وصفنا بروتوكول لدراسة تطور فرط التألم الناجم عن المواد الأفيونية والتسامح في الفئران. استنادا إلى قياس الاستجابات مسبب للألم الحرارية والميكانيكية للحيوانات السذاجة والمعالجة المورفين، فإنه يسمح لقياس الزيادة في حساسية الألم (فرط التألم) وانخفاض في تسكين (التسامح) المرتبطة بإدارة الأفيونية المزمن.
فرط التألم الناجم عن المواد الأفيونية والتسامح تؤثر بشدة على الفعالية السريرية للمواد الأفيونية مسكنات الألم كما في الحيوانات والبشر. الآليات الجزيئية الكامنة وراء كل من الظواهر ليست مفهومة جيدا وينبغي أن تستفيد من التوضيح لهم من دراسة النماذج الحيوانية ومن تصميم البروتوكولات التجريبية المناسبة.
نحن هنا وصف الأسلوب المنهجي للحمل، وتسجيل وقياس التي يسببها المورفين فرط التألم وكذلك لتثبت التسامح مسكن، وذلك باستخدام الذيل والذيل الغمر اختبارات الضغط في البرية من نوع الفئران. كما هو موضح في الفيديو، وينقسم إلى خمسة بروتوكول خطوات متسلسلة. التعامل والتعود مراحل تسمح بتحديد الآمن للاستجابة مسبب للألم القاعدية من الحيوانات. إدارة المورفين المزمن يؤدي فرط التألم كبيرة كما يتضح من زيادة في كل من الحساسية الحرارية والميكانيكية، في حين أن المقارنة بين تسكين الوقت دورات بعد الحاد أو مندوبيشير علاج المورفين عتيد بوضوح تنمية التسامح تتجلى في انخفاض في السعة استجابة مسكن. هذا البروتوكول يمكن تكييفها على نحو مماثل لالفئران المعدلة وراثيا من أجل تقييم دور الجينات الفردية في التشكيل من حس الألم وتسكين المورفين. كما يوفر نظام نموذجي للتحقيق في فعالية العوامل العلاجية المحتملة لتحسين فعالية المسكنات الأفيونية.
الأفيونية التي يسببها فرط التألم (OIH) ومسكن التسامح تحد من الفعالية السريرية للمواد الأفيونية في الحيوانات والبشر 1-3. يتم استكشاف إشراك الموالية للالتهابات 4،5 أو المؤيدة للمسبب للألم (مكافحة الأفيونية) 6،7 نظم حاليا الفرضيات. توضيح من الآليات الكامنة OIH والتسامح يتطلب مزيجا من المجراة في المختبر النهج، وذلك باستخدام نماذج حيوانية مناسبة، البروتوكولات التجريبية والأدوات الجزيئية.
الصيدلة السلوكية هو النموذج المهيمن لرصد وتحديد ولايات مسكن ومفرط التألم في الحيوانات المختبرية (الجرذان والفئران). تطبيق الحوافز الضارة (الحرارية والميكانيكية أو الكيميائية) لجزء من الجسم مريحة (hindpaw، الذيل) من الحيوان يؤدي إلى انسحاب nocifensive التي يمكن وسجل بسهولة.
نقترح هنا مقاربة منهجية لإحداث وتسجيل وقياس OIH والتسامح في البرية من نوع الفئران، وذلك باستخدام الذيل والذيل الغمر اختبارات الضغط. يسمح الإجراء لتحديد سهلة وحساسة وقابلة للتكرار القيم استجابة مسبب للألم الحرارية والميكانيكية في الفئران. كما هو موضح في بروتوكول الفيديو، C57BL / 6 الفئران تجربة فرط التألم الهامة التالية الإدارة المورفين المزمنة والحفاظ على هذا لعدة أيام. وخفضت بشكل كبير سواء القيم مسبب للألم الحرارية والميكانيكية، مقارنة مع المقاييس على الحيوانات السذاجة. علاوة على ذلك، لدينا التجريبية مجموعة المتابعة يسمح لمراقبة، بالإضافة إلى تطوير OIH، وانخفاض الاستجابة للمسكن المورفين (التسامح). دعم البيانات المقدمة عن رأي مفاده أن فرط التألم والتسامح قد تنطوي على الآليات الخلوية والجزيئية شيوعا 8،9، على الرغم من أن هذا هو المتنازع عليها في الأدب 1،10-12. أخيرا، هذا البروتوكول يمكن تكييفها على نحو مماثل لالفئران المعدلة وراثيا من أجل تقييم دور الجينات الفردية في MODULAنشوئها من الألم. كما يوفر النظام نموذج لتقييم فعالية وكلاء العلاجية المحتملة لتحسين تأثيرات مسكنة الأفيونية.
خطوات حاسمة
اختيار نموذج حيواني لقياس حس الألم
وقد تم فحص التغير في حساسية مسبب للألم ومسكن بين سلالات الفئران (مراجعات 14-16) مشاركات باستخدام نماذج الألم المختلفة واختلاف في المسببات الخاصة بهم (مسبب للألم، التهابات، والأعصاب)، طريقة (الحرارية والكيميائية والميكانيكية)، ومدة (الحادة، منشط، المزمنة) وموقع الإدارة (الجلدي، تحت الجلد، والحشوية). بالمقارنة مع السلالات الأخرى، C57BL/6J ("J" لمختبر جاكسون) الفئران أصبح نموذج حيواني شعبية للدراسات الألم لأنها تبدي حساسية عالية مسبب للألم القاعدية 17،18 وردا مسكن معتدلة الى المواد الأفيونية 14،19. بعد العلاج المورفين المزمنة، كما أنها مهمة تطوير مسكن التسامح 20،21، 21،22 فرط التألم والاعتماد 20،23.
الإقليم الشمالي "> هنا، أجريت التجارب على الفئران C57BL/6N تاك (" N "للمعهد الوطني للصحة و" تاك "لمزرعة Taconics) التي تنتمي إلى فرع مستقل من النسب B6. على الرغم من C57BL / 6 الفئران منذ فترة طويلة تعتبر أشار قابلة للتبديل، والدراسات الأخيرة إلى الفروق السلوكية بين C57BL/6J كبيرة وC57BL/6N سلالات 24. على وجه الخصوص، يمكن اعتبار حساسية أقل من substrains C57BL/6N الثلاثة (بما في ذلك واحدة تاك) إلى الألم الحاد الحرارية باعتباره ميزة لاختبار هذا النمط الظاهري.وقد تم اختيار الفئران الذكور كما أن الغالبية العظمى من الدراسات الألم، وذلك باستخدام الفئران كنموذج الحيوان، يتم تنفيذها على الأحداث الذكور 25. في أيدينا، وأنها قدمت بيانات قوية وقابلة للتكرار عندما بحثت عن وعي أو فرط التألم وجهات النظر. في بعض الأحيان، لاحظنا وجود اتجاه للإناث C57BL/6N لتوفير المزيد من الردود متغير، سواء في TIT والاختبارات TPT. على الرغم من أن هذه الملاحظة قدتعكس التغيرات الطبيعية المرتبطة حالة الهرمونية للإناث، وآليات الشاملة الكامنة وراء الفروق بين الجنسين في تسكين الألم ومازالت مثار جدل. وستعرض بعض جوانب هذه المناقشة الساخنة لفترة وجيزة في 'حدود تقنية "بجوار القسم.
التعود الحيوان
سمح الفئران أول من التعود على منشأة الحيوان خلال أسبوع واحد. على غرار أي دراسة سلوكية أخرى تم إجراء الاختبار، وبعد فترة 3 ايام التأقلم (الشكل 1، خطوة A). كما اختبارات مسبب للألم حساسة للإجهاد، قد تعطي الإختفاء التدابير الأولى أطول من تلك اللاحقة، وخاصة في الفئران غير الذي تعود 26،27. الخطوة التعود يسمح أيضا obtention القيم استجابة مسبب للألم أكثر استقرارا في نفس اليوم وبين أيام أرقام 2 و 4. للحد من آثار الإيقاعية على مسبب للألم ومسكنحساسية 28،29، وأجريت جميع الاختبارات 10:00 حتي 04:00.
اختيار الاختبارات مسبب للألم
اختبارات مسبب للألم استخدام إما الحرارية والميكانيكية والكيميائية أو المحفزات الكهربائية (استعراض 26،27،30. اختيارهم أمر بالغ الأهمية كما يمكن معالجتها بطرائق مختلفة من خلال nociceptors مسبب للألم والألياف 18،31،32 مختلفة.
اخترنا اختبار الذيل الغمر (TIT) 33، وهو نسخة معدلة من الكلاسيكية اختبار الذيل نفض الغبار وضعتها D'العمور وسميث 34، واختبار الضغط الذيل (TPT)، مقتبس من راندال وSelitto 35، كأمثلة على الحراري و طرائق الميكانيكية لدراسة التي يسببها المورفين تسكين، فرط التألم والتسامح في الفئران. وقد استخدمت على نطاق واسع على حد سواء اختبارات في الفئران. وعرف الوقت قطعت بشكل منهجي لتجنب أو الحد من خطر تلف الأنسجة.
المورفين-inducإد تسكين، فرط التألم والتسامح
المورفين، وتنميط مو الأفيونية ناهض تم اختيارها، وهنا كما هو مسكن قوي وOIH-محفز، سواء في البشر والفئران 1،2،36. ومن المعروف المورفين المسكنة رجولية لسلالات الفئران تختلف مع وطرق الإدارة وطرائق مسبب للألم. في C57BL / 6 الفئران، وعادة ما يتم الحصول عليها تسكين موثوقة التالية حقنة تحت الجلد من المورفين في حدود 1-20 ملغ / كغ جرعة 14،21. وفقا لذلك، اخترنا لدراسة تسكين الحادة التالية إدارة واحدة (الشوري) من المورفين في 5 مغ / كغ، على مقربة من قيمتها ED 50 (7-20 ملغ / كلغ) المقررة من حس الألم الحرارية 19،21.
وغالبا ما يترافق مع الإدارة المورفين المتكررة التسامح مسكن (يدل إما من التحول نحو اليمين في منحنى الاستجابة للجرعة أو من انخفاض في السعة استجابة مسكن أو المدة) وفرط التألم (حساسية تفاقمت إلى الامفيتامين مؤلمةط يتضح من انخفاض في قيمة مسبب للألم القاعدية). كل من الظواهر السلبية تعتمد على سلالات القوارض، على طبيعة المجمع الأفيونية التي يتم تحديد الجرعة و، المعقودة في مدة العلاج وعلى طرائق مسبب للألم 21. على سبيل المثال، تتكون نماذج تجريبية لدراسة التسامح وفرط التألم في الإدارة اليومية عالية وثابتة (20-40 مغ / كغ يوميا) 22 أو تصاعد (تصل إلى 50 أو حتى 200 ملغ / كلغ) 20،21 جرعات المورفين. وفقا لذلك، ونحن تعزيز تطوير فرط التألم والتسامح في C57BL / 6 الفئران من خلال الإدارة اليومية المورفين (5 ملغ / كغ؛ الشوري) على مدى فترة 8 أيام. كان يفضل هذا جرعة المورفين معتدلة على أعلى منها في تحسين استخدام العيادة تقليد.
انشاء نافذة التشغيلية TIT
A شرك محتمل في TIT قد تكون ذات صلة إلى دور الذيل في التنظيم الحراري من القوارض 26،37. كما درجة الحرارة المحيطة هي عامل رئيسي في nociceptإيف الاختلافات ردا على ذلك، فإنه يجب أن تبقى ثابتة (هنا في 21 ° C) في جميع أنحاء التجارب 38. عادة ما يتم تعيين شدة حرارة تصل إلى الكشف عن استجابة مسبب للألم في غضون 5 إلى 10 ثانية 27. في الواقع، قد الإختفاء أكبر زيادة خطر لرصد تحركات الحيوانات لا علاقة لها التحفيز مسبب للألم، بينما أقصر منها قد يقلل من قوة الفرق من الاختبار. أجرينا قياسات TIT عند درجة حرارة ثابتة من 48 درجة مئوية. كانت الإختفاء ذيل سحب على مقربة من 9 ثانية (قيمة مسبب للألم القاعدية) ومتنوعة في الفترة من 4 ثانية (فرط التألم) إلى 25 ثانية (تسكين القصوى؛ تقطع). بالإضافة إلى أسباب عملية، قد قياسات القيم استجابة مسبب للألم عند درجة حرارة ثابتة تنطوي بداهة نفس ذخيرة من nociceptors ودوائر، وبالتالي تيسير تفسير البيانات.
تعديلات ممكنة
تعظيم الاستفادة من نافذة التشغيلية TIT لتسكين وOIH قياس الأبعاداليلة
عندما تركز على استجابة مسكن، والقيم الأساسية منخفضة (أعلى كثافة حرارة) قد تحبذ الكشف عن التأخير في الاستجابة. في المقابل، لمعالجة نتيجة لبالألم أو تطوير OIH، والقيم الأساسية العليا (أقل شدة الحرارة، وهنا 48 ° C) قد يسهل الكشف عن استجابات أسرع الشكل 4.
على الرغم من أن وجدنا المورفين في 5 ملغ / كغ جرعة مريحة للحث على الاستجابة قوية مسكن الشكل 3، وتعزيز (على الادارة المتكررة) كبيرة فرط التألم الشكل 4، ويمكن تكييفها الجرعة على النحو المذكور قبل (الخطوة الحرجة: تسكين المورفين التي يسببها، فرط التألم والتسامح). على سبيل المثال، يمكن استخدام جرعات أقل للحد من اتساع تسكين (وبالتالي تجنب القيود وقف انتاج المواد الانشطارية) في حين يمكن اختيار جرعات أعلى لتسريع ظهور فرط التألم وزيادة السعة الخاصة به.
اوفهRALL، والتحسين من 'نافذة مسبب للألم' ينبغي أن تتكيف مع الخلفية الوراثية للفئران قيد الدراسة وتأخذ بعين الاعتبار إمكانية لإشراك صفائف متميزة من nociceptors ودوائر.
منبهات الأفيونية البديلة (الفنتانيل، remifentanyl)
على الرغم من أن معظم المواد الأفيونية المستخدمة سريريا تستهدف مستقبلات مو الأفيونية كما منبهات، إلا أنها تختلف إلى حد كبير فيما يتعلق خصائصها الدوائية سواء في التجارب المختبرية والحية. على سبيل المثال، remifentanyl والفنتانيل، في تناقض ملحوظ مع المورفين، تتصرف كما منبهات الكاملة وتعزيز استيعاب مو الأفيونية مستقبلات 39. المسكنات الأفيونية مثل المورفين والفنتانيل يكون نصف العمر في حدود 40 ساعة، في حين remifentanyl لديه نصف عمر قصيرة جدا من عدة دقائق 41. في البشر، وأفضل دليل على OIH هو من المرضى الذين تلقوا مخدرات أثناء الجراحة، بما في ذلك التمثيل القصير جompounds مثل remifentanyl 2،42. وبالتالي، الفنتانيل وremifentanyl قد تكون أدوات قيمة للغاية لدراسة تطوير فرط التألم والتسامح في الفئران، تحت TIT ونماذج TPT.
وسائط بديلة للتحريض OIH (المزمنة الحادة ضد الإدارة)
وينظر OIH في البشر والنماذج الحيوانية نتيجة للإدارة الأفيونية، سواء في جرعات منخفضة جدا أو مرتفعة للغاية 1،2. نحن هنا التقرير على التنمية OIH بعد العلاج المزمن من الفئران بجرعات معتدلة من المورفين. وكانت عدة أيام من العلاج من الفئران C57BL/6N اللازمة لأدلة على الشكل الدولة مفرط التألم واضحة وقابلة للتكرار 4 حقن المورفين يوميا يمكن الاستعاضة على نحو كاف مع الكريات المورفين مزروع: على إزالتها، تم الإبلاغ عن كل من فرط التألم الحرارية والميكانيكية آلام جلدية بالفعل في الفئران 43. التسريب للمواد الأفيونية من خلال مضخة صغيرة التناضحي هو احتمال آخر 44. في القوارض، فرط التألم طويلة الأمد وأيضا تحقيقه التالية الإدارة الحاد في الفنتانيل باستخدام بروتوكول محاكاة استخدام هذا ناهض مو الأفيونية في جراحة الإنسان 36،45،46.
