우리가 직접 라벨 형광 프로브를 사용하여 3D DNA 물고기에 의해 핵 구조를 분석하기위한 강력하고 다양한 프로토콜을 설명합니다.
3D DNA 물고기 핵의 3 차원 조직을 분석하는 중요한 도구가되고 있으며, 기술의 여러 가지 변화는 출판되었습니다. 이 문서에서 우리는 견고성, 재현성, 사용의 용이성을 위해 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 밝은 형광 직접 레이블이 프로브는 염료의 화학 결합에 의해 다음 아미노 allyldUTP 닉 – 번역에 의해 생성됩니다. 3 차원 DNA 물고기는 세포 permeabilization에 대한 동결 융해 단계 및 프로브와 핵 DNA의 동시 변성 가열 단계를 사용하여 수행됩니다. 프로토콜은 세포 유형의 범위 및 프로브의 다양한 (세기관지, 플라스미드, fosmids, 또는 전체 염색체 페인트)에 적용하고 높은 처리량 자동으로 이미징 할 수 있습니다. 이 방법으로 우리는 정기적으로 세 염색체 지역 최대의 핵 지방화를 조사합니다.
제자리 교잡에있는 DNA 형광 (DNA 물고기)는 세포주기의 모든 단계에서 각각의 유전자 좌위, subchromosomal 도메인, 심지어 전체 염색체의 3 차원 시각화 할 수 있습니다. 3D 물고기 광범위 계면 동안 게놈과 그 기능의 공간적 조직 (내부 1,2 참조) 사이의 관계를 조사하기 위해 사용하고있는 동안 2D FISH는 중기 연구에 사용됩니다. 역사적으로, 공동 협회 연구는 FISH에 의한 개별 유전자좌의 수백 수만을 조사하여 수행되었다. 이러한 4C와 Hi-C와 같은보다 최근 강력한 높은 처리량 3C-기반 기술은 서로 다른 유전자 좌의 수천 분자 사이 크로스 토크의 조사를 허용, 3 개발되었습니다. 3C 기반 기술과 DNA 물고기 보완 방법이 될 수 있지만, 그들은 반드시 같은 질문에 대답하지 않습니다. 3C 기반 방법은 능성이 결과, 혼합 세포 인구의 앙상블 판독을 제공합니다공동 연관들에 대한 ITY. 대조적으로, 처리량이 낮은 반면, 생선, 기반 기술은 발달이나 세포주기 단계에 따라 각각의 세포에있는 유전자 좌 또는 염색체의 공간 배열을 분석 할 수있는 가능성을 제공합니다. 따라서, 생선, 핵 구조 기능 관계를 프로빙을위한 중요한 도구가 될 것입니다.
성공적인 3D FISH 실험을 수행하는 두 가지 주요 고려 사항이 있습니다. 이들은, 1. 최적 표시된 프로브 및 2를 획득. 고정, 사전 및 사후 하이브리드 단계, 프로브 하이브 리다이 제이션에 대한 충분한 접근 DNA를하는 동안 최대한의 핵 형태를 보존하는 등 세포 치료의 선택. 효율적인 프로브 레이블은 물고기 매우 중요합니다. 전통적으로, 닉 – 번역 hapten 또는 형광 – 복합 뉴클레오티드 4 중 하나를 소개하는 데 사용되었습니다. 마찬가지로, 상업 흠 변환 키트는 직접 hapten 또는 형광 법인, 부 사용할 수 있습니다T는 또한 두 단계 라벨링 aminoallyl 세포핵과 아민 반응성 염료를 사용하여. 후자는 DNA 중합 효소에게 작업 할 적은 부피가 큰 분자를 제공하여보다 효율적인 염료 법인을 렌더링합니다. 