Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury

Deborah R. Boone; Stacy L. Sell; Helen Lee Hellmich

doi:10.3791/50308

JoVE Journal > Neuroscience

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Nörobilim

Laser Capture Mikrodissektion von Angereichert Populationen von Neuronen oder Single Neurons zur Genexpressionsanalyse Nach Traumatic Brain Injury

Published: April 10, 2013

doi:

10.3791/50308

Deborah R. Boone¹, Stacy L. Sell¹, Helen Lee Hellmich¹

¹Department of Anesthesiology,University of Texas Medical Branch

Özet

Wir beschreiben, wie der Laser-Mikrodissektion (LCM) verwenden, um angereichert Populationen von Neuronen im Hippocampus oder einzelne Neuronen aus Gefrierschnitten der Verletzten Rattenhirn für nachfolgende Genexpressionsanalyse mittels quantitativer real-time PCR und / oder des gesamten Genoms Microarrays erhalten.

Abstract

Langfristige kognitive Behinderung nach TBI ist mit Verletzung induzierte Neurodegeneration im Hippocampus-Region in einem mittleren Schläfenlappen, die kritisch für das Lernen, Gedächtnis und leitende Funktion zugeordnet ist. ^1,2 Daher unseren Studien zur Genexpressionsanalyse von spezifischen neuronalen konzentrieren Populationen in unterschiedlichen Teilbereichen des Hippocampus. Die Technik der Laser Mikrodissektion (LCM), die 1996 von Emmert-Buck eingeführt, et al., ³ hat für signifikante Fortschritte in der Genexpressionsanalyse einzelner Zellen erlaubt und angereichert Populationen von Zellen aus heterogenen Gewebe wie dem Gehirn von Säugetieren, die enthält Tausende von funktionellen Zelltypen. ⁴ Wir verwenden LCM und ein gut etabliertes Tiermodell für die Schädel-Hirn-Trauma (SHT), um die molekularen Mechanismen, die die Pathogenese der TBI zugrunde zu untersuchen. Nach Fluid-Perkussions-TBI, sind Gehirn zu vorbestimmten Zeiten nach der Verletzung entfernt, sofort auf Trockeneis eingefroren,und zum Schneiden in einem Kryostaten vorbereitet. Die Rattengehirne in Oktober und geschnitten eingebetteten sofort oder gespeicherte mehrere Monate bei -80 ° C vor dem Schneiden für die Laser Mikrodissektion. Darüber hinaus verwenden wir LCM um die Auswirkungen der TBI auf den Tagesrhythmus zu studieren. Dazu erfassen wir Neuronen aus dem suprachiasmatischen Kerne, die die Master Clock des Gehirns von Säugetieren enthalten. Hier zeigen wir die Verwendung von LCM zu bestimmten einzelnen Neuronen (verletzt und degenerierenden, Fluoro-Jade-positive oder unverletzt, Fluoro-Jade-negativ) und angereicherten Populationen von Neuronen im Hippocampus für nachfolgende Genexpressionsanalyse durch Echtzeit-PCR und / r oder Ganzkörper-Microarrays. Diese LCM-fähigen Studien haben gezeigt, dass die selektive Anfälligkeit von anatomisch verschiedene Regionen des Ratten-Hippocampus in den verschiedenen Genexpressionsprofile von unterschiedlichen Populationen von Neuronen durch LCM aus diesen unterschiedlichen Bereichen erzielt werden reflektiert. Die Ergebnisse unserer Single-Cell-Studien, in denenVergleicht man die Transkriptionsprofile zu sterben und benachbart überlebenden Hippocampusneuronen, deuten auf die Existenz eines Zellüberleben Rheostaten, der Zelltod und Überleben reguliert nach SHT.

