Wir beschreiben eine robuste und vielseitige Protokoll zur Analyse von 3D-Kern Architektur DNA FISH mit direkt markierten fluoreszierenden Sonden.
3D FISH DNA hat sich zu einem wichtigen Instrument für die Analyse dreidimensionale Organisation des Zellkerns, und einige Variationen dieser Technik wurden veröffentlicht. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll, das für Robustheit, Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit optimiert wurde. Hell fluoreszierende direkt markierten Sonden durch Nick-Translation mit Amino-allyldUTP durch chemische Kopplung des Farbstoffes gefolgt erzeugt. 3D DNA FISH unter Verwendung eines Gefrier-Auftau-Schritt für Zellpermeabilisierung und einen Erwärmungsschritt zum gleichzeitigen Denaturierung der Sonde und Kern-DNA. Das Protokoll ist auf einen Bereich von Zelltypen und eine Vielzahl von Sonden (BACs, Plasmide, Fosmide oder ganzes Chromosom Paints) und ermöglicht automatisiertes Hochdurchsatz-Bildgebung. Mit dieser Methode routinemäßig untersucht Kernlokalisation bis zu drei chromosomalen Regionen.
DNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH DNA) erlaubt die dreidimensionale Visualisierung der einzelnen Genorte, subchromosomalen Domains und sogar ganze Chromosomen während allen Phasen des Zellzyklus. 2D-FISH ist für Metaphase Studien verwendet werden, während 3D FISH wurde ausgiebig genutzt worden, um die Beziehung zwischen der räumlichen Organisation des Genoms und seine Funktion während der Interphase (1,2 und Referenzen darin) zu untersuchen. Historisch wurden co-Assoziation Studien untersucht zehn bis Hunderte von einzelnen Stellen durch FISH durchgeführt. In jüngerer Zeit mächtig hohen Durchsatz 3C-basierte Techniken wie 4C und Hallo-C wurden 3 entwickelt, das die Untersuchung von molekularen Übersprechen zwischen vielen tausend verschiedenen loci. Während 3C-basierte Techniken und DNA FISH komplementäre Methoden sein kann, aber nicht zwangsläufig die gleichen Fragen beantworten. 3C basierte Methoden ein Ensemble Auslesen von gemischten Zellpopulationen, was eine Wahrscheinlichkeittung für Co-Verbände. Im Gegensatz dazu, während niedrige Durchsatz bieten FISH Techniken die Möglichkeit, räumliche Anordnungen von Loci oder Chromosomen in einzelnen Zellen entsprechend ihrer Entwicklungs-oder Zellzyklus-Stadien zu analysieren. Daher wird FISH weiterhin ein wichtiges Instrument für die Sondierung nuklearen Struktur-Funktions-Beziehungen.
Es gibt zwei wichtige Überlegungen bei der Durchführung von erfolgreichen 3D-FISH Experimente. Diese sind: 1. Erhalten optimal markierten Sonden und 2. Wahl der zellulären Behandlungen, einschließlich Fixierung, Pre-und Post-Hybridisierung Schritte, um Kernmorphologie so viel wie möglich zu erhalten und gleichzeitig ausreichend DNA zugänglich für Sondenhybridisierung. Effiziente Sondenmarkierung ist von entscheidender Bedeutung für die Fische. Traditionell wurde Nick-Translation verwendet worden, um entweder Hapten oder fluorophorkonjugierten Nukleotide 4 einzuführen. Ebenso sind kommerzielle Nick-Translation-Kits für den direkten Einbau Hapten oder Fluorophor, bu verfügbart auch für zwei-Schritt-Kennzeichnung mit aminoallyl Nukleotide und aminreaktiven Farbstoffe. Letzteres macht Farbstoff Einbau effizienter, indem DNA-Polymerase eine weniger sperrige