Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.
PEIXES 3D DNA tornou-se uma ferramenta importante para a análise de organização tridimensional do núcleo, e várias variações da técnica têm sido publicados. Neste artigo descrevemos um protocolo que foi otimizado para robustez, reprodutibilidade e facilidade de uso. Brilhantemente fluorescentes directamente as sondas marcadas são gerados por nick-translation com amino-allyldUTP seguido por acoplamento químico do corante. 3D ADN FISH é realizada utilizando um passo de congelamento-descongelamento para permeabilização celular e um passo de aquecimento para a desnaturação simultânea de sonda e o DNA nuclear. O protocolo é aplicável a uma variedade de tipos de células e uma variedade de sondas (BACs, plasmídeos, fosmids ou tintas cromossoma inteiro) e permite a imagiologia automatizado de alto débito. Com este método rotineiramente investigar a localização nuclear de até três regiões cromossómicas.
DNA de hibridização in situ de fluorescência (FISH ADN) permite a visualização tridimensional de loci de genes individuais, domínios subcromossómico e cromossomas inteiros, mesmo durante todas as fases do ciclo celular. PEIXES 2D é utilizado para estudos FISH metafase enquanto 3D tem sido extensivamente utilizado para sondar a relação espacial entre a organização do genoma e a sua função durante a interfase (1,2 e referências citadas). Historicamente, os estudos de co-associação foram realizadas por investigar dezenas a centenas de loci individuais por FISH. Mais recentemente poderoso de alto rendimento com base em técnicas tais como 3C 4C e Hi-C foram desenvolvidos três, permitindo que a investigação das molecular conversa cruzada entre os muitos milhares de diferentes loci. Embora as técnicas baseadas em 3C e FISH DNA podem ser métodos complementares, que não necessariamente responder as mesmas perguntas. Métodos baseados em 3C proporcionar uma leitura de conjunto de populações de células misturadas, resultando numa probabildade de co-associações. Por outro lado, enquanto a baixa no rendimento, técnicas de base de peixe oferecem a possibilidade de analisar arranjos espaciais de loci ou cromossomos nas células individuais de acordo com as suas fases do ciclo de desenvolvimento ou celular. Assim, FISH continuará a ser uma importante ferramenta para sondar relações estrutura-função nucleares.
Há duas considerações importantes na realização de experiências bem-sucedidas Fish 3D. Estes são: 1. obtenção de sondas marcadas optimamente e 2. escolha de tratamentos celulares, incluindo fixação, pré-e pós-passos de hibridação, para preservar a morfologia nuclear, tanto quanto possível, ao mesmo tempo que o DNA suficientemente acessível para hibridação da sonda. Eficiente rotulagem sonda é criticamente importante para os peixes. Tradicionalmente, a nick-translation foi usado para introduzir ou hapteno ou nucleótidos fluoróforos 4. Da mesma forma, kits nick-tradução comerciais estão disponíveis para hapten direta ou incorporação fluorophore, but também para duas etapas de marcação utilizando nucleótidos aminoallyl e corantes reactivos com amina. Este último torna corante incorporação mais eficiente, dando uma molécula de ADN-polimerase menos volumoso para trabalhar. Mais recentemente, a kits para a rotulagem não enzimática do DNA têm sido desenvolvidos, que exploram ligação coordenativa de platina para os ácidos nucleicos. Sondas de peixe pode até ser comprado já com o 5. Enquanto kits e sondas fabricadas comercialmente sem dúvida dar a facilidade de uso, eles são consideravelmente mais caro do que comprar os componentes individuais e produzir sondas em casa. Nós otimizamos um nick protocolo tradução de baixo custo, a fim de marcar diretamente diversos sondas BAC em várias cores. Nós descobrimos que a obtenção de ADN BAC de elevada pureza é importante e resulta num requisito de que apenas 10-20 ng de sonda por lâmina FISH, ante de 10 – 20 vezes mais quando o ADN molde impuro é usado, resultando num maior custo e tempo- poupança. A utilização de amino-allyldUTP permite rotulagem flexívelsondas com amina disponíveis corantes reactivos (por exemplo, Alexa Fluor ou CY-corantes) ou haptenos (por exemplo, biotina, digoxigenina). Sondas de hapteno-marcadas são detectadas por anticorpos fluoróforos ou estreptavidina para amplificar o sinal e visualizar. Sondas marcadas directamente brilhantes mostram geralmente menos a coloração de fundo e evitar o excesso de amplificação de sinais, daí resultando uma representação mais precisa da localização nuclear e morfologia lócus.
Existem várias técnicas diferentes peixes que usam diferentes fixadores, pré-tratamentos e lavagens pós-hibridação, mas estes geralmente se enquadram nas seguintes categorias: fixação de glutaraldeído com NaOH desnaturação, fixação em formol com HCl desnaturação e fixação em formol com desnaturação 6-9 . Cada um destes tem vantagens e desvantagens. Glutaraldeído resultados de fixação em bom estado de conservação estrutural nuclear, mas necessita de tratamento com agentes redutores para minimizara autofluorescência resultante, tratamento com NaOH e deve ser cuidadosamente controlado para equilibrar a desnaturação do ADN suficiente e dano potencial a estrutura nuclear 6. Fixação em formol é menos forte, dando uma maior probabilidade de perturbações da arquitetura nuclear, mas também geralmente com sinais mais fortes e mais confiáveis e menores autofluorescência 9. HCl tratamento depurinates DNA e tiras fora proteínas, proporcionando um bom acesso ao DNA para as sondas, mas também pode apresentar quebras de DNA. Aquecimento separa fisicamente as duas fitas de DNA, resultando em boa hibridização alvo e sinais fortes, mas pode causar alguma perturbação da estrutura nuclear 8. O grau em que cada uma destas técnicas afecta epitopos da proteína varia amplamente 6,9, resultando na necessidade de determinar experimentalmente para cada proteína o protocolo ideal para usar em experiências de imuno-peixe.
Embora não haja um 'perfeito' DNA FISH tehaver descrição prévia, todos eles podem ser úteis se forem bem controlados. O nosso objectivo foi o de optimizar um protocolo para robusto e reprodutível PEIXES DNA para investigar o posicionamento espacial dos múltiplos loci em uma variedade de tipos de células 10, incidindo sobre o método de aquecimento para a maioria dos sinais fiáveis. Com esta e a utilização de um sistema de imagem automatizado que visa aumentar a taxa de transferência para a análise de arranjos nucleares de célula única.
FISH DNA 3D tornou-se uma ferramenta amplamente reconhecida para analisar arranjos espaciais no núcleo. Enquanto FISH fornece resultados visuais e direta, como acontece com todas as técnicas, é preciso estar ciente de suas limitações. PEIXES ADN enfrenta o problema inerente que os tratamentos relativamente duras são necessárias para tornar acessível a cromatina sondas FISH que finalmente interrompe-a própria estrutura nuclear coisa que está a ser analisada. Diversas estratégias têm sido perseguidos de conciliar a acessibilidade ea preservação estrutura. No protocolo aqui descrito, o ADN cromossómico é tornada acessível por congelamento-descongelamento a permeabilização das células e desnaturação pelo calor antes da hibridação da sonda. Solovei, et ai., (2002) analisaram as alterações estruturais após tratamento semelhante e verificou que a deslocação média de domínios de cromatina foi de 300 nm, o que limita a resolução da análise estrutural de cerca de 1 Mb regiões no genoma 8. Embora isso não seja alta resolução, eleé uma escala razoável para analisar a posição nuclear.
Uma consideração mais prático para análise FISH é que a aquisição de imagem e as medições de distâncias nucleares são processos demorados que limitam o número de núcleos que podem ser analisados. A fim de estudar os eventos raros que visam fazer imagens de alta taxa de transferência automatizado. Então, com os controlos apropriados no lugar, um número suficiente pode ser comparado para permitir a análise estatística robusta das relações espaciais. Rotineiramente analisar 600 núcleos por ponto de dados para o qual vamos determinar as coordenadas 3D de todos os sinais de peixe dentro do volume nuclear. Esses dados exigem muito pouco espaço de armazenamento e permitir a análise das distâncias inter e intra-alélicas, ou posições radiais em qualquer momento posterior. Além disso, o processamento automatizado pode ser feito de uma maneira cega investigador que reduz grandemente a probabilidade de polarização inconsciente.
Para habilitar este tipo de analys de alto rendimentoé, nosso objetivo foi o de estabelecer uma maneira rápida e eficiente de realizar FISH DNA. Encontramos o protocolo descrito aqui para ser extremamente robusto, de forma consistente a produção de sinais luminosos, com baixo fundo. Ela trabalhou para todos os tipos de células que tentaram desde que adaptado a etapa de fixação das células para o slide. Além disso, com exceção de uma, todas as BACs que usamos poderia ser transformado em sondas brilhantes. Temos também detectado com êxito um certo número de proteínas nucleares por coloração de anticorpos após ADN FISH. Enquanto para algumas proteínas Isso funciona bem, recomendamos comparação com a imunofluorescência tradicional (IF) para garantir a consistência do padrão de coloração de anticorpos entre IF e DNA imuno FISH (compare 11).