قيود تقنية
الأنواع الحيوانية ونماذج للألم
الدراسات المقارنة للعديد من سلالات الفئران قدمت أدلة للاختلافات كبيرة في ردود مسبب للألم للمؤثرات المؤلمة 17،31،47 وفي مستويات OIH بعد العلاج 4 أيام المورفين 22. سواء الآليات الكامنة وراء معالجة الألم والتشكيل في نماذج حيوانية (الفئران والجرذان) هي ذات الصلة لمرضى الألم المزمن يبقى السؤال الأساسي وفتح. وبالتالي، ينبغي إيلاء الكثير من الحذر في تفسير البيانات الحيوانية وصحتها التنبؤية للبشر 16.
الفروق بين الجنسين في تسكين الألم و
ntent "> وقد أجريت معظم الدراسات قبل السريرية على النماذج الحيوانية للألم على القوارض الذكور 16،25،48. على الرغم من هذا التحيز في الاختيار، كان الرأي الناشئة للنظر المستجيبين الذكور كما المسكنات الأفيونية أفضل ل49،50، أقل عرضة لتطوير الأفيونية فرط التألم 51،52 وأكثر تسامحا لالمورفين تسكين 53 من نظرائهم الإناث على (استعراض 54) التي يسببها، إلا أن الفروق بين الجنسين فيما يتعلق حس الألم والمسكنات والعقاقير فعالية لا استئناف في مثل هذه "حجم واحد يناسب الجميع" النموذج. في الواقع، ثروة من البيانات تشير إلى أن العديد من المتغيرات الآن قد تؤثر على حجم واتجاه الفروق بين الجنسين مثل فعالية المخدرات الأفيونية والانتقائية، فحص مسبب للألم، والخلفية الوراثية، والعمر، والحالة الهرمونية-gonado أو التفاعل الاجتماعي 48،54. في البشر، ألم السريرية هو أكثر انتشارا في النساء، ولكن إذا كان هذا الواقع يعكس الفروق بين الجنسين الفعلية لا تزال موضوع نقاش 48،55،56. فوص سبيل المثال، أشار التحليل العالمي خمسين التجارب السريرية عدم وجود اختلافات كبيرة في خصائص مسكنة بين الجنسين في حين الفوقية تحليلات أجريت على المرضى الموضوعات التي تسيطر عليها وأشار إلى فعالية المواد الأفيونية أكبر بكثير لدى النساء 57. الملاحظة الأخيرة، والذي يتباين بشكل ملحوظ مع ما كان وجدت في القوارض، ويثير العديد من التساؤلات مرة أخرى بشأن منشأ للخلافات مثل هذه 16،48،55،57. تماما، الفروق بين الجنسين في تسكين موجودة والجدارة مزيد من التركيز على الآليات الكامنة والآثار السريرية.حول الاختبارات مسبب للألم
اختبار الانسحاب الذيل هو منعكس الشوكي لكنها قد تكون عرضة للتأثيرات فوق الشوك 58. TIT من السهل نسبيا لأداء على الفئران ولكن يتطلب المزيد من الخبرة في الفئران. وثمة صعوبة المحتملة هو الحفاظ على الماوس في الموقف الصحيح دون إحداث الإجهاد غير المرغوب فيها. يمكن تعديل البروتوكول المقترح وفقا لحجم الفوج. 16 الحيوانات (8 السيطرة و8 المعالجة) تدار بسهولة بقدر قياس القيم مسبب للألم القاعدية استجابة (باستخدام TIT أولا، ثم TPT لسلسلة كاملة من الفئران) هو تحت قلق. رصد دوام تسكين يتطلب إنشاء جدول زمني دقيق وتقييم عدد القصوى من الحيوانات التي يمكن اختبار (TIT أولا، ثم TPT) ضمن الفاصل الزمني المنقولة (هنا 30 دقيقة). وبالتالي يمكن تقسيم الفوج كاملة من الحيوانات إلى مجموعات فرعية للسماح للمجرب على احترام القيود الحركية.
