我们描述一个强大的和灵活的三维DNA鱼直接标记的荧光探针分析核架构协议。
3D DNA鱼已成为一个主要的工具,用于分析三维组织的细胞核,该技术已发表了一些变化。在这篇文章中,我们描述了协议的鲁棒性,重现性和易用性进行了优化。明亮的荧光标记的探针产生的缺口转译与氨基allyldUTP随后通过化学偶联的染料。三维DNA FISH进行使用冻融步骤,用于细胞透化和加热步骤,用于同时变性的探针和核DNA。该协议是适用于细胞类型和各种探头(BAC的质粒,fosmids,或所有的染色质油漆)的范围内,并可以为高通量的自动成像。用这种方法,我们经常探讨核本地化最多三个染色体区域。
DNA荧光原位杂交(DNA FISH)技术允许单个基因位点,亚染色体域,甚至整个染色体的三维可视化在细胞周期的各个阶段。 2D鱼是用于中期研究,而3D鱼已被广泛用于探测空间组织的基因组和功能相间期间(1,2和参考文献)之间的关系。历史上,共同关联的研究进行了通过调查数十至数百个别位点通过FISH。最近强大的高通过3C 4C和Hi-C为基础的技术,例如已开发3,允许调查成千上万的不同位点的分子之间的串扰。基于3C技术和DNA鱼虽然可以互补的方法,他们不回答相同的问题。基于3C的方法提供了混合细胞群的组合读出的,从而在概率性合作协会。相比之下,尽管吞吐量低,鱼为基础的技术分析或单个细胞中的染色体位点的空间安排,根据其发育或细胞周期不同阶段提供了可能性。因此,FISH将继续是一个重要的工具,用于探测核结构与功能的关系。
有两个主要的考虑,执行成功的3D鱼实验。这些是1。获得最佳标记探针和2。选择细胞的治疗方法,包括固定,预处理和后杂交步骤,尽可能多地保存核形态,同时充分地获得的DNA探针杂交。高效的探针标记的鱼是非常重要的。传统上,已被用于引入缺口转译的半抗原或荧光标记的核苷酸4。同样,商业缺口平移套件可用于直接半抗原或荧光成立,BU吨也为两个步骤的标签使用的氨基烯丙基核苷酸和胺的反应性染料。后者呈现染料掺入DNA聚合酶一个体积不大分子,工作更有效率。最近,已开发的非酶标记的DNA的试剂盒,利用协调结合的铂的核酸。甚至可以将已经购买的标号为5的FISH探针。虽然包和商业化生产的探针毫无疑问给易用性,他们是相当昂贵的比买的各个组件和生产内部的探头。我们优化一个低成本的缺口翻译协议,以直接标示许多不同的BAC探针多种颜色。我们发现,获得高纯度的BAC DNA,是至关重要的,结果在规定只有10-20纳克的探针每FISH滑动,而到第10 – 20倍使用不纯的模板DNA时,导致主要的成本和时间积蓄。使用氨基allyldUTP的允许灵活的标签探头可用胺的活性染料( 例如的Alexa Fluor或CY-染料),或半抗原( 如生物素,地高辛)。半抗原标记的探针检测扩增并可视化的信号的荧光团标记的抗体或抗生蛋白链菌素。明亮的直接标记探针一般背景染色少,避免过度放大的信号,从而导致在一个更准确的陈述核本地化和轨迹形态。
鱼有几种不同的技术,使用不同的固定剂,前处理,杂交后洗,但这些一般分为以下类别:戊二醛固定用NaOH变性,变性与盐酸甲醛固定,热变性和甲醛固定6-9 。其中每一个都有优点和缺点。戊二醛固定核结构保存好结果,但需要与还原剂,以尽量减少治疗产生的自发荧光,和NaOH处理需要严格控制,以平衡足够的DNA变性和潜在的损害核结构6。甲醛固定少强,给人扰动核架构的可能性增加,但通常也更强大和更可靠的信号和较低的自体荧光9。 HCl处理depurinates出蛋白质的DNA和钢带的DNA探针提供良好的访问,但也可能引入DNA断裂。暖气物理上分开的两条DNA链产生良好的目标杂交和强烈的信号,但可能会导致一些扰动核结构8。在何种程度上这些技术的每一个影响蛋白的抗原表位的广泛变化6,9,从而在规定的试验方法来测定每个蛋白免疫FISH实验中使用最佳的协议。
虽然没有“完美”的DNA FISH TEchnique,他们都可以是有用的,如果得到很好的控制。我们的目标是优化稳定性和重复性DNA鱼的协议,调查在各种细胞类型10多个位点的空间定位,专注于加热的方法最可靠的信号。这个问题,以及自动成像系统的使用中,我们旨在增加通过单细胞分析的核安排。
3D DNA鱼已成为一种被广泛认可的工具,分析空间安排在细胞核内。而鱼提供视觉和直接的结果,每一项技术,人们需要意识到它的局限性。 DNA FISH面临的固有的问题,即相对苛刻的治疗是必要的,使染色质访问最终破坏核结构非常的事,要分析的FISH探针。几个战略已经追求玩花样无障碍和结构保存。在这里描述的协议中,染色体DNA冻融透化细胞和热变性的探针杂交前访问。 solovei, 等人,(2002)类似处理后的结构变化进行了分析,并发现,染色质域的平均位移量为300nm,这限制了分辨率的结构分析,以大约1 Mb的区域,基因组中的8。虽然这是它的分辨率不高,分析核位置的是一个合理的规模。
