健身定量分析(QFA)是一系列估计微生物培养适应度的实验和计算方法的互补。 QFA估计的基因突变,药物或其他适用于微生物的生长治疗的效果。可以设计实验缩放从单一文化的集中分析数以千计的并行文化。
定量健身分析(QFA)是为适应度比较在1,2,3,4平行生长的微生物培养的实验和计算的工作流程。 QFA可以应用于单一文化的集中的意见,而且是最有用的全基因组的遗传相互作用或药物屏幕调查到数以千计的独立文化。中央实验方法是独立的,稀的液体微生物固体琼脂平板上培养和定期拍下文化的接种。从每个时间点的照片进行了分析,生产定量细胞密度估计,这是用来兴建的生长曲线,从而得到定量的健身措施。文化适应度可以比较量化和排序遗传相互作用的优势或药物的敏感性。任何治疗的健身文化的影响补充到基板琼脂(如小分子物质,抗生素或营养)或适用于板的外部LY(如紫外线照射,温度),可量化的QFA。
QFA工作流程产生类似于光度法测量平行的液体培养在96孔或200井板读者获得的增长率估计。重要的是,QFA与这些方法相比有显着更高的吞吐量。 QFA文化上生长了坚实的琼脂表面,因此在增长,而不需要进行搅拌或摇晃充气。
QFA吞吐量不高,一些合成基因阵列(SGA)的筛选方法5,6。然而,由于严重之前被接种到琼脂稀释QFA文化,QFA可以捕捉更完整的生长曲线,包括指数和饱和阶段3。例如,生长曲线观察允许直接与高精度培养倍增时间估计,作为讨论以前1。
在这里,我们提出了具体QFA协议适用于成千上万的S.酵母是由机器人自动处理文化在孕育,孵化和成像。这些自动化的任何步骤可以由具有同等作用,手动程序取代,吞吐量减少,我们也提出一个较低的吞吐量手册协议。 QFA相同的软件工具可以应用在任何工作流程中捕获的图像。
我们有丰富的经验,申请QFA芽殖酵母培养学酵母 ,但我们预计,,QFA将证明裂殖酵母为研究文化同样有用S。酵母和细菌培养。
QFA是在许多感官的直接后裔三立台规模的微生物技术:文化系列稀释现场测试9,生长曲线的测定充气液体培养和副本电镀13。这三种方法进行了总结和与QFA和其他高通量技术在表2比较。而稀释系列现场测试定义为应变能力,形成一系列种植范围从接种稀释的文化殖民地的健身,QFA措施,由一个单一的文化反复观察应变健身构建一个增长曲线。量化健身从单一的文化,让更多株进行检查,同时在相同条件下。文化复制阵列允许重复的应变集合,最有效的测试时,测试在不同的环境或遗传背景的文化健身差异。 QFA协议介绍这里使用昂贵的机器设备,复制,接种,孵育和图像琼脂平板上,适当的观察数以千计的独立文化(机器人QFA, 表2)的增长。然而,由于QFA是既定的,传统的实验室技术为基础,它也可以进行更便宜,取代手工步骤(手动QFA, 表2)机器人援助。手动QFA涉及复制和接种到琼脂平板上培养使用手册针板和摄影的孵化器的工具和手动传输。可应用于相同的计算分析工作流程,无论从实验设计产生的生长曲线。
QFA健身的估计似乎是比较精确。在图4中,突出四个功能相关的基因缺失,例如集群的平均适应度。每个功能相关的基因类成员的接近两independ耳鼻喉科遗传背景(ura3Δ和cdc13-1)表示QFA健身估计的可重复性。例如,只有3个基因缺失(走出了一条可能的4300)分开保守的MRX复杂的三名成员。
QFA为测试微生物菌种的生长特性,高吞吐量的替代品,包括SGA的5,6,竞争屏幕11,12条码库和屏幕捕捉光密度动力学分光板读者10总结在表2和更全面的描述别处8 。 QFA和SGA板,文化固体琼脂表面(琼脂为基础的方法, 表2)成长由机器人可以快速,轻松地处理。固体琼脂表面培养良好的透气性,整个生长和细胞可以生长在固定的文化,让交际的微生物生长在一个社区14。原封不动,微生物群落ffect自己的微环境,如乙醇分泌毒素,并可能在细胞之间的信号。然而,连续的混合液体培养,要达到足够的通风,人为破坏微生物群落和它们的微环境,这可能会影响他们的成长模式。交叉污染是在固体琼脂方法的关注,因为有较少的机会进行不同文化之间的细胞的液体飞溅。如果外国空气传播,在固体琼脂检测微生物污染时,它往往可以通过目测固体琼脂平板进行检测,并占或删除。
QFA吞吐量明显比两种方式并行的液体方法。首先,QFA(SGA)的板,接种培养挤在一起更密集,给每盘更独立的文化。在QFA通常有308文化,不计非实验性的边缘文化( 图1)COM相比,每盘96或100文化与平行的液体培养。其次,QFA实验还可以扩展到更大的板材数量。 QFA在一个单一的实验分析板的数量,而只由孵化器或温暖的房间里,允许的最小图像采集频率和达到的最大捕获频率的可用空间的限制,在液体中的生长实验板的数量是强烈有限酶标仪(通常是一个或两个板块),或连接到酶标仪(通常为25-50板)的堆的容量。最近,我们进行完全自动化的QFA上123板,每个实验308实验的文化,同时给予37884文化。我们估计,在液体中越来越多的独立文化的最大实现数是96(文化/板)×50(板/堆叠器)= 4800,这是QFA吞吐量比我们少十倍左右。液体培养屏幕的另一种方法是利用许多自动化GROWTH设备并行( 表从审查布隆贝格8 1),每有一个或两个板块的能力。在每个设备的温度控制是独立的,这样的条件是不相同的,但假设它们,这个工作流程将需要至少190个此类设备QFA吞吐量(假设200%液体培养设备)相匹配。
总之,QFA是一个高质量的工作流程,可以有效地聚集在数量增长的表型集中两个小规模试验和高通量筛选。它是足够灵活,有效地应用于机器人设备的要求不一。 QFA工作流程的计算组件的基础上的自由,开放的源代码。
The authors have nothing to disclose.
我们非常感谢我们的实验室和老龄化,支持和有益的讨论营养(CISBAN)集成系统生物学中心的所有成员。这项研究是由生物技术和生物科学研究理事会(BBSRC)(BB/C008200/1)和威康信托基金会(075294,093088)。
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.