Nous décrivons un protocole robuste et polyvalent pour l'analyse de l'architecture nucléaire par FISH d'ADN 3D à l'aide de sondes fluorescentes directement marqués.
FISH 3D DNA est devenu un outil important pour analyser organisation tridimensionnelle du noyau, et plusieurs variantes de la technique ont été publiés. Dans cet article, nous décrivons un protocole qui a été optimisé pour la robustesse, la reproductibilité et la facilité d'utilisation. Vives fluorescentes sondes directement marqués sont générés par translation de coupure avec des amino-allyldUTP suivie d'un couplage chimique du colorant. FISH d'ADN 3D s'effectue à l'aide d'une étape de congélation-décongélation pour la perméabilisation de cellules et une étape de chauffage pour la dénaturation simultanée de la sonde et de l'ADN nucléaire. Le protocole est applicable à toute une gamme de types de cellules et une variété de sondes (BAC, plasmides, fosmides, ou des peintures chromosomiques entiers) et permet une imagerie automatisé à haut débit. Avec cette méthode, nous étudions systématiquement localisation nucléaire de trois régions chromosomiques.
ADN hybridation in situ fluorescente (FISH d'ADN) permet la visualisation en trois dimensions de locus de gènes individuels, des domaines sous-chromosomique et des chromosomes entiers, même au cours de toutes les phases du cycle cellulaire. FISH 2D est utilisée pour des études métaphase tandis que les poissons 3D a été largement utilisé pour sonder la relation entre l'organisation spatiale du génome et sa fonction durant l'interphase (1,2 et références citées). Historiquement, les études de co-association ont été réalisées en enquêtant sur des dizaines à des centaines de loci individuels par les poissons. Plus récemment puissant techniques 3C basés à haut débit tels que les 4C et Salut-C ont été développés 3, permettant à l'enquête de la biologie moléculaire diaphonie entre des milliers de différents loci. Bien que les techniques 3C basés et les poissons d'ADN peuvent être des méthodes complémentaires, ils ne répondent pas nécessairement aux mêmes questions. Méthodes basées 3C offrent une lecture de l'ensemble des populations de cellules mixtes, ce qui entraîne une probabilitélité pour les co-associations. En revanche, si faible débit, les techniques de base de POISSONS offrent la possibilité d'analyser les dispositions spatiales des lieux ou des chromosomes dans les cellules individuelles en fonction de leurs différentes étapes du cycle de développement ou de la cellule. Par conséquent, FISH continuera d'être un important outil pour sonder les relations structure-fonction nucléaires.
Il ya deux considérations majeures dans la réalisation d'expériences de 3D Fish succès. Ce sont: 1. l'obtention des sondes marquées de manière optimale et 2. choix des traitements cellulaires, y compris la fixation, les étapes de pré-et de post-hybridation, pour préserver la morphologie nucléaire autant que possible tout en faisant ADN suffisamment accessible pour l'hybridation de la sonde. L'étiquetage de la sonde efficace est d'une importance cruciale pour les poissons. Traditionnellement, translation de coupure a été utilisé pour introduire soit haptène ou nucléotides fluorophore conjugué à 4. De même, les kits pseudo-traduction commerciaux sont disponibles pour haptène directe ou l'incorporation des fluorophores, but aussi pour les deux étapes en utilisant l'étiquetage nucléotides aminoallyl et des colorants réactifs aux amines. Ce dernier rend incorporation colorant plus efficace en donnant l'ADN polymérase une molécule moins encombrant pour travailler avec. Plus récemment, des kits pour l'étiquetage non enzymatique de l'ADN ont été développés qui exploitent liaison de coordination de platine aux acides nucléiques. sondes FISH peuvent même être achetés déjà marqué 5. Alors que les kits et les sondes fabriquées commercialement sans doute donner la facilité d'utilisation, ils sont nettement plus cher que d'acheter les composants individuels et la production de sondes en interne. Nous avons optimisé un protocole à faible coût nick de traduction afin de marquer directement plusieurs sondes BAC en plusieurs couleurs. Nous avons découvert que l'obtention d'ADN de BAC très pur est essentiel et se traduit par une exigence pour seulement 10-20 ng de la sonde par diapositive FISH, comparativement à 10 – 20 fois plus lors de la matrice ADN impur est utilisé, résultant en majeure coût et du temps économies. L'utilisation d'amino-allyldUTP permet étiquetage flexiblesondes à disposition colorants amine réactifs (par exemple Alexa Fluor ou Cy-colorants) ou haptènes (par exemple, la biotine, la digoxigénine). Sondes haptène marqués sont détectés par des anticorps conjugué à un fluorophore ou la streptavidine pour amplifier et visualiser le signal. Lumineux sondes directement marquées montrent généralement moins fond coloration et éviter la sur-amplification de signaux, d'où résulte une représentation plus précise de la localisation nucléaire et la morphologie du locus.