Introduction

Genexpressionsanalyse von heterogenen Gewebe ist seit jeher problematisch;. Dies gilt insbesondere im Gehirn von Säugetieren, die etwa 5.000 verschiedene Zelltypen hat ⁴ Vor der Entwicklung des Laser Mikrodissektion (LCM)-Technik, genomische Untersuchungen der Wirkungen von TBI in vivo wurden auf der Analyse der Genexpression in einer gemischten Population von Gehirnzellen besteht, nicht nur die verschiedenen neuronalen Zelltypen, sondern auch von Gliazellen und immunmodulatorische tragenden Zellen. Die daraus resultierenden komplexen Genexpressionsprofile aus diesen heterogenen Gewebe erhalten, und die oft widersprüchliche Muster von Verletzungen induzierte zelluläre Signale, mag eine Erklärung für das Scheitern in klinischen Studien am Menschen von therapeutischen Strategien bewährt in vorklinischen Studien der TBI. ⁵ sein

Um ein klares Verständnis der Verletzung-induzierte Genexpression in gefährdeten Populationen von Neuronen zu erhalten aus der Ratte hippocampus, haben wir die Technik der LCM, zuerst von Emmert-Buck et al. ³ Anschließend modifiziert wir dieses Mikrodissektion Technik optimiert für effiziente Erfassung von angereichertem Populationen von Neuronen und einzelnen Neuronen für die mRNA-Profiling mittels quantitativer real-time PCR und Mikroarray-Analyse . Um die Integrität der mRNA in Gefrierschnitten von Hirngewebe für genomische Analyse aufrechtzuerhalten, modifizierten wir bestehende Protokolle zum Fixieren, Färben und schnellen Erfassung von Neuronen aus gefrorenen Rattenhirn Abschnitte. Für die Identifizierung und Isolierung von verletzten und sterbenden Neuronen im Hippocampus wir auch optimierte die Fluoro-Jade Färbetechnik für LCM. Fluoro-Jade nicht zwischen apoptotischen und nekrotischen Zelltod zu unterscheiden. So können alle Arten von degenerierten Neuronen dieses Fleck. ^6,7 erkannt werden

Hier beschreiben wir das Protokoll in unserem Labor verwendet, um Pools von einzelnen sterben oder überleben Neuronen sowie Schwaden von angereichertem populati erhaltenons von unterschiedlichen neuronalen Zelltypen (zB CA1-CA3 Neuronen zur Genexpressionsanalyse nach SHT). Das Verfahren für Fluid Schlagwerk Hirnverletzung in unserem Labor durchgeführt wird ausführlich in Shimamura et al., ⁸ beschrieben und ist sehr ähnlich zu der lateralen Fluid-Perkussions-Schädigung Protokoll für Mäuse in JoVE von Alder et al. ⁹ Da die LCM Technik hat wurde gezeigt, dass eine minimale oder keine Auswirkung auf die Unversehrtheit von DNA haben, RNA und Protein in Gewebe, das ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die molekulare und Proteinanalyse von definierten Zelltypen.

