التحليل الكمي لياقة (QFA) هو عبارة عن سلسلة متكاملة من الطرق التجريبية وحسابية لتقدير اللياقات ثقافة الميكروبية. QFA تقدر تأثير الطفرات الوراثية، والمخدرات، أو غيرها من العلاجات المطبقة على نمو الميكروب. ويمكن تصميم التجارب التحجيم من تحليل مركزة من الثقافات وحيد للآلاف من ثقافات موازية.
التحليل الكمي لياقة (QFA) هو سير العمل التجريبية والحسابية لمقارنة اللياقات الثقافات الميكروبية التي تزرع في 1،2،3،4 مواز. ويمكن تطبيق QFA إلى الملاحظات تركز على ثقافات واحد ولكن مفيدة جدا لالجينوم على نطاق التفاعل وراثية أو شاشات المخدرات التحقيق تصل إلى الآلاف من ثقافات مستقلة. الأسلوب المركزي التجريبية هو تلقيح مستقل، والثقافات المخففة الميكروبية السائل على لوحات أجار الصلبة التي حضنت وتصويرها بصورة منتظمة. ويتم تحليل الصور من كل نقطة في الوقت، وإنتاج كمي تقديرات كثافة الخلية، والتي تستخدم لبناء منحنيات النمو، مما يسمح للياقة البدنية المستمدة التدابير الكمية. ويمكن مقارنة اللياقات ثقافة لتحديد نقاط القوة وترتيب تفاعل وراثية أو حساسيات المخدرات. واضاف تأثير على اللياقة البدنية ثقافة أي علاجات في أجار الركيزة (الجزيئات الصغيرة على سبيل المثال، والمضادات الحيوية أو المواد الغذائية) أو تطبيقها على لوحات خارجيةويمكن لاي كميا (مثل الأشعة فوق البنفسجية إشعاع، ودرجة الحرارة) من قبل QFA.
سير العمل QFA تنتج نسبة نمو تقدر مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها بواسطة قياس الطيف من الثقافات سائل موازية في القراء لوحة 96-جيدا أو 200 حسنة. الأهم من ذلك، QFA لديه سرعة أعلى بكثير بالمقارنة مع مثل هذه الأساليب. الثقافات QFA تنمو على سطح صلب أجار وبالتالي فهي مهوى بشكل جيد خلال نمو من دون الحاجة إلى إثارة أو اهتزاز.
QFA الإنتاجية ليست مرتفعة كما أن من صفيف بعض الوراثية الاصطناعية (SGA) أساليب الفحص 5،6. ومع ذلك، منذ يتم تخفيفه بشكل كبير الثقافات QFA قبل أن يتم تلقيح على أجار، ويمكن التقاط QFA منحنيات النمو أكثر اكتمالا، بما في ذلك الأسي ومراحل التشبع 3. على سبيل المثال، ملاحظات منحنى نمو السماح يقدر مرات مضاعفة ثقافة مباشرة مع دقة عالية، كما نوقش سابقا 1.
نحن هنا يقدمتطبيق بروتوكول معين QFA إلى الآلاف من S. خميرة الثقافات التي يتم معالجتها تلقائيا بواسطة الروبوت خلال الحضانة، والتلقيح والتصوير. يمكن استبدال أي من هذه الخطوات الآلي عن طريق إجراء، أي ما يعادل دليل، مع تخفيض المرتبطة في الإنتاجية، ونقدم أيضا دليلا انخفاض الإنتاجية بروتوكول. ويمكن تطبيق البرنامج QFA نفس الأدوات لالصور التي تم التقاطها في أي من سير العمل.
لدينا خبرة واسعة في تطبيق QFA إلى ثقافات الخميرة في مهدها س. خميرة لكننا نتوقع أن QFA سوف تكون مفيدة على حد سواء لدراسة الثقافات من الخميرة الانشطار س. pombe والثقافات البكتيرية.
QFA هو في كثير من الحواس مباشرة من نسل ثلاث تقنيات مقاعد البدلاء النطاق أنشئت الميكروبيولوجية: ثقافة الاختبارات بقعة تخفيف سلسلة 9، نمو تحديد منحنى في الثقافات الغازية السائلة (9) وطبق الطلاء 13. وتتلخص هذه الأساليب الثلاثة، وبالمقارنة مع QFA وغيرها من تقنيات عالية الإنتاجية في الجدول رقم 2. في حين أن اختبارات تخفيف بقعة سلسلة تعريف اللياقة البدنية سلالة كما قدرتها على تشكيل مستعمرات في سلسلة من الثقافات نمت من مجموعة من التخفيفات اللقاح، QFA اللياقة البدنية سلالة التدابير الملاحظات المتكررة من ثقافة واحدة لبناء منحنى النمو. قياس اللياقة البدنية من ثقافات واحد يسمح للفحص سلالات كثيرة في وقت واحد، في ظل ظروف مماثلة. صفائف تكرار للثقافات يسمح التجارب المتكررة لمجموعات الضغط، من المفيد للغاية عند اختبار اللياقة البدنية للاختلافات الثقافية في بيئات مختلفة أو خلفيات وراثية. قدم بروتوكول QFAهنا يستخدم معدات آلية مكلفة لتكرار، تطعيم، واحتضان لوحات أجار صورة، مناسبة لمراقبة نمو الآلاف من الثقافات المستقلة (QFA الروبوتية، الجدول 2). ومع ذلك، منذ يستند على QFA الراسخة، وتقنيات مختبر التقليدية، فإنه يمكن أيضا أن تنفذ أكثر من ذلك بكثير بأسعار رخيصة عن طريق الاستعاضة عن مساعدة الروبوت مع الخطوات اليدوية (دليل QFA، الجدول 2). دليل QFA ينطوي على تكرار وتلقيح الثقافات على لوحات أجار باستخدام أداة دبوس دليل ودليل نقل لوحات من وإلى حاضنة للتصوير الفوتوغرافي. ويمكن تطبيق نفس التحليل سير العمل الحسابية لتوليد منحنيات النمو سواء من التصميم التجريبي.