Il existe plusieurs techniques de poissons qui utilisent différents fixateurs, les pré-traitements et lavages post-hybridation mais ceux-ci tombent généralement dans les catégories suivantes: fixation de glutaraldéhyde avec NaOH dénaturation, la fixation de formaldéhyde avec HCl dénaturation, et la fixation de formaldéhyde avec dénaturation thermique 6-9 . Chacun d'entre eux présente des avantages et des inconvénients. Glutaraldehyde résultats de fixation en bon état de conservation structurelle nucléaire, mais nécessite un traitement avec des agents réducteurs de minimiserl'auto-fluorescence qui en résulte, et traitement à la soude doit être soigneusement contrôlée pour équilibrer suffisante dénaturation de l'ADN et les dommages potentiels à la structure nucléaire 6. fixation de formaldéhyde est moins forte, ce qui donne une probabilité accrue de perturbations de l'architecture nucléaire, mais aussi généralement de donner des signaux forts et plus fiables et les plus faibles autofluorescence 9. Traitement HCl depurinates ADN et supprime les protéines, offrant un bon accès à l'ADN pour les sondes, mais peut aussi introduire des cassures de l'ADN. Chauffage sépare physiquement les deux brins d'ADN résultant de bonne hybridation de la cible et des signaux forts, mais peut provoquer une certaine perturbation de la structure nucléaire 8. La mesure dans laquelle chacune de ces techniques affecte épitopes des protéines varie largement 6,9, ce qui entraîne l'obligation de déterminer expérimentalement pour chaque protéine de protocole optimal à utiliser dans les expériences d'immuno-FISH.
Bien qu'il n'existe pas «parfait» DNA FISH technique, ils peuvent tous être utile si elle est bien maîtrisée. Notre objectif était d'optimiser un protocole robuste et reproductible FISH d'ADN pour étudier le positionnement spatial de plusieurs loci dans une variété de types de cellules 10, en se concentrant sur la méthode de chauffage pour la plupart des signaux fiables. Avec cela et l'utilisation d'un système d'imagerie automatisée nous avons cherché à augmenter le débit pour l'analyse cellulaire unique des arrangements nucléaires.
FISH 3D DNA est devenu un outil largement reconnu pour analyser les arrangements spatiaux dans le noyau. Alors que le poisson fournit des résultats visuels et direct, comme avec toutes les techniques, il faut être conscient de ses limites. FISH d'ADN est confronté au problème inhérent que les traitements relativement sévères sont nécessaires pour rendre la chromatine accessible pour les sondes FISH qui finalement perturbe nucléaire structure la chose qui doit être analysé. Plusieurs stratégies ont été poursuivis pour jongler avec l'accessibilité et la préservation de la structure. Dans le protocole décrit ici, l'ADN chromosomique est rendue accessible par gel-dégel perméabilisation des cellules et la dénaturation thermique avant l'hybridation de la sonde. Solovei, et al., (2002) a analysé les changements structurels après un traitement similaire et a constaté que le déplacement moyen de domaines chromatine était de 300 nm, ce qui limite la résolution de l'analyse structurelle à environ 1 Mb régions dans le génome 8. Si ce n'est pas haute résolution, ilest une échelle raisonnable pour analyse de la situation nucléaire.
Un examen plus pratique pour l'analyse FISH est que l'acquisition de l'image et des mesures de distances nucléaires sont des processus chronophages qui limitent le nombre de germes qui peuvent être analysés. Afin d'étudier les événements rares nous avons cherché à faire l'imagerie automatisé à haut débit. Puis, avec des contrôles appropriés en place, en nombre suffisant peuvent être comparés pour permettre une analyse statistique robuste des relations spatiales. Nous analysons régulièrement 600 noyaux par point de données pour lequel nous déterminons les coordonnées 3D de tous les signaux de pêcher dans le volume nucléaire. Ces données nécessitent très peu d'espace de stockage et permettent une analyse de distances inter-et intra-allélique, ou des positions radiales en tout point plus tard. En outre, le traitement automatisé peut être fait d'une manière aveugle des chercheurs qui réduit considérablement la probabilité de préjugés inconscients.