Molekül, mit zu arbeiten. In jüngerer Zeit sind Kits zur nicht-enzymatischen Markierung von DNA entwickelt worden, die zu nutzen koordinative Bindung von Platin zu Nukleinsäuren. FISH-Sonden können sogar bereits gekauft beschriftet 5 werden. Während Kits und kommerziell hergestellten Sonden keinen Zweifel geben, Benutzerfreundlichkeit, sind sie deutlich teurer als der Kauf der einzelnen Komponenten und Herstellung von Sonden in-house. Wir optimierten eine kostengünstige Nicktranslation Protokoll, um direkt beschriften vielen verschiedenen BAC Sonden in mehreren Farben. Wir entdeckten, dass Gewinnung von hochreinem BAC DNA ist kritisch und führt zu einer Anforderung für nur 10-20 ng Sonde pro FISH Folie im Vergleich zu 10 – 20-fach stärker als unrein template DNA verwendet wird, was erhebliche Kosten-und Zeit- Einsparungen. Die Verwendung von Amino-allyldUTP ermöglicht flexible KennzeichnungSonden mit den verfügbaren aminreaktiven Farbstoffe (zB Alexa Fluor oder Cy-Farbstoffe) oder Haptene (zB Biotin, Digoxigenin). Hapten-markierten Sonden werden von Fluorophor-konjugierte Antikörper oder Streptavidin zu verstärken und zu visualisieren das Signal. Helle direkt markierten Sonden zeigen in der Regel weniger Hintergrundfärbung und vermeiden Sie über-Verstärkung von Signalen, also was eine genauere Darstellung der nuklearen Lokalisation und Morphologie Locus.
Es gibt verschiedene Techniken, die FISH verschiedene Fixative, Vorbehandlungen und Posthybridisierung Wäschen verwenden, aber diese in der Regel in die folgenden Kategorien fallen: Glutaraldehyd Fixierung mit NaOH Denaturierung, Formaldehyd Fixierung mit HCl Denaturierung und Fixierung mit Formaldehyd Hitzedenaturierung 6-9 . Jeder von ihnen hat Vorteile und Nachteile. Glutaraldehyd Fixierung führt zu einer guten nuklearen strukturelle Konservierung, sondern erfordert die Behandlung mit Reduktionsmitteln zu minimierendie resultierende Autofluoreszenz und NaOH Behandlung muss sorgfältig kontrolliert werden, um eine ausreichende DNA Denaturierung und mögliche Schäden an der Kernstruktur 6 auszugleichen. Formaldehydfixierung weniger stark ist, so dass eine erhöhte Wahrscheinlichkeit von Störungen der nuklearen Architektur, sondern auch in der Regel geben stärker und zuverlässiger Signale und niedrigere Autofluoreszenz 9. HCl-Behandlung depurinates DNA und Proteine aus Streifen mit einer guten Anbindung an die DNA für die Sonden, kann aber auch zu DNA-Brüchen. Heizung physisch trennt die beiden DNA-Stränge zu einer guten Zielhybridisierung und starke Signale, kann aber einige Störung der Kernstruktur 8 führen. Das Ausmaß, in dem jede dieser Techniken betrifft Proteinepitope variiert stark 6,9, was in der Forderung, experimentell für jedes Protein die optimale Protokoll in Immuno-FISH Experimente verwenden, fest.
Zwar gibt es keine "perfekte" DNA FISH technique, können sie nützlich sein, wenn alle gut beherrscht. Unser Ziel war es, ein Protokoll für robuste und reproduzierbare DNA FISH Optimierung der räumlichen Position der einzelnen Loci in einer Vielzahl von Zelltypen 10 zu untersuchen, die sich auf die Verfahren zur Erwärmung zuverlässigsten Signale. Damit und mit der Verwendung eines automatisierten Bildgebungssystem Unser Ziel war die Erhöhung der Durchsatz für einzelne Zelle Analyse der atomaren Anordnungen.