최근에는 DNA의 비 효소 라벨링 키트는 핵산에 백금 배위 결합을 악용하는 개발되었다. FISH 프로브는도 이미 5 표시 구입할 수 있습니다. 키트 및 상업적으로 제조 된 프로브 의심의 여지가 사용 편의성을 제공하지만, 그들은 상당히 사내 프로브를 개별 구성 요소를 구입하고 생산보다 더 비싸다. 우리가 직접 여러 색상의 다양한 BAC 프로브 레이블을하기 위해 저렴한 비용으로 닉 번역 프로토콜을 최적화. 우리는 고순도의 BAC의 DNA를 얻는 것은 10에 비해, FISH 슬라이드 당 프로브의 10-20 NG에 대한 요구 사항에 중요하고 결과임을 발견 – 20 배 더 불순한 템플릿 DNA를 사용하는 경우, 주요 결과 비용과 시간 비용 절감. 아미노 allyldUTP의 사용은 유연하게 표시 할 수 있습니다가능 아민 반응성 염료 (예 : 알렉사 플 루어 나 사이프러스 염료) 또는 haptens (예 : 비오틴, digoxigenin)를 검색합니다. Hapten – 라벨 프로브는 신호를 증폭하고 시각화하는 형광 – 복합 항체 또는 스트렙 타비 딘에 의해 감지됩니다. 밝은 직접적으로 표시된 프로브는 일반적으로 적은 배경 염색을 표시하고 따라서 핵 현지화 및 궤적 형태의보다 정확한 표현의 결과로, 신호에 증폭을 피할 수 있습니다.
NaOH를 변성, 염산 변성과 포름 알데히드 고정과 글루 타르 알데하이드 고정, 열 변성과 포름 알데히드 고정 6-9 : 다른 고정액 사전 처리 및 사후 하이브리드 세척을 사용할 수는 있지만 일반적으로 다음과 같은 범주에 속하는 여러 가지 FISH 기법이 있습니다 . 이러한 각각의 장점과 단점이 있습니다. 글루 타르 알데하이드 고정 좋은 핵 구조 보존 결과,하지만 최소화하기 위해 환원제 치료를 필요로그 결과자가 형광과 NaOH를 처리 신중하게 충분한 DNA 변성 및 핵 구조 6 잠재적 인 손상의 균형을 조절해야합니다. 포름 알데히드 고정 핵 구조의 교란의 증가 가능성을주고, 덜 강력한뿐만 아니라, 일반적으로보다 강력하고 안정적인 신호와 9자가 형광 낮은 제공. 염산 처리는 프로브 DNA에 좋은 액세스를 제공, 단백질 아웃 DNA 및 스트립을 depurinates뿐만 아니라, DNA 나누기를 소개 할 수 있습니다. 난방 물리적으로 좋은 대상 하이브리드 및 강한 신호의 결과 두 DNA 가닥을 분리하지만, 핵 구조 8 일부 교란을 일으킬 수 있습니다. 이러한 기술 각각의 단백질 항원에 미치는 영향의 정도는 실험적으로 각 단백질의 면역 FISH 실험에 사용할 최적의 프로토콜을 결정하기 위해 요구 사항의 결과로 널리 6,9 다릅니다.
더 '완벽한'DNA FISH 테는 없지만잘 조절하면 chnique, 그들은 모두 유용 할 수 있습니다. 우리의 목표는 가장 안정적인 신호 가열 방법에 초점을 맞추고, 세포 유형 10의 다양한 여러 유전자좌의 공간적 위치를 조사하기 위해 강력하고 재현 DNA 물고기에 대한 프로토콜을 최적화 할 수 있었다. 이것과 자동화 영상 시스템의 사용으로 우리는 핵 협정의 단일 세포 분석을위한 처리량을 증가 목표.