Protocol

Ein. Chirurgische Verfahren und Fluid Percussion TBI Alle Tierexperimente werden zunächst vom Institutional Animal Care und Use Committee der University of Texas Medical Branch, Galveston, Texas und die National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren (8. Auflage, National Research Council) genehmigt. Rats (erwachsenen männlichen Sprague-Dawley Ratten, 400-500 g von Anbieter Charles Rivers, Portland erhalten, Maine) sind zwei pro Käfig untergebracht und sofern Futter und Wasser ad libitum in einem Vivarium mit diesen konstanten Bedingungen: Licht-Zyklus (600 h bis 1.800 h), die Temperatur (21 ° C bis 23 ° C) und Luftfeuchtigkeit (40% bis 50%) eine Woche vor der Verwendung. Anesthetize Ratten mit 4% Isofluran, intubieren und mechanisch lüften (NEMI Scientific; New England Medical Instruments, Medway, MA) die Ratten mit 1,5-2,0% Isofluran in Sauerstoff: Luft (70:30) und bereiten sie für parasagittal Fluid-Perkussions Verletzungen wie zuvor beschrieben. 8, 10 Opfern Ratten im geeigneten Zeitpunkt nach der Verletzung je nach Versuchsanordnung. Schnelles Entfernen Gehirn, frieren sofort auf Trockeneis, und bei -80 ° C in einer 50 ml Tube oder gehen Sie sofort in Oktober für gefrorene Schnitte einbinden. 2. Schneiden und Färben von Rattenhirn Hirngewebe, die nicht sofort benutzt werden können bei -80 ° C für bis zu einen Monat gehalten, wenn bei einer konstanten Temperatur gehalten wird. Brains, die bei -80 ° C sind, dann auf -20 ° C zum Schneiden aufgetaut und dann wieder eingefroren nicht Ertragsqualität RNA nach dem zweiten Auftauen. Sobald das Gehirn wird aufgetaut, montiert in OCT und geschnittene Folien sollte innerhalb von 24 Stunden angefärbt werden und für LCM innerhalb von 30 min bis eine Stunde der Anfärbung. Dadurch wird sichergestellt, gute Qualität RNA. Nach LCM, können erfasst Zellen auf LCM Kappen in Lysepuffer bei -80 ° C werden für bis zu einer Woche gespeichert, sondern RNA sollte in einer angemessenen Weise isoliert werden, um die höchste Qualität zu gewährleisten. </ Li> Vor dem Schneiden das Gehirn, wischen Sie den Kryostaten mit RNase-Zap und reinigen Sie die Bürsten mit ETOH (ersetzen Sie den Einwegklingenhalter zwischen den einzelnen Gehirn). Rufen Sie das Gehirn in der 50 ml Tube aus dem -80 ° C Gefrierschrank; legen Sie es in den Kryostaten bei einer Temperatur von -22 ° C und Tauwetter im Rohr ca. 10 min. Entfernen Sie das Gehirn aus der Tube und Ort auf die Bühne auf Gaze, Bauchseite auf. Mit einer Rasierklinge schneiden das Gehirn zu den hinteren Teil des Gehirns nur rostral des Kleinhirns und des vorderen Teils am Chiasma entfernen. Füllen Sie eine cryomold mit Oktober Eindeckmedium (Tissue Tek) und legen das Gehirn in der Form mit der Vorderseite nach unten. Lassen Sie das Hirngewebe in der Eindeckmedium einzufrieren, bis es weiß wird (ca. 10 min). Frieren Sie den Probenteller (Tissue Tek) auf das Gehirn mit Oktober Entfernen Sie das Gehirn aus der Form. Legen Sie das Gehirn in der Probe Kopf und die Schrauben festziehen. Legen Sie eine Disposalich, low profile Klinge (Fisher Scientific) in den Messerhalter und ziehen Sie die Hebel nach unten. Beginnen Aufschneiden des Gehirns auf 20 um, um die äußere Schicht von OCT entfernen. Sobald die Hippocampus-Region erreicht ist, setzen Sie den micron Rad 10. Collect koronalen Schnittserien indem ein Glasträger oder plus-Glasobjektträger auf den Gewebeabschnitt (Fisher Scientific). Objektträger werden bei -20 ° C in einem RNase-free Färbebank erhalten, bis sectioning abgeschlossen ist. Um alle RNasen von Glaswaren, wo Gewebeschnitten verarbeitet entfernen, wischen Sie alle Färbung Container und Messzylinder mit Eliminase (Fisher Scientific) und spülen in Milli Q Wasser. Bereiten Sie alle Lösungen mit RNase-freiem Wasser und filtern die Cresylviolett (Sigma-Aldrich) und Fluoro-Jade (Histo-chem) Fleck mit einem 0,2 um Filter vor dem Gebrauch. Auftauen Gehirnschnitte bei RT für 30 sec und fixieren in 75% EtOH (1 min). Für LCM einzelner verletzten Neuronen nach der Fixierung, spülen Folien in RNase-freiem Wasser (1 min), Mit 1% Cresylviolett (15-20 sec) Gegenfärbung, in RNase-freiem Wasser (2 × 30 sec) Spülen mit Fluoro-Jade (4 min) Fleck, in RNase-freiem Wasser (3 × 1 min) spülen, dehydratisieren