3D FISH DNA hat sich zu einem weithin anerkannten Instrument zur räumlichen Anordnungen in den Zellkern zu analysieren. Während FISH bietet visuelle und direkte Ergebnisse, wie bei jeder Technik muss man sich bewusst sein, seine Grenzen. DNA FISH steht das inhärente Problem, dass relativ raue Behandlungen notwendig sind, um Chromatin zugänglich für FISH-Sonden, die letztlich stört Kernstruktur-genau das, was analysiert werden soll. Mehrere Strategien wurden verfolgt, um die Zugänglichkeit und Struktur Erhaltung jonglieren. In dem hier beschriebenen Protokoll wird chromosomale DNA zugänglich gemacht Frost-Tau-Permeabilisierung von Zellen und Hitzedenaturierung vor Sondenhybridisierung. Solovei, et al., (2002) analysiert Strukturveränderungen nach ähnlichen Behandlung und festgestellt, dass die durchschnittliche Verschiebung Chromatindomänen 300 nm, die die Auflösung der strukturellen Analyse beschränkt auf rund 1 Mb Regionen im Genom 8 war. Dies ist zwar nicht hohe Auflösung, esist ein angemessener Maßstab für die Analyse von nuklearen Position.
Eine praktische Überlegung für FISH-Analyse ist, dass die Bildaufnahme und Messungen Kernabstände sind zeitaufwendig Prozesse, die die Anzahl der Kerne, die analysiert werden können, zu begrenzen. Um zu untersuchen, seltene Ereignisse es unser Ziel, einen hohen Durchsatz Automated Imaging tun. Dann mit geeigneten Kontrollen, eine ausreichende Zahl im Vergleich zu für robuste statistische Analyse der räumlichen Beziehungen zu ermöglichen. Wir analysieren routinemäßig 600 Kerne pro Datenpunkt für das bestimmen wir die 3D-Koordinaten aller FISH-Signale innerhalb des nuklearen Volumen. Diese Daten benötigen sehr wenig Speicherplatz und erlauben für die Analyse von inter-und intra-Allel Entfernungen oder radialen Positionen zu einem späteren Zeitpunkt. Darüber hinaus kann die automatisierte Verarbeitung in einem Forscher blinden Weise das reduziert die Wahrscheinlichkeit von unbewussten Bias durchgeführt werden.
Um diese Art von hohen Durchsatz ermöglichen analysist, war es unser Ziel, eine schnelle und effiziente Art und Weise der Durchführung DNA FISH etablieren. Wir fanden das hier beschriebene Protokoll als äußerst robust, konsequent Herstellung helle Signale mit niedrigem Hintergrund. Er arbeitete für alle Zelltypen versuchten wir vorausgesetzt, wir angepasst den Schritt der Befestigung der Zellen auf den Objektträger. Darüber hinaus mit einer Ausnahme konnten alle BACs verwendeten wir in hellen Sonden gedreht werden. Wir haben auch erfolgreich eine Reihe von nuklearen Proteinen durch Antikörper-Färbung nach der DNA-FISH nachgewiesen. Während für einige Proteine dies gut funktioniert, empfehlen wir gegenüber herkömmlichen Immunfluoreszenz (IF), um die Konsistenz der Antikörper-Färbung Muster zwischen IF und FISH DNA Immuno (vgl. 11) zu gewährleisten.
Im Allgemeinen wurde festgestellt, dass Proben in verschiedenen Farben markiert die gleichen Ergebnisse erzielt. Allerdings sollten die folgenden Aspekte berücksichtigt werden, wenn die Wahl der Kennzeichnung Farbstoff werden. Zuerst muss die Farbe des Fluorophors zu gut nachweisbar durch das Mikroskop used. Zweitens sollte die Wellenlänge des Lichts durch die Fluorophore emittiert wird ausreichend verschieden, die das Durchscheinen in dem anderen Kanal zu vermeiden. Dies wird auf den Filtern in dem Mikroskop ab. Und drittens, zumindest in unseren Händen, produzieren einige Farben hell Signale konsequenter als andere. Wir haben immer DAPI (blau) als Gegenfärbung die Alexa Fluor 555 (rot), 488 (grün) macht verwendet, und 647 (ganz rot) eine gute Wahl für die Markierung von Sonden. Mit unseren Imaging-System, fanden wir Alexa Fluor 555 (rot) an die hellsten Signale von Alexa Fluor 488 (grün), gefolgt produzieren. Alexa Fluor 647 (bis rot) hat den Nachteil, dass sie nicht vom menschlichen Auge erkannt werden und somit keine Signale zu erkennen, wenn man sich das Mikroskop werden. Wenn also tun zweifarbige FISH, empfehlen wir die Kombination von roten und grünen Farbstoffe.
