تسليخ مجهري ليزر لقطة من السكان المخصب من الخلايا العصبية أو الخلايا العصبية واحدة لتحليل التعبير الجيني بعد إصابات في الدماغ
Özet
ونحن تصف كيفية استخدام الليزر التقاط تسليخ مجهري (LCM) للحصول على السكان المخصب من الخلايا العصبية قرن آمون أو الخلايا العصبية واحدة من المقاطع المجمدة من الدماغ الفئران المصاب عن الجين اللاحقة التحليل الكمي باستخدام التعبير الحقيقي PCR الوقت و / أو ميكروأرس كامل الجينوم.
Abstract
ويرتبط العجز على المدى الطويل بعد TBI المعرفية مع الإصابة التي يسببها تنكس عصبي في المنطقة A-الحصين في الفص الصدغي الإنسي التي تعد حيوية للذاكرة والتعلم والوظيفة التنفيذية، 1،2 وبالتالي لدينا دراسات تركز على تحليل التعبير الجيني من الخلايا العصبية المحددة السكان في المناطق دون الإقليمية المتميزة للقرن آمون. وقد سمحت هذه التقنية للتسليخ مجهري التقاط الليزر (LCM)، وعرض في عام 1996 من قبل Emmert-باك، وآخرون، 3 للتقدما كبيرا في تحليل التعبير الجيني للخلايا وحيدة وإثراء السكان من الخلايا من الأنسجة غير متجانسة مثل الدماغ الذي يحتوي على الثدييات الآلاف من أنواع الخلايا الوظيفية .. 4 نستخدم LCM ونموذج الفئران راسخة من إصابات في الدماغ (المصرف التجاري العراقي) للتحقيق في الآليات الجزيئية التي تكمن وراء التسبب في TBI. بعد قرع السائل TBI، تتم إزالة العقول في أوقات محددة سلفا ما بعد الإصابة، تجميد فورا على الثلج الجاف،وأعدت لتقطيع في ناظم البرد. يمكن تضمين أدمغة الفئران في أكتوبر ومقطوع على الفور، أو تخزينها عدة أشهر في -80 درجة مئوية قبل تقطيع ليزر القبض تسليخ مجهري. بالإضافة إلى ذلك، ونحن نستخدم LCM لدراسة آثار TBI على إيقاعات الساعة البيولوجية. لهذا، فإننا التقاط الخلايا العصبية من نوى فوق التصالبة التي تحتوي على مدار الساعة ماجستير في الدماغ في الثدييات. هنا، ونحن لشرح استخدام واحد للحصول على LCM الخلايا العصبية التي تم تحديدها (وجرح التحول، الفلورية اليشم إيجابية، أو لم يصب، الفلورية اليشم السلبية) والسكان من الخلايا العصبية قرن آمون المخصب لاحقة تحليل الجينات التعبير PCR الوقت الحقيقي، و/ أو كامل الجينوم ميكروأرس. وقد كشفت هذه الدراسات LCM تمكين أن تنعكس الضعف انتقائية من مناطق مختلفة تشريحيا من قرن آمون الفئران في ملامح التعبير الجيني مختلفة من مجموعات مختلفة من الخلايا العصبية التي حصلت عليها من هذه المناطق LCM متميزة. النتائج من الدراسات وحيدة الخلية لدينا، حيثقارنا ملامح الترانسكربتي من الموت والبقاء على قيد الحياة مجاور الخلايا العصبية قرن آمون، واقتراح وجود خلية مقاومة متغيرة التي تنظم بقاء موت الخلايا والبقاء على قيد الحياة بعد TBI.
Introduction
وكان الجين التعبير عن تحليل الأنسجة غير متجانسة دائما إشكالية، وهذا صحيح بشكل خاص في أدمغة الثدييات التي لديها حوالي 5،000 أنواع مختلفة من الخلايا قبل 4 تطوير تسليخ مجهري التقاط الليزر (LCM) تقنية، دراسات الجينية من آثار TBI في الجسم الحي واستندت على تحليل التعبير الجيني في السكان مختلطة تتألف من خلايا الدماغ، وليس فقط من مختلف أنواع الخلايا العصبية، ولكن أيضا لدعم الخلايا الدبقية المناعية و. الناتج ملامح التعبير الجيني معقدة تم الحصول عليها من هذه الأنسجة غير المتجانسة، وكثيرا ما تكون متضاربة أنماط الإصابة التي يسببها الإشارات الخلوية، قد يكون أحد التفسيرات لفشل في تجارب اكلينيكية على البشر من الاستراتيجيات العلاجية أثبتت فعاليتها في الدراسات ما قبل السريرية من TBI 5
للحصول على فهم واضح للالتعبير الجيني الناجم عن إصابة في الفئات الضعيفة من السكان من الخلايا العصبية من الفئران في الوركpocampus، اعتمدنا أسلوب LCM التي نشرتها اولا وآخرون Emmert-باك .. 3 بعد ذلك، ونحن والأمثل تعديل هذه التقنية تسليخ مجهري لالتقاط كفاءة السكان المخصب من الخلايا العصبية والخلايا العصبية واحد لاستخدام التنميط مرنا الكمية الحقيقية PCR الوقت وتحليل ميكروأري . للحفاظ على سلامة مرنا في الفروع المجمدة من أنسجة المخ للتحليل الجيني، نحن تعديل البروتوكولات القائمة لتحديد، وتلطيخ والتقاط سريع للخلايا العصبية في الدماغ من الفئران المجمدة أقسام. لتحديد وعزل الخلايا العصبية قرن آمون الجرحى والمحتضرين، ونحن الأمثل أيضا تقنية تلطيخ الفلورية اليشم لLCM. الفلورية اليشم لا يميز بين موت الخلايا أفكارك ونخرية. وبالتالي، يمكن أن يتم الكشف عن جميع أنواع الخلايا العصبية التحول من 6،7 صمة عار. هذا
هنا، نحن تصف البروتوكول المستخدم في مختبرنا للحصول على برك من الخلايا العصبية على قيد الحياة واحد أو يموتون، وكذلك مساحات من populati التخصيبإضافات متميزة من أنواع الخلايا العصبية (أي الخلايا العصبية CA1-CA3 لتحليل التعبير الجيني بعد TBI). ووصف إجراءات السوائل قرع إصابات الدماغ أجريت في مختبرنا بالتفصيل في شيمامورا وآخرون، 8 و هي مشابهة جدا لبروتوكول الوحشي إصابة قرع السائل بالنسبة للفئران نشرت في ألدر إن الرب من وآخرون .. 9 منذ تقنية LCM له ثبت أن لها تأثير ضئيل أو معدوم على سلامة الحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي والبروتينات في الأنسجة، وهذا هو أداة ممتازة لتحليل البروتين الجزيئي والخلوي من أنواع المعرفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه التقنية LCM مكنتنا من تحقيق تقدم كبير في فهم الآليات الجزيئية لTBI. 8،10،11،12،13 كنا أول من المحققين استخدام هذه التقنية لإثبات أن المناطق الفرعية المتميزة للقرن آمون الفئران لها ملامح التعبير الجيني التي ترتبط ضعفها انتقائية للإصابة. أظهرت دراساتنا أن نتمكن من تحديد التعبير الجيني، من qPCR، من خلايا ليزر عدد قليل إلى 10 أسير وأننا يمكن أن تؤدي الجينوم على نطاق تحليل ميكروأري من عدد قليل من الخلايا إلى 600 أسر. وLCM أن يكون أداة قيمة في دراسات مماثلة في مناطق أخرى من الدماغ التي هي معروفة لتكون متورطة في مختلف الاضطرابات العصبية والعصبية النفسية. على سبيل المثال، قد تسلط الدراسات الضوء إلى استخدام LCM التسبب في مرض باركنسون في الخلايا العصبية الدوبامين في المادة السوداء و 14 و بمساعدة دراسات الجينوم على نطاق التنميط من النواة المتكئة، التي تشارك في دوائر مكافأة المتورطين في قاضطرابات تعاطي ubstance 15
وينعكس عدم التجانس العصبية على مستوى الجينوم 16 و يمكن أن تسهم في عدم نجاح علاجات تجريبية لTBI في التجارب السريرية. وبالتالي، فإن هدفنا هو استخدام هذه التقنية لتحقيق العناصر الحاسمة التي تؤثر بقاء الخلايا العصبية بعد TBI. واقترح لدينا دراسة حديثة التنميط الجينوم على نطاق والموت المجاورة على قيد الحياة الخلايا العصبية قرن آمون بعد TBI أن مقاومة متغيرة الخلوية التي تعكس نسبة مستويات التعبير عن الجينات بقاء الخلية إلى موت الخلايا ينظم مصير الخلية بعد TBI. وهذه الدراسات الجارية المساهمة في تصميم وتطوير الاستراتيجيات التي يمكن أن تؤثر pharmacotherapeutic إيجابيا على مقاومة متغيرة بقاء الخلية. وعلاوة على ذلك، ونحن نستخدم حاليا LCM لتتبع ورصد الآثار المحتملة للعلاجات الدوائية العلاجية في الخلايا العصبية قرن آمون بعد TBI. وهكذا، لدينا دراسات تثبت أن تعطى حذرا تقنيات التعامل مع ريبونوكلياز خالية وبعضإدخال تعديلات على البروتوكولات القائمة، فمن الممكن الحصول على جودة عالية عينات من الحمض النووي الريبي لLCM دقيقة الكمية الجينات تحليل التعبير.