mit 95% ETOH von RNase-freies Wasser (30 sec), 100% EtOH (30 sec) und Xylol (2 x 3 min) hergestellt. Für LCM von Schwaden von Neuronen nach der Fixierung, spülen Folien in RNase-freiem Wasser (1 min), mit 1% Cresylviolett (1 min) Fleck, in RNase-freiem Wasser spülen (3 × 1 min), mit 95% entwässert EtOH (2 × 30 s), 100% EtOH (2 × 30 s) und Xylol (2 x 3 min). Luft trocknen alle Abschnitte in einem Abzug für 15 min vor dem LCM. Slides können gespeichert, Abschnitt Seiten eingerichtet werden, in eine Folie Box mit Trockenmittel gefüttert, wenn sie von Raum zu Raum übertragen werden müssen. Allerdings sind optimale Ergebnisse erzielt werden, wenn LCM wird unmittelbar nach Abschnitten trocken sind durchgeführt. LCM sollte von 30 min bis 1 h begrenzt. Im nächsten Abschnitt beschreiben wir zunächst, wie die kontinuierliche Schwaden von Zellen, die ea ist zu erfassenSiest für diejenigen, die das Erlernen dieser Technik sind zu meistern. Dann werden wir beschreiben, wie genau erfassen einzelnen Neuronen. In unserem Verfahren identifizieren wir sterben Neuronen durch ihre Affinität für Fluoro-Jade-Marker zu verkommen Neuronen. Fluoro-Jade-negativen Zellen vermutet werden überlebenden Neuronen. 3. Laser Capture Mikrodissektion (LCM) LCM von Schwaden von bereichert Populationen von Neuronen im Hippocampus LCM wird unter Verwendung eines Mikroskops PixCell IIe mit einem Infrarot-Diodenlasers (Life Technologies). Passen Sie die Mitte des Joysticks, um die vertikale Position. Drehen und verriegeln Sie die 4X Ziel in Position. Platzieren einer Folie in der Mitte der dem Mikroskoptisch und manuell einzustellen, bis die Region des Hippocampus in Sicht. Verwenden Grob-und Feintrieb Anpassungen, um das Bild in den Mittelpunkt rücken. Aktivieren Sie die Vakuumplatte durch Drücken der Vakuum-Taste auf dem Controller. Drehen und verriegeln Sie die 10X-Objektiv in place. Konzentrieren Sie sich wieder mit Grob-und Feineinstellungen. Laden das CapSure Makro LCM Kappen (Life Technologies) in die CapSure Kassettenmodul und Position eine Kappe an der Lastleitung Position. Drehen Sie den Cap Placement Arm und Position um die Kappe. Heben Sie den Cap Placement Arm, um die CapSure Kappe von der Kassette Modul zu entfernen. Drehen Sie den Cap Placement Arm über die Rutsche und senken den Arm nach unten über den Objektträger, dies wird die Kappe auf der Folie platzieren. Stellen Sie die Fokussierung und bewegen Sie den Joystick, um zu überprüfen, wenn die Zellen im Inneren des schwarzen Kreises befinden sich auf der Kappe. Alle Zellen erfasst sollte in diesem schwarzen Kreises befinden. Stellen Sie die Laserparameter. Drücken Sie zunächst den Laser zu aktivieren Taste auf dem Controller. Der Laser Zielpunkt sichtbar als rosa Punkt im Sichtfeld auf dem Computer-Monitor. Gesetzt den Fokusdurchmesser um kleine (7,5 um), um den Laser scharf zu stellen, die Leistung und Dauer auf 65 – 75 mW, für 1,0 bis 2,0 msec für die optimale Zelleinfang benötigt. Um test des Lasers, verwenden Sie den Joystick, um den Laserpunkt zu einem Bereich bewegen, wo es keine Zellen zu holen sind. Feuer den Laser mit dem Daumen-Schalter. Verwenden Sie den Joystick, um den Laserpunkt vom geschmolzene Polymer Ort bewegen und prüfen, ob ein sichtbarer dunkler Ring umgibt eine freie Fläche, wo der Laser abgefeuert wurde. Um Zellen zu erfassen, verwenden Sie den Joystick, um den Laserpunkt über den Bereich von Zellen zu erfassen bewegen. Feuer den Laser mit dem Daumen-Schalter. Bewegen Sie den Joystick während des Schießens den Laser auf einen großen Bereich von Zellen zu erfassen. Wenn der Laser gezündet wird es schmilzt das thermoplastische Polymerfilm auf der Kappe auf der Oberfläche der Zielzellen. Das Polymer absorbiert die Laserstrahlung, also nicht Verändern der RNA, DNA oder Proteinen Gewährleistung der Integrität der Probe für zukünftige molekulare Anwendungen. Nach dem Brennen alle Zellen von Interesse, heben Sie den Cap Placement Arm. Die aufgenommenen Zellen aus dem Gewebe Abschnitt zu trennen und sich an die CapSure Kappe. Die restlichen Gewebe und fehlende Zellen wird visIVK im Sichtfeld. Die Zellen an der Kappe kann auch durch Anordnen der Kappe auf einem leeren Abschnitt des Schlittens betrachtet werden. Heben Sie den Cap Placement Arm und drehen Sie es um das Cap Unload Station. Senken Sie den Deckel in die Station und drehen Sie das Cap Placement Arm wieder in seine vorherige Position. Schieben Sie die CapSure Einsetzwerkzeug den Bahnsteig entlang und auf der Kappe. Heben Sie das Werkzeug aus der Plattform. Die Kappe bleibt angebracht. Leicht berühren die Kappe auf dem CapSure sauber Pad zu reinigen entfernt unerwünschte Gewebe. Setzen Sie die Kappe in eine 0,5 ml RNase-freier Schlauch mit 100 ul Lysepuffer aus dem RNAqueous Micro-Isolation Kit erhalten gefüllt. Unmittelbar Vortex die Kappe für 30 Sek., um die Zellen zu lysieren. Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 30 min und Einfrieren bei -80 ° C bis zur RNA-Isolierung. LCM einzelner FJ + Neuronen im Hippocampus Um einzelne Zellen zu erfassen, laden CapSure HS LCM Mützen in die CapSure Kassettenmodul und positian einer Kappe an der Lastleitung Position. Drehen Sie den Cap Placement arm und positionieren Sie es um die Kappe. Heben Sie den Cap Placement Arm, um die CapSure Kappe von der Kassette Modul zu entfernen. Stellen Sie den Laserpunkt zu kleinen (7,5 um), um den Laser scharf zu stellen, die Laserleistung und die Dauer auf 65 -75 mW für 0,45 bis 0,50 ms für eine optimale Zelleinfangbereich von einzelnen Zellen. Drehen Sie den Cap Placement Arm über die Rutsche und senken Sie den Arm nach unten in Richtung der Folie. Dadurch wird die Kappe auf dem Objektträger zu platzieren. Die CAPSURE HS cap Oberfläche sitzt der Probe während der LCM erhöht. Verwenden Sie den Joystick, um den Laser über einzelne FJ + Zellen zu verschieben. Alle Zellen gefangen müssen in dem kleinen schwarzen Ring auf der Kappe zu sein. Feuer den Laser mit dem Daumen-Schalter. Wenn alle Zellen innerhalb des schwarzen Kreises mit dem Laser gebrannt wurden, heben Sie den Cap Placement Arm. Die aufgenommenen Zellen aus dem Gewebe Abschnitt zu trennen und sich an die CapSure HS Kappe. Legen Sie eine andere Folie auf dem microsbewältigen Bühne und sammeln FJ +-Zellen, bis der HS cap voll ist. Setzen Sie die Kappe in eine 0,5 ml RNase-freier Schlauch mit 40-50 ul Lysepuffer gefüllt. Unmittelbar Vortex die Kappe für 30 Sek., um die Zellen zu lysieren. Inkubieren der Proben bei 42 ° C für 30 min und Einfrieren bei -80 ° C bis zur RNA-Isolierung. 4. Gesamt-RNA Isolation Von LCM Samples (Dieser Abschnitt wird nur in der Video-Präsentation beschrieben werden) Gesamt-RNA aus Zellen isoliert wird unter Verwendung des Micro RNAqueous-Kit (Ambion) nach den Protokollen des Herstellers. Alle Reagenzien und Waschlösungen sind in diesem Kit zur Verfügung gestellt. Vornässen Mikrofilter Kartuschenanordnung durch Zugabe von 30 ul Lyselösung Puffer in den Filter. Nach 5 min zentrifugieren des Filters für 30 Sekunden bei 10.000 × g zentrifugiert. Hinzufügen 3 ul LCM Zusatz zum Probenlysat, um Pipette mischen und Zentrifuge. Fügen Sie 52 ul 100% EtOH (1/2 Volumen) auf die Probe Lysat; Pipette zu mischen, und übertragen das Lysat auf den FilterSpalte. Zentrifugieren Filtersäule bei 10.000 × g für 1 Minute, um die RNA an die Säule binden. Wenn es mehrere Kappen für ein Probe, drehen jedes Lysat durch die gleichen Spalte getrennt. Füllen Sie das RNA-Isolierung Verfahren wie im RNAqueous Micro Kit beschrieben. Führen DNase Behandlung und DNase Inaktivierung von LCM-RNA-Proben wie im Kit beschrieben, übertragen die RNA zu einem RNase-freier Schlauch und bei -80 ° C. 5. RNA Quantifizierung und Downstream-Anwendungen Beurteilung der RNA-Qualität und Quantifizierung erfolgt über ein Agilent Bioanalyzer mit Reagenzien aus dem Pico Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) nach dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Gesamt-RNA wird auf einem Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) analysiert. Die Software wertet die Konzentration und die Integrität der RNA-Probe durch Zuweisen einer RNA Integrity (RIN) zu jeder Probe reicht fROM 1 bis 10 ist. 1-5 zeigt abgebaut RNA und 7-10 zeigt eine gute Qualität RNA. Individuelle TaqMan-Assays oder RT2 Profiler Arrays mit SYBR-Green Chemie; nicht abgebaute intakte RNA wird für Real-Time PCR eingesetzt werden. Die RNA kann auch für mRNA Mikroarray-Analyse und microRNA-Microarray-Analyse eingesetzt werden.