Zwei wesentliche Probleme auftreten: Zellen Abwaschen der Dias und schwache Signale. Wie gut Zellen auf den Objektträger haften ist enorm variable zw.een Zelltypen, und das beste Protokoll / Saatgut die Zellen bestimmt werden muss begleichen. Wir haben erfolgreich entweder positiv geladene oder Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger (gekauft gebrauchsfertig), fand aber in der Regel eingehalten Zellen besser auf Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger. Wir haben auch festgestellt, dass, wenn die Zellen zu dicht ganze Landstriche würden abziehen wie ein Blatt, während Automated Imaging wurde behindert waren, wenn die Zellen zu spärlich waren. Somit, wenn die Probe nicht zu wertvoll, sollten unterschiedliche Zellzahlen geimpft, um die ideale Dichte zu bestimmen. Wenn Zellen besonders anfällig zu waschen sind, kann eine hydrophobe Barriere Stift verwendet werden, und FISH Schritte können durch vorsichtiges Pipettieren Lösungen direkt auf den Objektträger durchgeführt werden. Pipettieren auch drastisch reduziert das Volumen der benötigten Reagenzien, aber erheblich länger dauert, wenn dabei mehrere Folien.
Schwache Signale sind in der Regel aufgrund der schlechten Sonden und es lohnt sich zu investieren Zeit in die Herstellung guten. Saubere BAC DNA sollte verwendend als Ausgangsmaterial, das durch wiederholte Fällung oder kommerziell erhältlichen Kits erhalten werden kann. Kontamination mit bakteriellen genomischen DNA Sonde wirkt sich negativ auf Qualität und sorgfältige Behandlung während der Zell-Lyse und Filterung des Zelllysat wird benötigt, um es auf ein Minimum zu halten. Es ist jedoch nicht notwendig, eine Exonuklease-Schritt verwendet, um lineare DNA zu verdauen, da diese stark reduziert Ausbeute. Effiziente Markierung der Sonde ist von entscheidender Bedeutung. Die wichtigste Qualitätskontrolle für diesen Schritt ist die Überprüfung der Fragmentgröße nach Nick-Translation (siehe Repräsentative Ergebnisse). Eine "gute" Abstrich wird fast immer in einem bunten Sonde führen. Allerdings haben wir festgestellt, dass gelegentlich eine gewisse BAC kann nicht in eine gute Sonde verarbeitet werden, und eine andere BAC muss gewählt werden. Ein weiterer wichtiger Schritt ist Hitzedenaturierung. Wenn die Temperatur zu niedrig ist, wird die DNA nur teilweise denaturiert und Sondenhybridisierung beeinträchtigt wird. Wenn die Temperatur zu hoch ist, Kernstruktur will gestört werden mehr als nötig. In unseren Händen ist 78 ° C auf einem inversen heißen Block der idealen Kompromiss, sondern je nach der jeweiligen heißen Block verwendet.
Wir haben gute Ergebnisse mit Vectashield Eindeckmediums, fand aber, dass weniger SlowFade Gold-Hintergrund hat und bewahrt das Fluoreszenz-Signal für länger. Wir empfehlen nicht den Einsatz von Hard-Set Eindeckmediums wie wir diese 3D-Struktur zu beeinflussen und um Luftblasen im Laufe der Zeit bilden gefunden.
Schließlich bieten hell fluoreszierenden direkt markierten Sonden zusammen mit der DNA-FISH hier beschriebene Verfahrensweise eine effiziente Lösung für stabile und schnelle Analyse von nuklearen Architektur, die für eine Vielzahl von biologischen Fragestellungen ist.
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde von der BBSRC und dem Wellcome Trust finanziert. Wir möchten Simon Walker für die Unterstützung danken, mit bildgebenden und Felix Krueger für die Hilfe bei bioinformatische Analyse.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
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