أهمية تقنية فيما يتعلق / طرق البديلة القائمة
OIH في الفئران مقابل الماوس
تم الفئران المستخدمة على نطاق واسع لدراسة تسكين الأفيونية، فرط التألم والتسامح، في أعقاب حادة أو مزمنة الإدارة الأفيونية 46،59-61. في الواقع، لعدة أسباب عملية، فإنها قد تعتبر متفوقة علىالفئران كنموذج للحيوانات للتجارب الألم 16،61. ومع ذلك، حتى وقت قريب، كان جيل من الفئران المعدلة وراثيا لا إجراءات واضحة. عن العديد من سلالات الفئران المعدلة وراثيا هي متاحة بالفعل، لدينا نموذج يتيح الفرصة لدراسة مساهمة العديد من الجينات الفردية في OIH والتنمية التسامح في الفئران.
TIT وTPT مقابل الاختبارات الأخرى مسبب للألم
TIT هو البديل للاختبار الذيل نفض الغبار، والفرق الأكثر وضوحا هو مجال التحفيز. في المقابل مع الحرارة الإشعاعية، الغمر من الذيل في الماء الساخن يؤدي إلى زيادة سريعة وموحدة في درجة حرارته. بالمقارنة مع غيرها من أشكال اختبار Nociception الحرارية (ساخن لوحة أو هارجريفز الاختبارات)، TIT يوفر نتائج استنساخه إلى حد ما على حد سواء عبر وداخل المواضيع.
TPT هو اختبار شعبية جدا لدراسة حس الألم الميكانيكية 26،27،35 الذي ينطوي على الارجحالألياف مسبب للألم متميزة ومحولات الطاقة الجزيئية ثم TIT 32. فإنه يوفر قياسات سريعة وموثوق بها 59 ولكن يتطلب بعض الخبرة من المجرب والأفواج الحيوانات الكبيرة. كبديل لanalgesimeter المستخدمة في هذه الدراسة، وإجراءات أخرى أو أجهزة الاعتماد على أجهزة قياس الضغط موجودة (الاستعراض 27). TPT هو الانسب لدراسة فرط التألم الميكانيكية في حين عادة ما تؤخذ خيوط فراي فون لتقييم آلام جلدية الميكانيكية (المراجعة 27).
تطبيقات المستقبل أو الاتجاهات بعد اتقان هذه التقنية
نموذج OIH / التسامح التجريبية نقدم هنا يمكن تكييفها على نحو مماثل لالفئران المعدلة وراثيا من أجل تقييم دور الجينات الفردية في التشكيل من الألم. كما يوفر نظام نموذجي للتحقيق في فعالية العوامل العلاجية المحتملة لتخفيف الألم المزمن.
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور JL. Galzi (UMR7242 CNRS؛ إلكيرش، فرنسا) لدعمه.
وأيد هذا العمل من قبل CNRS، INSERM، جامعة ستراسبورغ، الألزاس وBioValley من المنح المقدمة من Conectus، لوكالة الوطني للبحوث (ANR 08 EBIO 014.02) CONSEIL الجهوي كوت الألزاس (Pharmadol)، COMMUNAUTE URBAINE دي ستراسبورغ (Pharmadol)، ICFRC (Pharmadol)، OSEO (Pharmadol)، جنرال اتجاه قصر الانتاجية (Pharmadol).
Name | Company | Catalog Number | Comments/description |
C57BL/6N Tac mice | Taconic, Ry, Denmark | C57BL/6N Tac B6-M | Male mice (25-30g) |
Morphine hydrochloride | Francopia, Paris, France | CAS n° 52-26-6 | Delivered with special authorization |
Syringes (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050000 | Polypropylene; Sterile; Volume : 1 ml |
Needles (Terumo) | Dutscher, Brumath, France | 050101 | G26 ½ (Terumo reference : NN2613RO1) |
Mouse restrainer | Home-made | – | Two metallic grids (5x11cm) assembled with adhesive tape and staples. |
Thermostated water bath GR150 | Grant Instruments, Cambridge, UK | GP 0540003 | |
Analgesimeter | Panlab, Barcelona, Spain | LE 7306 | |
Kaleidagraph software | Synergy software, Reading, PA, USA | Kaleidagraph 4.03 | Scientific graphing |
STATview software | Free download; Statistics |