Representative Results

In unserem ersten LCM Studie konnten wir, dass funktionell unterschiedliche Teilbereiche (CA1 und CA3) des Ratten-Hippocampus zu zeigen Genexpressionsprofile, die ihre Anfälligkeit für TBI. 8 1A-1C reflektieren zeigt Laser-Capture von hippocampalen Pyramidenzellen (CA1- CA3), Gyrus dentatus Neuronen und Neuronen SCN, bevor und nachdem LCM. Saubere Aufnahmen von pyramidal, Granulat oder SCN Neuronen sind jeweils auf die Makro-Kappen gezeigt. 2A-2B veranschaulicht Sterben, Fluoro-Jade positive Pyramidenzellen und Hinterbliebene, Fluoro-Jade negativen Pyramidenzellen vor und nach LCM. Die saubere Erfassung des Sterbens oder überlebenden Neuronen wird durch Betrachten der aufgenommenen Zellen auf den LCM caps gezeigt. Nach LCM, kann die Gesamt-RNA für eine Vielfalt von molekularen Studien einschließlich der quantitativen real-time PCR-Analyse der Genexpression mittels TaqMan-oder SYBR green Chemie (3A), kleine focu verwendet werdensed PCR-Arrays mit SYBR green Sonden (3B) oder Gesamtgenom Mikroarray Studien (3C). Abbildung 1. Laser Mikrodissektion an Schwaden definierter Zellpopulationen aus dem Rattenhirn. Gefrorene 10 um Kranzschnitte der Rattenhirn werden in Ethanol fixiert, gefärbt mit einem Farbstoff Nissl (Cresylviolett) und vorbereitet LCM. Es zeigen Bilder der Rattenhippokampus und suprachiasmatischen Kern vor und nach LCM und die eingefangenen Zellen visualisiert auf den Makro Kappen. A. Pyramidale Neuronen aus den CA1-CA3 Teilfeldern des Ratten-Hippocampus. B. Granule Zellen in der hippocampalen. C. Bilaterale suprachiasmatischen Kerne zu beiden Seiten des dritten Ventrikelsund oberhalb der Sehnervenkreuzung. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen . Abbildung 2. Laser Mikrodissektion einzelner Neuronen von Ratten Hippocampus. Dargestellt sind A. degenerieren, Fluoro-Jade-positive (gebeizt) hippocampalen CA3 Neuronen und B. Surviving, Fluoro-Jade-negative (ungefärbten) CA3 Neuronen vor und nach LCM. Eingefangenen Zellen visualisiert werden. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen . <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50308/50308fig3large.jpg" src="/ Files/ftp_upload/50308/50308fig3.jpg" /> Abbildung 3. Genexpressionsanalysen von Gesamt-RNA aus dem Laser erfasst Neuronen isoliert. A. Quantitative real-time PCR Daten circadianen Uhr Genexpression in SCN. B. Heatmap der Genexpression im Sterben und Überleben Hippocampusneuronen zeigt Expression von Apoptose-Gene mit fokussierten PCR-Arrays . C. Agilent gesamten Genoms Mikroarray-Analyse der Genexpression in hippocampalen CA1-CA3 Neuronen von Ratten, die Schein-Verletzung erhalten, TBI oder TBI zuzüglich eines rekombinanten Adeno-assoziierten Virus siRNA zur Knockdown Expression von Genen durch Hirnverletzung (neuronaler Stickstoffmonoxid induzierten Synthase und Glutathionperoxidase-1). Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

