我们描述了如何使用激光捕获显微切割(LCM),以获得丰富的海马神经元群体或单个神经元,随后采用实时定量PCR和/或整个基因组微阵列基因表达分析的损伤大鼠的大脑冰冻切片。
长期创伤性脑损伤后认知障碍与海马区域在内侧颞叶是至关重要的学习,记忆和执行功能的损伤引起的神经退行性疾病。1,2因此,我们的研究集中于特定的神经元的基因表达分析人口在不同次区域的海马状突起。埃默特降压,在1996年推出的激光捕获显微切割技术(LCM) 等 。,允许单细胞基因表达分析的显着进步,丰富了细胞的异质性组织,如哺乳动物的大脑包含的种群数以千计的功能的细胞类型。我们使用LCM和模型的建立大鼠创伤性脑损伤(TBI)调查所依据的脑外伤发病的分子机制。液压冲击脑外伤,大脑在预先确定的时间伤后取出,立即用干冰冷冻,并准备切片在低温恒温器。老鼠的大脑可以嵌入立即在OCT和切片,或存储的数个月在-80°C激光捕获显微切割前切片。此外,我们使用LCM研究TBI昼夜节律的影响。对于这一点,我们捕捉包含的主时钟的哺乳动物的大脑的视交叉上核神经元。在这里,我们演示了如何使用实时PCR和/ LCM获得单确定神经元(受伤和退化,氟玉阳性,或没有受伤,氟玉负)和丰富的人口为后续基因表达分析的海马神经元全基因组芯片。这些LCM功能的研究表明,解剖学上的不同区域的大鼠海马神经元选择性的脆弱性体现在不同的基因表达图谱LCM从这些不同的区域不同人群的神经元。我们的单细胞研究,其中的结果我们比较死亡和相邻的生存海马神经元的转录图谱表明,存在着调节细胞死亡和生存,创伤性脑损伤后的细胞存活变阻器的。
异质性组织的基因表达分析一直是有问题的,这是特别真实的哺乳动物大脑中,其中有大约5000种不同类型的细胞。激光捕获显微切割(LCM)技术,基因组学研究的影响TBI的发展前在体内在混合组成脑细胞的人口,不仅不同的神经细胞类型,也支持神经胶质细胞和免疫调节细胞基因表达分析的基础上。由此产生的复杂从这些异构组织获得的基因的表达谱,和损伤诱导的细胞信号,经常相互冲突的模式,可照射。5在临床前研究中证明是有效的治疗策略在人体临床试验的失败是一个解释
为了得到清晰的了解弱势群体的神经元损伤诱导的基因表达在大鼠髋部pocampus,我们采用的LCM技术,埃默特降压等人首次报道。随后,我们修改和优化,这丰富的神经元和单个神经元的基因分析,采用实时定量PCR和基因芯片分析人口有效地捕获显微切割技术。为了保持完整的mRNA在脑组织冰冻切片进行基因组分析,我们修改了现有的协议从冷冻鼠脑切片神经元的固定,染色和快速捕获。对于受伤和死亡的海马神经细胞的识别和分离,我们还优化了氟玉染色技术LCM。氟玉不区分细胞凋亡和坏死的细胞死亡。因此,所有类型的退化的神经元可以检测到这个污点6,7。
在这里,我们描述了协议,用于在我们的实验室获得单一的死亡或存活的神经元池以及大片的丰富populati附加不同的神经细胞类型( 即 CA1-CA3神经元的基因表达分析,TBI后)。岛村等人 ,8中详细描述在我们的实验室中执行的程序的流体冲击脑损伤是非常相似的横向的流体冲击损伤协议JOVE阿尔德等发表在小鼠。9由于LCM技术具有被证明具有极小或没有影响,对DNA的完整性,在组织中的RNA和蛋白质,这是一个极好的工具定义的类型的细胞的分子和蛋白质分析。
LCM技术使我们能够理解的分子机制TBI显着的进步。8,10,11,12,13,我们是第一个利用这种技术的调查表明,不同次区域的大鼠海马基因的表达谱,与选择性的脆弱性损伤。我们的研究表明,我们可以量化基因的表达,通过qPCR,从少至10个激光捕获的细胞,并且我们可以执行从少600捕获的细胞的全基因组微阵列分析。 LCM将是一个宝贵的工具,在被牵连在不同的神经学和神经精神障碍,被称为大脑的其他地区的类似的研究。例如,使用LCM的研究已经揭示出在,14的黑质多巴胺神经元,帕金森氏病的发病机制,并资助的全基因组图谱研究牵连s中的奖赏回路中的伏隔核,这是涉及ubstance滥用障碍。
神经细胞的异质性是体现在基因组水平16,并可能导致缺乏成功的实验性治疗脑外伤的临床试验。因此,我们的目标是利用这种技术,研究创伤性脑损伤后神经元的存活影响的关键要素。我们最近的全基因组分析研究死亡和相邻的海马神经元存活的创伤性脑损伤后颅脑外伤后,细胞变阻器,反映了细胞死亡基因的表达水平的细胞存活比率调节细胞的命运。这些正在进行的研究将有助于设计和开发的药物治疗策略,可以产生积极的影响细胞的存活变阻器。此外,我们目前使用的LCM进行跟踪和监视的潜在治疗药物治疗创伤性脑损伤后的海马神经元的影响。因此,我们的研究表明,审慎无RNA酶处理技术和一些修改现有的协议,它是可以从LCM准确的定量基因表达分析,获得高品质的RNA样品。
然而,也有带LCM技术相关联的几个陷阱。例如,只收集神经细胞,没有任何小胶质细胞的污染几乎是不可能的。在海马锥体细胞层中,它已被估计有95%的细胞是神经元与锥体细胞和10%的interneurons这一人口的90%,留下一个小胶质和其它类型的细胞的百分比。8,17, 18在我们的研究中,我们使用氟玉的荧光染料,标签只受伤的神经元在大脑组织。一个不同的染色是一个标记为GFAP将是必要的小胶质细胞进行染色。19收集只有氟玉染色的单神经元机构确保更均匀的人口的神经元。另一个常见的问题,可能需要排除故障是一个圆圈是不T定义当激光发射。如果发生这种情况,它是必要的检查激光设置和必要的调整的功率和持续时间。还有一点很重要,以确保帽平放在对组织和正确地放置在手臂上。在谈到的LCM技术手册或致电技术支持有时是必要的。 LCM和RNA分离的RNA的质量应该始终使用生物分析仪之前,任何基因表达分析评估。
目前市场上几种类型的激光捕获工具包括激光切割(Life Technologies公司,徕卡显微系统)和激光弹射(蔡司)的仪器。我们的LCM系统的工作原理,以及用于捕捉小的细胞数。其他高吞吐量和更自动化的系统可能是更适合用于获得较大数量的细胞的基因组,特别是蛋白质组分析。事实上,LCM使用这些自动化系统具有很大的潜力进行分析的公关otein在确定细胞或富集的细胞群中的表达。20此外,液晶显示模块可以方便immunolabeled细胞,21允许我们调查定义的类型的细胞中的基因表达的复杂性无关的最异类的组织中的基因表达分析的。因此,LCM是单一或富集的细胞群的尖端分子生物学研究的一个很好的工具。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由R01 NS052532(HLH),穆迪基金会,麻醉科。我们感谢劳加粗,恭Courteau编辑援助,巴特勒和克里斯蒂·佩里和克里斯蒂·佩里的所有图形,表格和艺术品的布局和精良的生产。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |