Kantitatif Spor Analizi (QFA) mikrobiyal kültür uyumu tahmin etmek için deneysel ve hesaplamalı yöntemleri tamamlayıcı bir dizi. QFA genetik mutasyonlar, uyuşturucu ya da mikrop büyümesi üzerine uygulanan diğer tedavilerin etkisi tahmin ediyor. Tek kültür odaklı analiz paralel kültürlerin binlerce deneyler ölçekleme dizayn edilebilir.
Kantitatif Spor Analizi (QFA) paralel 1,2,3,4 yetiştirilen mikrobiyal kültürlerin uyumu karşılaştırmak için bir deney ve hesaplama iş akışıdır. QFA tek kültür odaklı gözlem uygulandı, ancak bağımsız kültürlerin binlerce kadar araştıran genom genetik etkileşim veya ilaç ekranlar için en yararlı olabilir. Merkezi deneysel yöntem inkübe ve düzenli çekilmiştir katı agar plaklarına bağımsız, seyreltik sıvı mikrobiyal kültürlerin aşılama olduğunu. Her zaman noktasından fotoğraflar nicel spor önlemler elde izin vererek, büyüme eğrileri oluşturmak için kullanılır kantitatif hücre yoğunluğu tahminleri, üretim, analiz edilir. Kültür uyumu ölçmek ve genetik etkileşimin güçlü veya ilaç hassasiyetleri rütbe karşılaştırılabilir. Herhangi bir tedavi kültür fitness üzerinde etkisi substrat agar (örneğin küçük moleküller, antibiyotikler veya besin) olarak eklenir veya plakaları dışarıdan uygulananly (örn. UV radyasyon, sıcaklık) QFA ile belirlenebilir.
QFA iş akışı büyüme oranı 96-veya 200-iyi plaka okuyucuları paralel sıvı kültürleri spektrofotometrik ölçülmesi ile elde edilen benzer tahmin üretir. Önemlisi, QFA tür yöntemleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek hızı daha vardır. QFA kültürleri sağlam bir agar yüzeyinde büyür ve bu nedenle de Karıştıktan gerek kalmadan büyüme sırasında havalandırılmakta.
QFA üretilen bazı Sentetik Genetik Array (SGA) tarama yöntemleri 5,6 o kadar yüksek değildir. QFA kültürlerin yoğun agara inoküle edilmeden önce seyreltilir beri Ancak, QFA 3 üstel ve doygunluk aşamaları da dahil olmak üzere daha kapsamlı büyüme eğrileri, yakalayabilir. Örneğin, büyüme eğrisi gözlemleri daha önce 1 anlatıldığı gibi kültür katlama süreleri, yüksek hassasiyetli doğrudan tahmin edilmesine olanak tanımaktadır.
Burada bir sunuyoruzBelirli QFA protokol S. binlerce uygulanan otomatik inokülasyon, inkübasyon ve görüntüleme sırasında robotlar tarafından işlenir cerevisiae kültürleri. Bu otomatik adımları herhangi üretilen bir azalma ile ilişkilendirilmiş, bir eşdeğer, manuel prosedürü ile değiştirilir, ve bu da daha düşük bir verim kılavuzu protokolü mevcut olabilir. Aynı QFA yazılım araçları ya da iş akışı içinde çekilen resimlere uygulanabilir.
Biz geniş bir deneyime tomurcuklanan maya kültürleri QFA uygulayarak var S. ama biz QFA fisyon maya kültürleri incelemek için eşit derecede yararlı olacağını bekliyoruz S. cerevisiae pombe ve bakteri kültürleri.
QFA birçok bakımdan bir doğrudan üç kurulan tezgah ölçekli mikrobiyolojik tekniklerin soyundan: kültür dilüsyon serisi nokta testleri 9, gazlı sıvı kültürleri 9 ve çoğaltma kaplama 13 büyüme eğrisi belirlenmesi. Bu üç yöntem özetlenmiş ve QFA ve Tablo 2'de diğer yüksek verimlilik teknikleri ile karşılaştırılmıştır. Dilüsyon serisi nokta testleri inokulum dilüsyonları bir dizi yetiştirilen kültürlerin bir dizi koloniler kurma yeteneğini bir zorlanma fitness tanımlamak Oysa, tek bir kültür tekrarlanan gözlemlere QFA önlemler gerginlik spor bir büyüme eğrisi inşa etmek. Tek bir kültürden spor miktarının daha fazla sayıda suşları aynı koşullar altında, eş zamanlı olarak incelenmiştir izin verir. Farklı ortamlarda veya genetik kökenli kültür spor farklılıkların test ederken kültürlerin çoğaltılıyor diziler çoğu yararlı suşu koleksiyonları, tekrarlanan test yapılmasını sağlar. QFA protokolü sunduBurada, bağımsız kültürleri (robotik QFA, Tablo 2) binlerce büyüme gözlemlemek için uygun inkübe ve görüntü agar, çoğaltmak aşılamak için pahalı robotik ekipman kullanır. QFA köklü, geleneksel laboratuvar teknikleri dayanmaktadır Bununla birlikte, aynı zamanda manuel adımları (manuel QFA, Tablo 2) robot yardımı yerine daha ucuza çok daha yapılabilir. Manuel QFA manuel pin aracı ve ve fotoğraflar için inkübatör plakalarını manuel aktarma yöntemi kullanarak agar plaklarına kültürlerin çoğaltma ve aşılama içerir. Aynı bilişimsel analizi akışı ya deney tasarımı gelen büyüme eğrilerinin üretmek için uygulanabilir.