ولكن هناك عدد قليل المزالق المرتبطة تقنيات LCM. على سبيل المثال، يمكن جمع الخلايا العصبية فقط دون أي تلوث الخلايا الدبقية الصغيرة من المستحيل تقريبا. في طبقة الخلايا الهرمية للالحصين وتشير التقديرات إلى أن 95٪ من الخلايا هي الخلايا العصبية مع 90٪ من هذه الفئة من السكان لتكون الخلايا الهرمية وinterneurons 10٪، وترك نسبة ضئيلة من أنواع الخلايا الدبقية وغيرها. 8،17، 18 في دراساتنا التي نستخدمها الفلورية اليشم صبغة الفلورسنت التي تصف على وجه التحديد الخلايا العصبية فقط بجروح في أنسجة المخ. ومن شأن وصمة عار المختلفة التي هي علامة للحصول على GFAP يكون من الضروري وصمة عار الخلايا الدبقية الصغيرة 19 فقط جمع الفلورية اليشم الملون الهيئات الخلايا العصبية واحد يضمن يبلغ عدد سكانها أكثر تجانسا من الخلايا العصبية. آخر مشكلة شائعة التي قد تتطلب استكشاف الأخطاء وإصلاحها هو أن الدائرة لار محددة عندما يتم تشغيل الليزر. إذا حدث هذا، فمن الضروري للتحقق من إعدادات ضبط الليزر والطاقة ومدتها حسب الضرورة. أيضا من المهم للتأكد من أن يتم وضع سقف شقة في الأنسجة ويجلس بشكل صحيح في الذراع. ويشير إلى دليل LCM التقنية، أو الدعوة إلى الدعم الفني في بعض الأحيان يكون ضروريا. بعد LCM والعزلة RNA، ينبغي دائما نوعية RNA يتم تقييم باستخدام bioanalyzer قبل أي جينات تحليل التعبير.
هناك عدة أنواع من الصكوك التقاط الليزر حاليا في السوق بما في ذلك القطع بالليزر (لايف تكنولوجيز، لايكا مايكروسيستمز) وأخرج الليزر (زايس) الصكوك. نظامنا LCM يعمل بشكل جيد لالتقاط أعداد صغيرة من الخلايا. قد غيرها من نظم عالية الإنتاجية والآلية أكثر يكون أكثر ملاءمة للحصول على عدد أكبر من الخلايا لتحليل الجيني والبروتين بشكل خاص. في الواقع، LCM استخدام هذه النظم الآلية لديها امكانات كبيرة لتحليل العلاقات العامةotein التعبير في الخلايا التي تم تحديدها أو السكان المخصب من الخلايا 20 وعلاوة على ذلك، يمكن تسهيل LCM الجين التعبير عن تحليل الخلايا immunolabeled، 21 مما يسمح لنا للتحقيق في التعبير الجيني في أنواع الخلايا محددة بغض النظر عن التعقيد في معظم الأنسجة غير المتجانسة. وهكذا، LCM هو أداة ممتازة لأحدث الدراسات الجزيئية للسكان واحدة أو المخصب من الخلايا.
Açıklamalar
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويتم تمويل هذا العمل من قبل R01 NS052532 (لHLH)، ومؤسسة موديز، وقسم التخدير. نشكر لوري البنط الأسود، كريستين كورتو بتلر وبيري كريستي للمساعدة على التحرير، وكريستي بيري لتخطيط وإنتاج ممتاز من جميع الجداول والأرقام والعمل الفني.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | |
| PixCell IIe Laser Capture Microscope | Life Technologies (Arcturus) | ||
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | ||
| RNAqueous Micro- Kit | Life Technologies (Ambion) | AM1931 | |
| Agilent 6000 Pico Kit | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
| Capsure LCM caps | Applied Biosystems | LCM0211/LCM0214 | |
| Fluoro-Jade | Histo-chem Inc. | #1FJ | |
| Cresyl Violet Acetate | Sigma-aldrich | C5042-10G | |
| Xylene (Histological grade) | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Ethanol 200 proof (Histological grade) | UTMB pharmacy | ||
| RNase free barrier pipette tips | Fisher Scientific | 2123635, 212364, 212361, 21-236-2A | |
| Arcturus Laser Capture Microdissection system (Life Technologies) Zeiss Laser Microdissection The PALM family Leica Microsystems |
Referanslar
- Squire, L. R., Stark, C. E., Clark, R. E. The medial temporal lobe. Annual Review of Neuroscience. 27, 279-306 (2004).
