Descriviamo un protocollo robusto e versatile per l'analisi dell'architettura nucleare dalla FISH DNA 3D utilizzando sonde fluorescenti direttamente etichettati.
FISH 3D DNA è diventato uno strumento importante per analizzare l'organizzazione tridimensionale del nucleo, e diverse variazioni della tecnica sono stati pubblicati. In questo articolo descriviamo un protocollo che è stato ottimizzato per la robustezza, la riproducibilità e la facilità d'uso. Vivaci fluorescenti sonde marcate direttamente sono generati da nick-translation con amino-allyldUTP seguita da accoppiamento chimica del colorante. FISH 3D DNA viene eseguita utilizzando una fase di congelamento-scongelamento per permeabilizzazione cellulare e una fase di riscaldamento per denaturazione simultanea di sonda e DNA nucleare. Il protocollo è applicabile ad una gamma di tipi di cellule e una varietà di sonde (BAC, plasmidi, fosmidi, o vernici Chromosome interi) e permette l'imaging automatizzato ad alta produttività. Con questo metodo abbiamo quotidianamente indaghiamo localizzazione nucleare di un massimo di tre regioni cromosomiche.
DNA ibridazione in situ fluorescente (FISH DNA) permette la visualizzazione tridimensionale dei singoli loci genici, domini subchromosomal e anche interi cromosomi durante tutte le fasi del ciclo cellulare. FISH 2D viene utilizzato per studi metafase mentre FISH 3D è stato ampiamente utilizzato per sondare il rapporto tra l'organizzazione spaziale del genoma e la sua funzione durante l'interfase (1,2 e riferimenti ivi citati). Storicamente, gli studi di co-associazione sono stati eseguiti da indagando decine a centinaia di singoli loci dai pesci. Tecniche più recentemente potente high throughput 3C-based come 4C e Hi-C sono stati sviluppati 3, permettendo l'indagine molecolare, cross-talk tra molte migliaia di differenti loci. Mentre le tecniche di 3C-based e FISH DNA possono essere metodi complementari, non necessariamente rispondere alle stesse domande. Metodi basati 3C forniscono una lettura insieme di popolazioni cellulari miste, con un conseguente probalità per la co-associazioni. Al contrario, mentre in basso rendimento, le tecniche base di pesce offrono la possibilità di analizzare le disposizioni spaziali di loci o cromosomi nelle cellule individuali in base alle loro diverse fasi del ciclo di sviluppo o cellulare. Quindi, FISH continuerà ad essere un importante strumento per sondare i rapporti struttura-funzione nucleari.
Ci sono due considerazioni importanti nello svolgimento di successo esperimenti di FISH 3D. Questi sono: 1. ottenendo sonde marcate in modo ottimale e 2. scelta di trattamenti cellulari, compresa la fissazione, pre e procedura post-ibridazione, per preservare morfologia nucleare il più possibile rendendo DNA sufficientemente accessibile per l'ibridazione della sonda. Etichettatura sonda efficiente è di fondamentale importanza per i pesci. Tradizionalmente, nick-translation è stato usato per introdurre o aptene o nucleotidi fluoroforo-coniugati 4. Allo stesso modo, i kit commerciali nick-traduzione sono disponibili per aptene diretta o fluoroforo incorporazione, but anche per l'etichettatura in due fasi utilizzando nucleotidi aminoallyl e coloranti ammina-reattiva. Quest'ultimo rende incorporazione colorante più efficace dando polimerasi DNA una molecola meno ingombrante con cui lavorare. Più recentemente, kit per l'etichettatura non enzimatica di DNA sono stati sviluppati che sfruttano legame coordinativo di platino per acidi nucleici. Sonde FISH possono anche essere acquistati già etichettato 5. Mentre i kit e le sonde prodotte commercialmente senza dubbio dare la facilità d'uso, sono notevolmente più costosi rispetto all'acquisto dei singoli componenti e la produzione di sonde in-house. Abbiamo ottimizzato un protocollo di traduzione nick a basso costo al fine di etichettare direttamente molte diverse sonde BAC in più colori. Abbiamo scoperto che l'ottenimento di DNA altamente puro BAC è critica e risultati in un requisito per solo il 10-20 ng di sonda per vetrino FISH, rispetto a 10-20 volte più quando viene utilizzato impuro DNA stampo, con conseguente maggiore costo e tempo- risparmio. L'uso di ammino-allyldUTP permette di etichettatura flessibilesonde con coloranti ammina-reattivi disponibili (ad esempio, Alexa Fluor o Cy-coloranti) o apteni (es. biotina, digossigenina). Aptene-sonde marcate vengono rilevati da anticorpi coniugati fluoroforo o streptavidina per amplificare e visualizzare il segnale. Luminoso sonde marcate direttamente mostrano generalmente meno la colorazione di fondo e di evitare sovra-amplificazione dei segnali, e quindi una conseguente rappresentazione più accurata della localizzazione nucleare e locus morfologia.