QFA spor tahminleri nispeten kesin gibi görünüyor. Şekil 4'te, işlevsel olarak ilgili genin delesyonları dört örneğin kümelerinin ortalama uyumu vurgulanmıştır. İki bağımsızlık her işlevsel ilişkili gen sınıfın üyelerinin yakınent genetik kökenden (ura3Δ ve cdc13-1) QFA spor tahminlerinin tekrarlanabilirlik gösterir. Örneğin, sadece 3 gen delesyonu (dışarı olası 4.300 ile) korunmuş MRX kompleksinin üç üyesi ayırın.
Mikrobik suşların büyüme özellikleri test etmek için QFA Yüksek throughput alternatifler SGA 5,6, spektrofotometrik plaka okuyucuları optik yoğunluk kinetik yakalayarak rekabet barkodlu kütüphanelerde ekranlar 11,12 ve ekranlar dahil Tablo 2'de ve daha tam olarak başka bir yerde 8 açıklanan 10 . QFA ve kültürler katı agar yüzeyler (agar temelli yöntemler, Tablo 2) büyümek SGA tabak, robot tarafından hızlı ve kolay işlenebilir. Katı agar yüzeyinden kültürleri de büyüme boyunca havalandırılmakta ve hücrelerin sosyal mikroplar bir topluluk 14 büyürse, sabit kültürlerde büyüyebilir. Sol bozulmamış, mikrobiyal topluluklar birkendi mikro-ortam, örneğin etanol gibi salgılayan toksinler, ve muhtemelen hücreleri arasındaki sinyal ffect. Ancak, yeterli havalandırma sağlamak için gerekli sıvı kültürleri, karıştırma sürekli, yapay büyüme tarzlarını etkileyebilir mikrobiyal topluluklar ve onların mikro-ortamlar bozar. Kültürler arasındaki hücreleri taşıyan sıvı sıçraması için daha az fırsat olmadığı için çapraz kontaminasyon katı agar yöntemleri daha az kaygı verici olduğunu. Kontaminasyon katı agar tayinlerde yabancı hava yoluyla bulaşan mikroplar tarafından meydana gelirse, genellikle katı agar görsel muayene ile tespit ve hesaba veya kaldırılabilir.
QFA üretilen iki şekilde paralel sıvı yöntemlerine göre daha yüksektir. Öncelikle, QFA (ve SGA) tabaklarda, inoküle kültürleri plaka başına daha bağımsız kültür vererek, daha yoğun birlikte paketlenmiştir. QFA yılında 308 kültürleri deneysel olmayan kenar kültürler (Şekil 1) com saymazsak, genellikle vardırplaka başına 96 veya 100 kültürleri ile sıvı kültür paralel olarak hazırlandık. İkincisi, QFA deneyler plakaların çok daha büyük bir sayıya ölçeklendirilebilir. Tek bir QFA deneyde analiz plaka sayıda tek bir inkübatör ya sıcak bir odada, en az kabul edilebilir görüntü yakalama frekansı ve maksimum elde yakalama frekansı mevcut alan ile sınırlanmıştır ise, bir sıvı büyüme deneyde plakaların numarası kuvvetli sınırlıdır plaka okuyucu (tipik olarak bir ya da iki levha) veya plak okuyucu (tipik olarak 25-50 plakaları) eklenmiş istif bölmesi arasında kapasitesiyle. Yakın zamanda 37.884 eşzamanlı kültürleri vererek, 308 deneysel kültürleri olan 123 tabak, her bir tam otomatik QFA deney gerçekleştirdi. Biz sıvı büyüyen bağımsız kültürlerin maksimum elde edilebilir sayısı 96 (kültür / plaka) olduğu tahmin bizim QFA verimi az on misli civarındadır x 50 (tabak / istifleyici) = 4800. Sıvı kültür ekranları için alternatif bir çok otomatikleştirilmiş gro kullanmaktırparalel wth cihazları (8 Blomberg tarafından incelemesi ile Tablo 1), bir ya da iki levha bir kapasiteye sahip her. Her cihaz Sıcaklık kontrolü bağımsızdır ve bu nedenle şartlar aynı değildir, ama onlar olduğunu varsayarak, bu iş en az 190 tür cihazların QFA throughput (cihaz başına 200 sıvı kültürleri varsayarak) maç gerektirecektir.
Özetle, QFA yararlı küçük ölçekli odaklanmış deneyler ve yüksek işlem ekranlar hem de nicel büyüme fenotipleri toplamak için uygulanabilir yüksek kaliteli bir iş akışıdır. Robotik ekipman için gereksinimleri değişen etkili uygulanacak esnektir. QFA iş akışının bilgisayar bileşeni serbestçe kullanılabilir, açık kaynak kodu dayanmaktadır.
The authors have nothing to disclose.
Biz minnetle ve laboratuvar desteği ve yararlı tartışmalar için Yaşlılık ve Beslenme (CISBAN) Entegre Sistem Biyolojisi Merkezi'nin tüm üyeleri kabul ediyorsunuz. Bu çalışma, Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) (BB/C008200/1) ve Wellcome Trust (075.294, 093.088) tarafından desteklenmiştir.
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.