- Bast, T. Toward an integrative perspective on hippocampal function: from the rapid encoding of experience to adaptive behavior. Rev. Neurosci. 18 (3-4), 253-281 (2007).
- Emmert-Buck, M. R., Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection. Science. 274 (5289), 998-1001 (1996).
- Bota, M., Dong, H. W., Swanson, L. W. From gene networks to brain networks. Nat. Neurosci. 6 (8), 795-799 (2003).
- Schouten, J. W. Neuroprotection in traumatic brain injury: a complex struggle against the biology of nature. Curr. Opin. Crit. Care. 13 (2), 134-142 (2007).
- Schmued, L. C., Albertson, C., Slikker, W. Fluoro-Jade: a novel fluorochrome for the sensitive and reliable histochemical localization of neuronal degeneration. Brain Research. 751 (1), 37-46 (1997).
- Ye, X., Carp, R. I., Schmued, L. C., Scallet, A. C. Fluoro-Jade and silver methods: application to the neuropathology of scrapie, a transmissible spongiform encephalopathy. Brain Res. Brain Res. Protoc. 8 (2), 104-112 (2001).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Mol. Brain Res. 17 (1), 47-61 (2004).
- Alder, J., Fujioka, W., Lifshitz, J., Crockett, D. P., Thakker-Varia, S. Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice. J. Vis. Exp. (54), e3063 (2011).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., et al. Analysis of long-term gene expression in neurons of the hippocampal subfields following traumatic brain injury in rats. Nörobilim. 131 (1), 87-97 (2005).
- Shah, S. A., Prough, D. S., Garcia, J. M., DeWitt, D. S., Hellmich, H. L. Molecular correlates of age-specific responses to traumatic brain injury in mice. Exp. Gerontol. 41 (11), 1201-125 (2006).
- Hellmich, H. L., Garcia, J. M., et al. Traumatic brain injury and hemorrhagic hypotension suppress neuroprotective gene expression in injured hippocampal neurons. Anesthesiology. 102 (4), 806-814 (2005).
- Rojo, D. R., Prough, D. S., et al. Influence of stochastic gene expression on the cell survival rheostat after traumatic brain injury. PLoS One. 6 (8), e2311 (2011).
- Elstner, M., Morris, C. M., et al. Expression analysis of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease and aging links transcriptional dysregulation of energy metabolism to cell death. Acta Neuropathol. 122 (1), 75-86 (2011).
- Chen, H., Liu, Z., et al. Genome-Wide Gene Expression Profiling of Nucleus Accumbens Neurons Projecting to Ventral Pallidum Using both Microarray and Transcriptome Sequencing. Front. Neurosci. 5, 98 (2011).
- Lein, E. S., Hawrylycz, M. J., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).
- Amaral, D. G., Ishizuka, N., Claiborne, B. Neurons, numbers and the hippocampal network. Prog. Brain Res. 83, 1-11 (1990).
- Zeng, Y. C., Bongrani, S., et al. Effect of long-term treatment with L-deprenyl on the age-dependent microanatomical changes in the rat hippocampus. Mech. Ageing Dev. 79 (2-3), 169-185 (1995).
- Schmued, L. C., Hopkins, K. J. Fluoro-Jade: novel fluorochromes for detecting toxicant-induced neuronal degeneration. Toxicol. Pathol. 28 (1), 91-99 (2000).
- Banks, R. E., Dunn, M. J., et al. The potential use of laser capture microdissection to selectively obtain distinct populations of cells for proteomic analysis– preliminary findings. Electrophoresis. 20 (4-5), 689-700 (1999).
- Fend, F., Emmert-Buck, M. R., et al. Immuno-LCM: laser capture microdissection of immunostained frozen sections for mRNA analysis. Am. J. Pathol. 154 (1), 61-66 (1999).