Discussion

Das LCM-Technik ermöglicht es uns, bedeutende Fortschritte im Verständnis der molekularen Mechanismen der TBI machen. ^{8,10,11,12,13} Wir waren die ersten Forscher, um diese Technik zu nutzen, um zu demonstrieren, dass unterschiedliche Teilbereiche des Ratten-Hippocampus Genexpressionsprofile haben, dass korrelieren mit ihrer selektiven Anfälligkeit für Verletzungen. Unsere Studien haben gezeigt, dass wir die Genexpression zu quantifizieren, durch qPCR, von so wenig wie 10 Laser gefangenen Zellen und dass wir genomweiten Microarray-Analyse von so wenig wie 600 eingefangenen Zellen durchzuführen. LCM würde ein wertvolles Werkzeug in ähnlichen Studien von anderen Hirnregionen, die bekanntermaßen in verschiedenen neurologischen und neuropsychiatrischen Erkrankungen beteiligt sein werden. Zum Beispiel haben Studien mit LCM Licht in der Pathogenese des Morbus Parkinson in Dopamin-Neuronen der Substantia nigra, ¹⁴ Schuppen und half genomweite Profilierung Studien des Nucleus accumbens, die in Lohn-Schaltungen in s verwickelt beteiligt istubstance abuse Störungen. ¹⁵

Neuronal Heterogenität am Genomebene ¹⁶ reflektiert und zu den mangelnden Erfolg von experimentellen Behandlungen für TBI in klinischen Studien bei. Daher ist es unser Ziel, diese Technik zu nutzen, um die kritischen Elemente beeinflussen neuronale Überleben nach SHT zu untersuchen. Unsere jüngsten genomweite Profilierung Studie zu sterben und benachbart überlebenden Hippocampusneuronen nach SHT vorgeschlagen, dass eine zelluläre Rheostaten, der das Verhältnis der Expressionsmengen des Zellüberlebens spiegelt zum Zelltod Genen reguliert Zellschicksals nach SHT. Diese laufenden Studien wird auf die Konzeption und Entwicklung von pharmakotherapeutische Strategien positiv beeinflussen können das Überleben der Zelle Rheostat beitragen. Darüber hinaus verwenden wir derzeit LCM zur Verfolgung und Überwachung der Auswirkungen von potentiellen therapeutischen medikamentöse Behandlungen in Hippocampus-Neuronen nach SHT. So zeigen unsere Studien, dass angesichts sorgfältige RNase-freien Umgang mit Techniken und einigeModifikationen von bestehenden Protokollen, ist es möglich, qualitativ hochwertige RNA-Proben aus LCM für genaue quantitative Genexpressionsanalyse erhalten.