Ci sono diverse tecniche di pesci diversi che utilizzano diversi fissativi, pre-trattamenti e lavaggi post-ibridazione, ma questi generalmente rientrano nelle seguenti categorie: fissazione glutaraldeide con NaOH denaturazione, la fissazione di formaldeide con HCl denaturazione, e la fissazione di formaldeide con denaturazione al calore 6-9 . Ognuno di questi ha vantaggi e svantaggi. Glutaraldeide risultati fissaggio in buona conservazione strutturale nucleare, ma richiede un trattamento con agenti riducenti per ridurre al minimol'autofluorescenza risultante, e il trattamento NaOH deve essere attentamente controllato per bilanciare sufficiente denaturazione del DNA e potenziali danni alla struttura nucleare 6. Fissazione formaldeide è meno forte, dando una maggiore probabilità di perturbazioni di architettura nucleare, ma anche in genere dando segnali più forti e più affidabile e più bassi autofluorescenza 9. HCl trattamento depurinates DNA e ne estrae le proteine, che fornisce un facile accesso al DNA per le sonde, ma può anche introdurre rotture del DNA. Riscaldamento separa fisicamente i due filamenti di DNA con conseguente buona ibridazione target e segnali forti, ma può causare qualche perturbazione della struttura nucleare 8. Il grado in cui ciascuna di queste tecniche affetti epitopi proteici varia ampiamente 6,9, con la conseguente esigenza di determinare sperimentalmente per ogni proteina il protocollo ottimale da utilizzare in esperimenti di immuno-FISH.
Mentre non vi è alcun 'perfetto' DNA FISH technique, tutti possono essere utili se ben controllata. Nostro obiettivo era ottimizzare un protocollo per robusto e riproducibile FISH DNA per indagare posizionamento spaziale dei loci multipli in una varietà di tipi cellulari 10, concentrandosi sul metodo di riscaldamento per la maggior parte dei segnali affidabili. Con questo e l'uso di un sistema di imaging automatizzato abbiamo puntato ad aumentare il throughput per l'analisi di singole cellule di accordi nucleari.
FISH 3D DNA è diventato uno strumento ampiamente riconosciuto per analizzare disposizioni spaziali nel nucleo. Mentre il pesce fornisce risultati visivi e diretti, come con ogni tecnica, bisogna essere consapevoli dei suoi limiti. FISH DNA affronta il problema intrinseco che i trattamenti relativamente dure sono necessarie per rendere cromatina accessibile per sonde FISH che alla fine interrompe nucleare struttura-la cosa che deve essere analizzato. Diverse strategie sono state perseguite a destreggiarsi tra accessibilità e la conservazione della struttura. Nel protocollo qui descritto, il DNA cromosomico viene resa accessibile dal congelamento-scongelamento permeabilizzazione delle cellule e denaturazione termica prima di ibridazione della sonda. Solovei, et al., (2002) ha analizzato cambiamenti strutturali dopo trattamento simile ed ha trovato che lo spostamento medio dei domini cromatinici era 300 nm che limita la risoluzione di analisi strutturale a circa 1 Mb regioni nel genoma 8. Mentre questo non è alta risoluzione, essaè un ragionevole per analizzare la posizione nucleare.
Una considerazione più pratica per l'analisi FISH è che l'acquisizione dell'immagine e misure di distanze nucleari sono processi richiede tempo che limitano il numero di nuclei che può essere analizzato. Al fine di studiare eventi rari abbiamo cercato di fare imaging ad alta velocità automatizzato. Poi, con comandi idonei in atto, numero sufficiente possono essere confrontati per permettere l'analisi statistica robusta delle relazioni spaziali. Noi abitualmente Analizziamo 600 nuclei per ogni punto di dati per il quale si determinano le coordinate 3D di tutti i segnali FISH all'interno del volume nucleare. Questi dati richiedono poco spazio di archiviazione e consentono l'analisi di inter-e intra-allelica distanze o posizioni radiali in qualsiasi momento successivo. Inoltre, il trattamento automatizzato può essere fatto in modo cieco ricercatore che riduce notevolmente la probabilità di distorsione inconsapevole.
Per abilitare questo tipo di analys ad alto rendimentosi, il nostro obiettivo era quello di stabilire un modo veloce ed efficiente di eseguire FISH DNA. Abbiamo trovato il protocollo qui descritto per essere estremamente robusta, costantemente produrre segnali luminosi a basso fondo. Ha funzionato per tutti i tipi di cellule che abbiamo provato fornito abbiamo adattato la fase di fissare le cellule al vetrino. Inoltre, con una sola eccezione, tutti i BAC abbiamo utilizzato potrebbero essere trasformate in sonde luminose. Abbiamo anche rilevato con successo un certo numero di proteine nucleari mediante colorazione anticorpale dopo FISH DNA. Mentre per alcune proteine questo funziona bene, si consiglia di confronto con immunofluorescenza tradizionale (IF) per garantire la coerenza del pattern di colorazione anticorpale tra IF e DNA immuno FISH (cfr. 11).
Generalmente, abbiamo trovato che sonde marcate in diversi colori producevano gli stessi risultati. Tuttavia, i seguenti aspetti devono essere considerati quando si sceglie il colorante etichettatura. Prima, il colore del fluoroforo deve essere ben rilevabile con il microscopio uSED. In secondo luogo, la lunghezza d'onda della luce emessa dai fluorofori dovrebbe essere sufficientemente diverso per evitare sanguinare attraverso nell'altro canale. Questo dipenderà filtri nel microscopio. E terzo, almeno nelle nostre mani, alcuni colori producono segnali luminosi più coerente di altri. Abbiamo sempre usato DAPI (blu) come di contrasto che rende Alexa Fluor 555 (rosso), 488 (verde), e 647 (rosso lontano) buone scelte per l'etichettatura di sonde. Con il nostro sistema di imaging, abbiamo trovato Alexa Fluor 555 (rosso) per produrre i segnali luminosi, seguiti da Alexa Fluor 488 (verde). Alexa Fluor 647 (rosso lontano) ha lo svantaggio che non può essere rilevata dall'occhio umano e quindi non segnali può essere visto quando guardando il microscopio. Così, se facendo FISH a due colori, si consiglia la combinazione di coloranti rossi e verdi.
Possono sorgere due problemi principali: le cellule lavare via le diapositive e segnali deboli. Come le cellule e aderire alla diapositiva è betw estremamente variabiletipi di cellule een, e il miglior protocollo per risolvere / seme le cellule devono essere determinati. Abbiamo utilizzato con successo sia con carica positiva o vetrini rivestiti di poli-L-lisina (acquistati pronti per l'uso), ma abbiamo trovato le cellule generalmente rispettati meglio vetrini rivestiti di poli-L-lisina. Abbiamo anche scoperto che quando le cellule erano intere zone troppo dense avrebbe tolto come un foglio, mentre l'imaging automatizzato è stato ostacolato se le cellule erano troppo scarsi. Così, se il campione non è troppo preziosa, numeri cellulari differenti dovrebbero essere seminate per determinare la densità ideale. Se le cellule sono particolarmente inclini a lavare, una penna barriera idrofobica può essere utilizzato, e passi FISH può essere eseguita con una pipetta con attenzione le soluzioni direttamente sul vetrino. Pipettaggio inoltre riduce drasticamente i volumi dei reagenti necessari, ma richiede molto più tempo quando si fa più diapositive.
I segnali deboli sono di solito a causa di sonde poveri, e vale la pena di investire tempo nel fare buoni. Clean BAC DNA deve essere un usod come materiale che può essere ottenuto mediante ripetute precipitazione o kit disponibili in commercio partenza. Contaminazione con DNA genomico batterico influisce negativamente sulla qualità sonda e accurato trattamento durante la lisi cellulare e filtraggio del lisato cellulare è necessaria per mantenerlo al minimo. E ', tuttavia, non è necessario utilizzare un passo esonucleasi per digerire il DNA lineare, in quanto ciò riduce notevolmente rendimento. Etichettatura efficiente della sonda è di fondamentale importanza. Il controllo di qualità più importante per questo passaggio sta controllando la dimensione del frammento dopo la traduzione nick (vedi Rappresentante dei risultati). Un 'buon' striscio quasi sempre si tradurrebbe in un brillantemente sonda colorata. Tuttavia, abbiamo trovato che occasionalmente un certo BAC non può essere trasformato in una buona sonda, e una diversa BAC deve essere scelto. Un altro passo importante è la denaturazione al calore. Se la temperatura è troppo bassa, il DNA sarà solo parzialmente denaturate e ibridazione sonda sarà compromessa. Se la temperatura è troppo elevata, la struttura nucleare will essere turbato più del necessario. Nelle nostre mani, 78 ° C su blocco calda invertito è il compromesso ideale, ma questo può variare a seconda del rispettivo blocco calda utilizzata.
Abbiamo avuto buoni risultati utilizzando montaggio Vectashield medie, ma ha scoperto che SlowFade Oro ha meno di fondo e mantiene il segnale fluorescente a lungo. Si sconsiglia l'utilizzo di hard-set di mezzo di montaggio, come abbiamo trovato che questo influisce struttura 3D e di formare bolle d'aria nel corso del tempo.
In conclusione, brillantemente fluorescenti sonde marcate direttamente insieme al protocollo FISH DNA qui descritti offrono una soluzione efficiente per l'analisi robusta e rapida dell'architettura nucleare che è applicabile ad un'ampia varietà di questioni biologiche.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal BBSRC e il Wellcome Trust. Vorremmo ringraziare Simon Walker per l'assistenza con l'imaging e Felix Krueger per un aiuto con analisi bioinformatica.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
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