3D DNA 물고기 핵에 공간 배열을 분석 할 수있는 널리 인정 도구가되고있다. 물고기와 같은 모든 기술로, 시각 및 직접 결과를 제공하지만, 하나는 그 한계를 인식해야합니다. DNA 물고기는 상대적으로 가혹한 치료가 궁극적으로 분석하는 핵 구조 매우 일을 방해 FISH 프로브에 대한 염색질에 액세스 할 수 있도록하는 데 필요한 것을 고유의 문제에 직면 해있다. 몇 가지 전략은 접근성과 구조 보존을 저글링을 추구하고 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 염색체 DNA는 프로브 하이브 리다이 제이션 이전 셀과 열 변성의 동결 – 해동 permeabilization에 의해 접속이 가능합니다. Solovei, 외., (2002)과 유사한 치료 후 구조 변화를 분석하고 염색질 영역의 평균 변위 게놈 8 대략 1 메가 지역에 구조 해석의 해상도를 제한 300 나노 것으로 나타났습니다. 이 고해상도하지 않지만,핵의 위치를 분석하기위한 적절한 규모이다.
FISH 분석을위한보다 실용적인 고려 사항은 해당 이미지 수집 및 원자력 거리의 측정 분석 할 수있는 핵의 수를 제한 시간이 많이 소요되는 프로세스입니다 수 있습니다. 우리는 높은 처리량 자동화 이미징을 수행 할 목적으로 간헐적 이벤트를 연구하기 위하여. 그런 장소에 적절한 컨트롤, 충분한 숫자는 공간 관계의 강력한 통계 분석을 할 수 있도록 비교할 수 있습니다. 우리는 일상적으로 우리가 핵 볼륨 내의 모든 FISH 신호의 3D 좌표를 결정하는 데이터 포인트 당 600 핵을 분석합니다. 이러한 데이터는 매우 적은 저장 공간을 필요로 간 및 내부 대립 유전자 거리, 및 모든 상위 지점에서 반경 위치의 분석을 할 수 있습니다. 또한, 자동화 된 처리가 매우 무의식적 편견의 가능성을 감소 연구원 블라인드 방식으로 수행 할 수 있습니다.
높은 처리량 분석가의이 종류를 설정하려면우리의 목표는 DNA 물고기를 수행하는 빠르고 효율적인 방법을 확립하는 것이었다됩니다. 우리는 프로토콜이 지속적으로 낮은 배경으로 밝은 신호를 생산하는 매우 강력한 것으로 여기에 설명하였습니다. 그것은 우리가 슬라이드에 세포를 부착하는 단계를 맞게 제공하려고 모든 세포 유형했다. 또한, 한 가지 예외를 제외하고, 우리가 사용하는 모든 세기관지는 밝은 프로브로 전환 할 수 있습니다. 우리는 또한 성공적으로 DNA 물고기 후 항체 염색 핵 단백질의 숫자를 발견했다. 이 잘 작동 몇 가지 단백질 동안, 우리는 IF 및 DNA 면역 물고기 (11 비교) 사이의 항체 염색 패턴의 일관성을 유지하기 위해 기존의 면역 (IF)와 비교를 추천합니다.
일반적으로, 우리는 서로 다른 색으로 표시된 프로브는 동일한 결과를 생산 것을 발견했다. 라벨 염료를 선택할 때 단, 다음과 같은 측면이 고려되어야한다. 첫째, 형광의 색깔은 현미경 U에 의해 잘 감지해야SED. 둘째, 형광에 의해 방출되는 빛의 파장은 다른 채널로 통해 출혈을 피하기 위해 충분히 달라야합니다. 이 현미경의 필터에 따라 달라집니다. 셋째, 적어도 우리 손에, 약간 색이 더 일관되게 다른 사람보다 밝은 신호를 생성한다. 우리는 항상 프로브를 라벨링 좋은 선택을 알렉사 플 루어 555 (빨강), 488 (녹색)를 만드는 counterstain으로 DAPI를 (파란색)를 사용하고, 647 (먼 빨간) 있습니다. 우리의 영상 시스템으로, 우리는 알렉사 플 루어 488 (녹색) 다음에 밝은 신호를 생성하는 알렉사 플 루어 555 (빨강)를 발견했다. 알렉사 플 루어 647 (지금까지 적색)은 인간의 눈으로 감지 할 수없고 현미경을 찾을 때 따라서 신호가 볼 수없는 것이 단점이있다. 두 가지 색 물고기를하는 경우 따라서, 우리는 빨간색과 녹색 염료의 조합을 추천합니다.
두 가지 주요 문제가 발생할 수 있습니다 : 셀 슬라이드 약한 신호를 씻어. 또한 세포가 슬라이드에 부착하는 방법은 상당히 변수 betw입니다een과 세포 유형, 세포가 결정해야 / 씨앗을 해결하는 최선의 프로토콜입니다. 우리는 성공적으로 사용하고 하나 양전하 또는 폴리-L-라이신 코팅 슬라이드 (사용할 준비가 구입 한), 그러나 세포는 일반적으로 폴리-L-라이신 코팅 된 슬라이드에 잘 부착하였습니다. 우리는 또한 세포가 자동으로 영상을 방해 한 반면 너무 조밀 전체 영역, 시트로 벗겨 것 하였을 때 세포가 너무 부족한한다면 것으로 나타났습니다. 샘플이 너무 귀중하지 않은 경우, 따라서 다른 세포 수는 이상적인 밀도를 결정하기 위해 시드해야합니다. 세포가 씻어 특히 경향이있는 경우, 소수성 장벽 펜을 사용할 수 있습니다, 그리고 물고기 단계를주의 깊게 슬라이드에 직접 솔루션을 pipetting하여 수행 할 수 있습니다. 피펫은 크게 필요한 시약의 양을 줄일 수 있지만, 여러 슬라이드를 할 때 상당히 오래 걸립니다.
약한 신호는 일반적으로 가난한 프로브로 인해, 그리고 그것은 좋은 사람을 만들기에 시간을 투자 할 가치입니다. 청소 BAC DNA 사용되어야한다반복 침전 또는 시판 키트에 의해 얻을 수있는 재료를 시작으로 라. 세균의 게놈 DNA의 오염에 부정적인 세포 용해 동안 프로브의 품질과 취급에주의에 영향을 미치는 세포 lysate를 필터링은 최소로 유지하기 위해 필요합니다. 이 크게 수율을 감소시키기 때문에 그것은, 그러나, 선형 DNA를 소화하는 exonuclease 단계를 사용할 필요가 없습니다. 프로브의 효율 라벨이 매우 중요합니다. 이 단계에서 가장 중요한 품질 관리 (대표 결과를 참조) 닉 번역 후 단편 크기를 확인합니다. '좋은'얼룩은 거의 항상 밝은 색깔의 프로브가 발생합니다. 그러나, 우리는 때때로 특정 BAC가 좋은 프로브로 처리하고 다른 BAC를 선택해야 할 수 없다는 것을 발견했다. 또 다른 중요한 단계는 열 변성이다. 온도가 너무 낮 으면, DNA는 부분적으로 변성되며 프로브 하이브 리다이 제이션이 손상됩니다. 온도가 너무 높은 경우, 핵 구조 위스콘신필요 이상을 교란 할 것이다. 우리 손에, 거꾸로 핫 블록에 78 ° C는 이상적인 타협이다, 그러나 이것은 사용 된 각각의 핫 블록에 따라 달라질 수 있습니다.
우리는 Vectashield 설치 매체를 사용하여 좋은 결과를했지만, SlowFade 골드가 적은 배경을 가지고 있으며, 이상에 대한 형광 신호를 보존 것으로 나타났습니다. 우리는이 차원 구조에 영향을 미치는 시간이 지남에 공기 방울을 형성하는 발견으로 우리는 열심히 세트 설치 매체의 사용을 권장하지 않습니다.
결론적으로, 여기에 설명 된 DNA 물고기 프로토콜과 함께 밝은 형광 직접 레이블이 프로브는 생물 학적 질문의 다양한 적용됩니다 핵 아키텍처의 강력하고 신속한 분석을위한 효율적인 솔루션을 제공합니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 BBSRC와 웰컴 트러스트 (Wellcome Trust)에 의해 투자되었다. 우리는 생물 정보학 분석과 도움을 영상과 펠릭스 크루거에 대한 지원은 사이먼 워커에게 감사의 말씀을 전합니다.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
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