FISH分析是一个更实际的考虑,图像采集和核距离的测量耗时的过程,限制核的数目,可以分析。为了研究我们的目的是做高通量自动化成像的偶发事件。然后,用合适的控制措施,可以足够数量相比,允许强大的统计分析,空间关系。我们经常600原子核每个数据点,我们确定所有的鱼的三维坐标核体积内的信号进行分析。这些数据需要很少的存储空间,并允许分析间等位基因间的距离,在以后的任何点或径向位置。此外,自动化的处理是可以做到的研究员盲目的无意识的偏见的可能性大大降低。
为了使这种高通量分析产品的是,我们的目标是建立一个快速,高效的方式进行DNA鱼。我们发现,这里描述的协议是极其强大的,持续生产低背景明亮的信号。它的工作为所有类型的细胞,我们试图提供适应的步骤将细胞的幻灯片。此外,有一个例外,所有我们使用的BAC的可以变成明亮探头。我们还成功地检测到细胞核蛋白抗体染色后的DNA鱼。虽然这行之有效的一些蛋白质,我们建议比较与传统的免疫荧光法(IF),IF和DNA免疫FISH(比较11)之间的抗体染色模式,以确保一致性。
一般地,我们发现,在不同颜色的标记的探针产生了相同的结果。然而,选择标记染料时,应考虑以下几个方面。首先,需要的颜色的荧光以及检测在显微镜uSED。其次,由荧光团发射的光的波长应该有足够的不同,通过到其他信道,以避免出血。这将取决于在显微镜上的过滤器。第三,至少在我们的手中,某些颜色产生明亮的信号比其他人更一致。我们一直用DAPI(蓝色)作为染液的Alexa Fluor 555(红色),488(绿色),647(远红)不错的选择标记探针。随着我们的成像系统中,我们发现的Alexa Fluor 555(红色),产生明亮的信号,随后的Alexa Fluor 488(绿色)。的Alexa Fluor 647(远红)有一个缺点,它不能被人眼检测到,因此,没有信号,可以看出,当俯视显微镜。因此,如果做两色的鱼,我们推荐相结合的红色和绿色染料。
两个主要的问题可能产生于:洗去幻灯片和弱信号的细胞。以及细胞如何坚持到幻灯片是巨大的变量的逻辑之间EEN类型的细胞,和最好的协议来解决/种子细胞需要确定。我们已经成功地使用,也可以正电或聚-L-赖氨酸涂层幻灯片(买现成使用),但发现细胞一般坚持更好地聚-L-赖氨酸涂层幻灯片。我们还发现,当细胞剥离如纸,过于密集的整个地区将受阻,而自动成像细胞过于稀疏。因此,如果样品是不是太珍贵了,不同的手机号码,应接种以确定理想的密度。如果细胞,尤其容易洗掉,疏水性阻挡笔可以被使用,并仔细吹打直接到幻灯片上的解决方案,可以通过FISH步骤。移液也大大减少了所需的试剂量,但需要相当长的时间在做多张幻灯片。
弱信号通常是由于较差的探头,并做出好的投资时间,这是非常值得的。清洁BAC DNA应使用d为起始原料,可以通过以下方式获得反复沉淀或市售的试剂盒。细菌基因组DNA的污染造成负面影响探针的质量和期间小心处理的细胞裂解,细胞裂解物的过滤是必需的,以保持它在最低限度。然而,这是没有必要的使用核酸外切酶消化线性DNA的步骤,因为这大大降低了收率。有效的标记的探针是至关重要的。这一步是最重要的质量控制检查的片段大小缺口翻译后(见代表性的成果)。一个'好'抹黑几乎总是导致在鲜艳的探头。不过,我们已发现,偶尔目标BAC不能加工成一个很好的探针,和不同的BAC需要选择。另一个重要步骤是热变性。如果温度过低,DNA将仅部分变性的探针杂交将受到损害。如果温度过高,核结构的无线网络扰动会超过必要的。在我们手中,78℃下在一个倒置的热块了理想的折衷方案,但是这可能取决于在使用各自的热块。
我们有很好的结果使用安装介质Vectashield,但是发现,黄金SlowFade有较少的背景,并保留更长的荧光信号。硬设置安装介质,因为我们发现这影响的三维结构,并形成气泡,随着时间的推移,我们不建议使用。
最后,明亮的荧光直接标记的探针与DNA的FISH这里描述的协议提供坚固的快速分析的核的结构,适用于各种各样的生物学问题的一个有效的解决方案。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由BBSRC和威康信托基金会资助。我们要感谢西蒙·沃克援助与成像和费利克斯·克鲁格与生物信息学分析的帮助。
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
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