Allerdings gibt es ein paar Fallstricke mit LCM Techniken verbunden sind. Zum Beispiel kann nur Sammeln neuronalen Zellen ohne Mikroglia Kontamination nahezu unmöglich. Im pyramidenförmigen Zellschicht des Hippocampus wurde geschätzt, dass 95% der Zellen Neuronen mit 90% dieser Population zu Pyramidenzellen und 10% Interneuronen sein, so dass ein kleiner Prozentsatz von Glia und anderen Zelltypen. ^{8,17 sind, 18} In unseren Studien verwenden wir Fluoro-Jade einen fluoreszierenden Farbstoff, der spezifisch Etiketten nur verletzten Neuronen im Gehirn. Ein anderer Farbstoff, der ein Marker für GFAP ist notwendig wäre Mikroglia färben. ¹⁹ Sammeln nur die Fluoro-jade gebeizt einzigen neuronalen Körpern gewährleistet eine homogene Population von Neuronen. Ein weiteres häufiges Problem, dass erfordern Fehlerbehebung kann, ist, dass ein Kreis nicht istt definiert ist, wenn der Laser abgefeuert. Wenn dies auftritt, ist es notwendig, die Laser-Einstellungen prüfen und einstellen Leistung und Dauer wie nötig. Auch ist es wichtig sicherzustellen, dass die Kappe gelegt wird und flach auf das Gewebe vollständig in dem Arm sitzt. Unter Bezugnahme auf die LCM technisches Handbuch oder den technischen Support anrufen wird manchmal notwendig sein. Nach LCM und RNA-Isolation, sollte die Qualität der RNA stets anhand einer Bioanalyzer vor jeder Genexpressionsanalyse werden.

Es gibt verschiedene Arten von Laser-Capture-Geräte derzeit auf dem Markt einschließlich Laserschneiden (Life Technologies, Leica Microsystems) und Laser katapultiert (Zeiss) Instrumente. Unsere LCM System funktioniert gut für die Erfassung einer kleinen Anzahl von Zellen. Andere hohem Durchsatz und mehr automatisierte Systeme können besser geeignet zur Gewinnung einer größeren Anzahl von Zellen für genomische und besonders Proteomanalyse. Tatsächlich hat LCM mit diesen automatisierten Systemen ein großes Potenzial für die Analyse von protein Expression in identifizierten Zellen angereichert oder Populationen von Zellen. ²⁰ Weiteren kann LCM erleichtern Genexpressionsanalyse immunmarkierten Zellen, ²¹ ermöglicht es uns, die Genexpression in definierten Zelltypen zu untersuchen unabhängig von der Komplexität in den heterogenen Geweben. So ist LCM ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Spitzenforschung molekulare Untersuchungen von Einzel-oder angereichert Populationen von Zellen.

Açıklamalar

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wird durch R01 NS052532 (um HLH), der Moody-Stiftung und der Abteilung für Anästhesiologie finanziert. Wir danken Laurie Bolding, Christine Courteau Butler und Christy Perry für ihre redaktionelle Hilfe und Christy Perry für Layout und ausgezeichnete Produktion aller Abbildungen, Tabellen und Grafiken.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
PixCell IIe Laser Capture Microscope	Life Technologies (Arcturus)
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent Technologies
RNAqueous Micro- Kit	Life Technologies (Ambion)	AM1931
Agilent 6000 Pico Kit	Agilent Technologies	5067-1513
Capsure LCM caps	Applied Biosystems	LCM0211/LCM0214
Fluoro-Jade	Histo-chem Inc.	#1FJ
Cresyl Violet Acetate	Sigma-aldrich	C5042-10G
Xylene (Histological grade)	Fisher Scientific	X3P-1GAL
Ethanol 200 proof (Histological grade)	UTMB pharmacy
RNase free barrier pipette tips	Fisher Scientific	2123635, 212364, 212361, 21-236-2A
			Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems

Referanslar

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Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser Capture Microdissection of Enriched Populations of Neurons or Single Neurons for Gene Expression Analysis After Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (74), e50308, doi:10.3791/50308 (2013).