Geralmente, verificou-se que as sondas marcadas com cores diferentes produziu os mesmos resultados. No entanto, os seguintes aspectos devem ser considerados ao escolher a tinta rotulagem. Primeiro, a cor do fluoróforo deve ser bem detectável pelo u microscópiosed. Em segundo lugar, o comprimento de onda da luz emitida pelos fluoroforos deve ser suficientemente diferente para evitar sangramento através do canal para o outro. Isto irá depender dos filtros no microscópio. E em terceiro lugar, pelo menos em nossas mãos, algumas cores produzir sinais luminosos de forma mais consistente do que outros. Nós sempre usaram DAPI (azul) como um contrastante que faz Alexa Fluor 555 (vermelho), 488 (verde) e 647 (muito vermelho) boas opções para marcação de sondas. Com o nosso sistema de imagens, encontramos Alexa Fluor 555 (vermelho) para produzir os sinais mais brilhantes, seguidos por Alexa Fluor 488 (verde). Alexa Fluor 647 (vermelho longínquo) tem a desvantagem de que não pode ser detectada pelo olho humano e, portanto, não há sinais pode ser visto quando se olha através do microscópio. Assim, se fazendo FISH duas cores, recomendamos a combinação de corantes vermelhos e verdes.
Podem surgir dois problemas principais: células lavando os slides e sinais fracos. Como as células também aderir ao slide é entr extremamente variáveltipos de células een, eo melhor protocolo para resolver / seed as células precisa ser determinado. Nós utilizamos com sucesso, quer carregados positivamente ou poli-L-lisina lâminas revestidas (comprado pronto a utilizar), mas foram encontradas células geralmente adere melhor à poli-L-lisina lâminas revestidas. Descobrimos também que, quando as células eram muito densas áreas inteiras seria descascar como uma folha, enquanto imagem automatizada foi prejudicada se as células eram muito escassos. Assim, se a amostra não for muito precioso, diferentes números de células deveriam ser semeadas para determinar a densidade ideal. Se as células são particularmente propensas a lavar, uma caneta de barreira hidrofóbica pode ser usado, e os passos de peixe pode ser realizada por pipetagem cuidadosa soluções directamente sobre a lâmina. Pipetagem também reduz drasticamente os volumes de reagentes necessários, mas leva muito mais tempo ao fazer vários slides.
Sinais fracos são geralmente devido a sondas pobres, e vale a pena investir tempo em fazer bons. Limpo DNA CCB deve ser usard como material de partida, que pode ser obtido por precipitação repetida ou kits disponíveis comercialmente. A contaminação com ADN genómico bacteriano afecta negativamente a qualidade da sonda e tratamento cuidadoso durante a lise celular e de filtragem do lisado de células é necessária para mantê-lo a um nível mínimo. É, no entanto, não é necessário usar um passo de digestão com exonuclease de ADN linear, como esta reduz grandemente o rendimento. Rotulagem eficiente da sonda é crucial. O controle de qualidade mais importante para esta etapa é verificar o tamanho do fragmento após a tradução nick (ver resultados representativos). A 'boa' smear quase sempre resultam em uma sonda de cor viva. No entanto, verificou-se que, ocasionalmente, uma certa BAC não pode ser transformado em um bom sonda, e uma TAS diferente deve ser escolhido. Outro passo importante é a desnaturação pelo calor. Se a temperatura for demasiado baixa, o ADN será apenas parcialmente desnaturada e hibridação da sonda será prejudicada. Se a temperatura for demasiado elevada, a estrutura nuclear wivai ser perturbado mais do que o necessário. Nas nossas mãos, 78 ° C sobre um bloco quente invertida é o compromisso ideal, mas isto pode variar, dependendo do respectivo bloco quente utilizado.
Temos tido bons resultados usando meio de montagem Vectashield, mas descobriu que SlowFade Gold tem menos fundo e preserva o sinal fluorescente por mais tempo. Nós não recomendamos o uso de hard-set meio de montagem como descobrimos isso afetar a estrutura 3D e formar bolhas de ar ao longo do tempo.
Em conclusão, brilhantemente fluorescentes directamente sondas marcadas em conjunto com o protocolo de ADN FISH aqui descrito oferecem uma solução eficaz para a análise robusta e rápida da arquitectura nuclear, que é aplicável a uma ampla variedade de questões biológicas.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo BBSRC eo Wellcome Trust. Gostaríamos de agradecer Simon Walker para a assistência com imagem e Felix Krueger para obter ajuda com a análise bioinformática.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
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