilidade 44. Em roedores, a hiperalgesia de longa duração, também é viável a seguir a administração aguda de fentanil utilizando um protocolo que imita o uso deste agonista mu-opióide em cirurgia humana 36,45,46.
Limitações da técnica
As espécies animais e modelos para dor
Estudos comparativos de várias linhagens de camundongos fornecido evidências para grandes variações nas respostas aos estímulos nociceptivos doloroso 17,31,47 e nos níveis de OIH após o tratamento 4 dias morfina 22. Se mecanismos subjacentes processamento da dor e modulação em modelos animais (ratinhos e ratos) são relevantes para pacientes com dor crônica permanece uma questão fundamental e aberto. Assim, muito cuidado deve ser pago para a interpretação dos dados de animais e para a sua validade preditiva para os seres humanos 16.
Diferenças de género na dor e analgesia
ntent "> A maioria dos estudos pré-clínicos em modelos animais para dor foram conduzidos em roedores machos 16,25,48. Apesar deste viés de seleção, a visão emergente foi considerar os homens como melhores respondedores ao analgésicos opiáceos 49,50, menos propensas a desenvolver opióide hiperalgesia 51,52 e mais tolerantes à morfina analgesia 53 do que seus colegas do sexo feminino (54) revisão induzida. No entanto, as diferenças de sexo em relação a nocicepção e drogas analgésicas eficácia não retomar na tal "um tamanho único 'paradigma. fato, uma riqueza de dados agora indica que inúmeras variáveis podem influenciar a magnitude ea direção das diferenças sexuais, como a eficácia de opióides de drogas e seletividade, ensaio nociceptiva, herança genética, idade, estado gonado-hormonal ou interação social 48,54. Nos seres humanos, a dor clínica é mais prevalente em mulheres, mas se este fato reflete as diferenças de sexo reais continua a ser uma questão de debate 48,55,56. For exemplo, a análise global de cinquenta ensaios clínicos não revelou diferenças significativas nas propriedades analgésicas entre os sexos enquanto meta-análise realizada em pacientes com controle assuntos apontou para um significativamente maior eficácia de opióides em mulheres 57. Esta última observação, o que contrasta marcadamente com o que tem sido encontrado em roedores, mais uma vez levanta várias questões sobre a origem de tais divergências 16,48,55,57. Ao todo, as diferenças sexuais na analgesia existem e mérito focar ainda mais em mecanismos subjacentes e implicações clínicas.Sobre testes nociceptivos
O teste de retirada da cauda é um reflexo espinhal, mas pode ser sujeito a influências supra-58. TIT é relativamente fácil de executar em ratos, mas requer mais experiência em camundongos. Uma dificuldade potencial é manter o mouse em uma postura correta sem induzir estresse indesejado. O protocolo proposto pode ser ajustado de acordo comtamanho da coorte. 16 animais (8 Controle e 8 tratados) são facilmente gerenciados, tanto quanto a medição de seus valores basais resposta nociceptiva (usando TIT primeiro, depois TPT para toda a série de camundongos) está em preocupação. Monitoramento de cursos de tempo de analgesia requer o estabelecimento de um calendário preciso e avaliação do número máximo de animais que podem ser testadas (TIT primeiro, depois TPT), dentro do intervalo de tempo Comunicados (aqui 30 min). Todo o grupo de animais pode, assim, ser divididos em subgrupos para permitir que o experimentador a respeitar limitações cinéticas.
Importância da técnica com relação a / Métodos Alternativos Existentes
OIH em ratos contra rato
Os ratos têm sido amplamente utilizados para estudar analgesia opióide, hiperalgesia e tolerância, após a administração de opiáceos aguda ou crônica 46,59-61. Com efeito, por várias razões práticas, elas podem ser considerados superiores aoscamundongos como modelo animal para experimentos dor 16,61. No entanto, até há pouco tempo, a geração de ratos geneticamente modificados não era um procedimento simples. Como numerosas estirpes de ratinhos geneticamente modificados já estão disponíveis, o nosso modelo oferece a oportunidade para estudar a contribuição de numerosos genes individuais em OIH e desenvolvimento de tolerância em ratinhos.
TIT e TPT contra outros testes nociceptivos
TIT é uma variante do teste da ponta da cauda, a diferença mais óbvia é a área da estimulação. Em contraste com calor radiante, por imersão da cauda em água quente conduz a um aumento rápido e uniforme na sua temperatura. Comparado com outras formas de teste de nocicepção térmica (testes de placa quente ou Hargreaves), TIT fornece resultados bastante reprodutíveis tanto entre e dentro de assuntos.
TPT é um teste muito popular para o estudo da nocicepção mecânica 26,27,35 que provavelmente envolvefibras nociceptivas distintas e transdutores moleculares então TIT 32. Ele fornece rápidas e confiáveis medições de 59, mas requer alguns conhecimentos do experimentador e grandes grupos de animais. Como uma alternativa para o analgesímetro utilizado no presente estudo, outros processos e aparelhos contando com medidores de tensão que existe (avaliação 27). TPT é o mais adequado para o estudo da hiperalgesia mecânica enquanto filamentos de von Frey são normalmente tomadas para avaliar a alodinia mecânica (revisão 27).
Aplicações Futuras ou Directions depois de dominar esta técnica
O modelo OIH / tolerância experimental apresentamos aqui podem ser de forma semelhante adaptado para ratinhos geneticamente modificados de modo a avaliar o papel dos genes individuais na modulação da dor. Ele também fornece um sistema modelo para investigar a eficácia de potenciais agentes terapêuticos para aliviar a dor crônica.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos ao Dr. JL. Galzi (UMR7242 CNRS; Illkirch, França) por seu apoio.
Este trabalho foi apoiado pelo CNRS, INSERM, Université de Strasbourg, Alsace BioValley e por doações de Conectus, Agence National de la Recherche (ANR 08 EBIO 014.02) Conseil Régional d'Alsace (Pharmadol), Comunidade Urbana de Estrasburgo (Pharmadol), ICFRC (Pharmadol), OSEO (Pharmadol), Direcção-Geral das Entreprises (Pharmadol).
Name | Company | Catalog Number | Comments/description |
C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30g) |
Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS n° 52-26-6 | Delivered with special authorization |
Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml |
Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | G26 ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
Mouse restrainer | Home-made | – | Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples. |
Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
STATview software | Free download; Statistics |