Pour permettre ce genre d'analys haut débitest, notre objectif était d'établir un moyen rapide et efficace d'effectuer FISH d'ADN. Nous avons trouvé le protocole décrit ici pour être extrêmement robuste, produisant régulièrement des signaux lumineux avec faible bruit de fond. Il a travaillé pour tous les types de cellules, nous avons essayé à condition que nous adaptons l'étape de fixation des cellules sur la lame. En outre, à une exception près, tous les taux d'alcoolémie, nous avons utilisé pourraient être transformés en des sondes vives. Nous avons également réussi à détecter un certain nombre de protéines nucléaires par coloration des anticorps après FISH d'ADN. Alors que pour certaines protéines Cela fonctionne bien, nous recommandons comparaison avec immunofluorescence traditionnel (IF) pour assurer la cohérence du modèle de coloration des anticorps entre SI et de l'ADN immuno FISH (cf. 11).
En règle générale, nous avons constaté que des sondes marquées de différentes couleurs produit les mêmes résultats. Toutefois, les aspects suivants devraient être considérés lors du choix du colorant de marquage. Tout d'abord, la couleur du fluorophore doit être bien détecté par le microscope used. D'autre part, la longueur d'onde de la lumière émise par les fluorophores doit être suffisamment différente pour éviter que l'encre à travers dans l'autre canal. Cela dépendra des filtres dans le microscope. Et troisièmement, au moins dans nos mains, certaines couleurs produisent des signaux lumineux plus uniforme que d'autres. Nous avons toujours utilisé DAPI (bleu) comme contre qui rend Alexa Fluor 555 (rouge), 488 (vert) et 647 (rouge lointain) de bons choix pour l'étiquetage des sondes. Grâce à notre système d'imagerie, nous avons trouvé Alexa Fluor 555 (rouge) pour produire les signaux brillants, suivis par Alexa Fluor 488 (vert). Alexa Fluor 647 (rouge lointain) présente l'inconvénient qu'il ne peut pas être détectée par l'œil humain et donc aucun signal peut être vu quand on regarde vers le bas le microscope. Ainsi, si cela FISH deux couleurs, nous recommandons la combinaison de colorants rouges et vertes.
Deux problèmes principaux peuvent se présenter: cellules de rincer les lames et les signaux faibles. Comment les cellules adhèrent bien à la diapositive est entr extrêmement variablestypes de cellules een, et le meilleur protocole pour régler / ensemencer les cellules doivent être déterminées. Nous avons utilisé avec succès soit chargé positivement ou lames recouvertes de poly-L-lysine (acheté prêt à l'emploi), mais on a découvert les cellules adhèrent globalement mieux lames recouvertes de poly-L-lysine. Nous avons également constaté que lorsque les cellules étaient des zones entières trop denses serait décoller comme une feuille, alors que l'imagerie automatisée a été entravée si les cellules étaient trop rares. Ainsi, si l'échantillon n'est pas trop précieux, des numéros de portables doivent être ensemencées pour déterminer la densité idéale. Si les cellules sont particulièrement sujettes à laver, un stylo barrière hydrophobe peut être utilisé, et pas de poisson peut être effectuée par pipetage soigneusement solutions directement sur la lame. Pipetage également réduit considérablement les volumes de réactifs nécessaires, mais prend beaucoup plus de temps lorsque vous faites plusieurs diapositives.
Les signaux faibles sont généralement dues à des sondes pauvres, et c'est bien la peine d'investir du temps dans la prise de bonnes. ADN BAC propre devrait être utiliserd comme matériau qui peut être obtenu par précipitation ou répétée des kits disponibles dans le commerce de départ. La contamination par de l'ADN génomique bactérienne affecte négativement la qualité de la sonde et une manutention prudente lors de la lyse cellulaire et de filtrage du lysat cellulaire est nécessaire pour le garder à un minimum. , Il est cependant pas nécessaire d'utiliser une étape de exonuclease à digérer l'ADN linéaire, car cela réduit considérablement le rendement. Marquage efficace de la sonde est crucial. Le contrôle de la qualité la plus importante pour cette étape est de vérifier la taille des fragments après translation de coupure (voir résultats représentatifs). Un «bon» frottis sera presque toujours dans une sonde de couleur vive. Cependant, nous avons constaté que de temps en temps un certain taux d'alcoolémie ne peut être traitée dans une bonne sonde, et un autre taux d'alcoolémie doit être choisi. Une autre étape importante est la dénaturation thermique. Si la température est trop basse, l'ADN ne sera que partiellement dénaturé et l'hybridation de la sonde sera compromise. Si la température est trop élevée, la structure nucléaire will être perturbé plus que nécessaire. Dans nos mains, 78 ° C sur un bloc chaud inversé est le compromis idéal, mais cela peut varier selon le bloc chaud respectif utilisé.
Nous avons eu de bons résultats en utilisant un milieu de montage Vectashield, mais a constaté que SlowFade or a moins d'arrière-plan et préserve le signal fluorescent pour plus longtemps. Nous ne recommandons pas l'utilisation d'un milieu de montage hard-set car nous avons trouvé que cela influe sur la structure 3D et de former des bulles d'air au fil du temps.
En conclusion, vive sondes fluorescentes directement marqués ainsi que le protocole de FISH d'ADN décrites ici offrent une solution efficace pour l'analyse robuste et rapide de l'architecture nucléaire qui est applicable à une grande variété de questions biologiques.
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été financé par le BBSRC et le Wellcome Trust. Nous tenons à remercier Simon Walker à l'aide de l'imagerie et Felix Krueger de l'aide à l'analyse bioinformatique.
Reagent/Material | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NTB buffer | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DTT | Invitrogen | D-1532 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
dNTPs | Bioline | BIO-39025 | Step 1.1.1 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Aminoallyl-dUTP | Ambion | AM8439 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNA Polymerase I | New England Biolabs | M02095 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DNase I recombinant RNase free | Roche | 4716728001 | Step 1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104 | Step 1.1.4, 1.2.3 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaOAc | VWR | 27653 | Step 1.1.5, Step 2.1.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
NaHCO3 | Sigma | S5761 | Step 1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Alexa Fluor Reactive Dye Decapacks for Microarray Applications | Invitrogen (Molecular Probes) | A32750, A32756, A32757 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DMSO (anhydrous) | Sigma Aldrich | 276855 | Step 1.2.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SYBR Safe DNA gel stain | Life Technologies | S33102 | Step 1.2.4 (alternative to ethidium bromide) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | Step 2.1.1.1 (Cot-1 DNA can be home-made in large quantities and works just as well) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma | D7656 | Step 2.1.1.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Deionized formamide | Sigma | F-9037 | Step 2.1.1.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Dextran sulphate | Sigma Life Sciences | D8906 | Step 2.1.1.4 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
XMP painting probes | MetaSystems | 000000-0528-837 | Step 2.1.1.4 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Poly-L-lysine coated slides | Sigma Aldrich | P0425 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Hydrophobic pen (ImmEdge) | Vector Laboratories | H-4000 | Step 2.1.2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
70 μm sieve (Mouse fetal liver cells only) | BD Falcon | 352350 | Step 2.1.2.1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
PFA | Sigma Aldrich | P6148 | Step 2.1.3 (Flammable, corrosive, acute toxicity, health hazard) (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Tris-Cl | Step 2.1.3 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Saponin from Quillaja bark | Sigma Aldrich | 47036 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity), (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | Step 2.1.4, 2.1.11 (Acute toxicity, hazardous to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
10 x PBS | Life Technologies (GIBCO) | 70011-036 | Step 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Glycerol | Fisher Scientific | G/0650 | Step 2.1.6 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
HCl | VWR | 20252 | Step 2.1.9 (Acute toxicity, corrosive) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Formamide | Sigma Aldrich | 47670 | Step 2.1.14, 2.2.3 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SSC | Step 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (See ‘FISH buffers and reaction mixes’ list below) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 22 | Menzel-Glaser | BB022022A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coverslips 22 x 50 | Menzel-Glaser | BB022050A1 | Step 2.1.15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Rubber cement | Marabu | 2901 (10 000) | Step 2.1.15 (Flammable, health hazard, danger to the environment) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
DAPI | Invitrogen Molecular Probes | D3571 | Step 2.2.8 (Health hazard) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | Step 2.2.10 (mounting medium) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Clear nail polish | Any supplier | Step 2.2.10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Equipment | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | Step 1.1.6, 1.2.4 (microvolume spectroscopy) | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Typhoon FLA 7000 phosphoimager | GE Life Sciences | Step 1.2.4 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Coplin jars | Sigma-Aldrich | S6016 (6EA)/S5516 (6EA) | Step 2.1.3 onwards | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Liquid nitrogen dewar | Any supplier | Step 2.1.7 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Base with Black Lid (light-tight chamber) | Simport | M920-2 | Step 2.1.17 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | Step 2.2.3 (or use shaker in a 37 °C room) | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Imaging and Image processing | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Metafer – Imaging Automation Platform | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
MetaCyte – Automated Interphase FISH analysis | MetaSystems | automated imaging software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Axio Imager Z2 upright | Zeiss | epifluorescence microscope used with automated imaging | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
IX81 confocal microscope (FV1000) | Olympus | confocal microscope | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Bitplane, version 7.3 | Imaris | image analysis and 3D modeling software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Scientific volume Imaging, version 4.1 | Huygens | image analysis and deconvolution software | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||
FISH buffers and reaction mixes
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