QFA تقديرات لياقة بدنية ويبدو أن يكون دقيقا نسبيا. في الشكل (4)، ويسلط الضوء على اللياقات متوسط مجموعات سبيل المثال أربعة من الحذف وظيفيا الجينات ذات الصلة. على مقربة من أعضاء كل فئة الجينات المرتبطة وظيفيا في اثنين من استقلالخلفيات والأنف والحنجرة وراثية (ura3Δ وcdc13 1) يدل على استنساخ من التقديرات لياقة بدنية QFA. على سبيل المثال، والحذف الجين فقط 3 (من أصل 4300 أمكن) فصل ثلاثة من أعضاء مجمع MRX حفظها.
الإنتاجية العالية لبدائل QFA لاختبار خصائص نمو السلالات الميكروبية وتشمل SGA 5،6، والشاشات المنافسة في المكتبات barcoded 11،12 وشاشات التقاط حركية الكثافة البصرية في لوحة القراء طيفية 10 التي تتلخص في الجدول رقم 2، ووصف أكثر في مكان آخر تماما 8 . يمكن التعامل معها QFA وألواح SGA، حيث الثقافات تنمو على السطوح الصلبة أجار (الأساليب القائمة على أجار، الجدول 2) بسرعة وسهولة عن طريق الروبوت. يتم تهوية جيدة الصلبة الثقافات سطح أجار طوال النمو والخلايا يمكن أن تنمو في الثقافات ثابت، مما يسمح للميكروبات مؤنس أن تنمو في المجتمع 14. تركت سليمة، والمجتمعات الميكروبية 1ffect الخاصة الصغيرة البيئات، وإفراز مواد سامة مثل الإيثانول، وربما يشير الى ما بين الخلايا. ومع ذلك، مستمرة اختلاط الثقافات السائل، واللازمة لتحقيق تهوية كافية، يعطل بشكل مصطنع المجتمعات الميكروبية والبيئات الصغيرة الخاصة بهم والتي قد تؤثر على وسائط نموها. عبر تلوث هو اقل مدعاة للقلق في طرق أجار الصلبة لأنه ليس هناك أقل فرصة لطخات تحمل خلايا السائل بين الثقافات. إذا تلوث يحدث من قبل الميكروبات المحمولة جوا الأجنبية في المقايسات أجار الصلبة، ويمكن في كثير من الأحيان يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص البصري لوحات أجار الصلبة واستأثرت أو إزالتها.
QFA الإنتاجية أعلى بكثير من الطرق الموازية السائل بطريقتين. بادئ ذي بدء، على لوحات (وSGA) QFA، معبأة الثقافات تلقيح معا بصورة أكثر كثافة، وإعطاء المزيد من الثقافات مستقلة لكل لوحة. في QFA هناك عادة 308 الثقافات، لا عد الثقافات حافة غير التجريبية (الشكل 1) COMقلص موازية لثقافات السائل مع 96 أو 100 لوحة لكل الثقافات. ثانيا، يمكن تحجيم تجارب QFA إلى عدد أكبر بكثير من لوحات. في حين يقتصر عدد من اللوحات التي تم تحليلها في تجربة واحدة فقط من قبل QFA المساحة المتوفرة في غرفة الحاضنة أو الحارة، إلا أن الحد الأدنى المسموح به تردد التقاط الصور، والحد الأقصى تردد القبض على تحقيقها، وعدد من لوحات في تجربة النمو سائل محدودة بقوة من قدرة القارئ لوحة (عادة واحد أو اثنين لوحات)، أو من مكدس تعلق على قارئ لوحة (عادة 25-50 لوحات). وقد قمنا مؤخرا بإجراء تجربة QFA مؤتمتة بالكامل على 123 لوحات، ولكل منها 308 الثقافات التجريبية، وإعطاء 37884 الثقافات في وقت واحد. نقدر أن العدد الأقصى للتحقيق مستقل من الثقافات المتزايد في السائل هو 96 (ثقافات / لوحة) × 50 (لوحات / مكدس) = 4800، والذي هو حوالي عشرة أضعاف أقل من الإنتاجية QFA لدينا. بديلا عن الشاشات ثقافة السائل هو للاستفادة من العديد الآلي غرووث الأجهزة في نفس الوقت (الجدول 1 من هذا الاستعراض من قبل بلومبرغ 8)، ولكل منها بطاقة واحدة أو اثنتين لوحات. التحكم في درجة الحرارة في كل جهاز مستقل، وهكذا ظروف ليست متطابقة، ولكن على افتراض أنهم، فإن هذا العمل يتطلب ما لا يقل عن 190 مثل هذه الأجهزة لتتناسب مع QFA الإنتاجية (على افتراض 200 الثقافات السائل في الجهاز).
وخلاصة القول، QFA هو سير العمل عالية الجودة والتي يمكن تطبيقها على نحو مفيد لجمع الظواهر النمو الكمي في كل من التجارب الصغيرة ركزت وشاشات عالية الإنتاجية. انها مرنة بما فيه الكفاية ليتم تطبيقها على نحو فعال مع اختلاف الاحتياجات من المعدات الآلية. ويستند العنصر الحسابية لسير العمل في QFA متاحة بحرية، وشفرة المصدر المفتوح.
The authors have nothing to disclose.
نحن نعترف بامتنان جميع أعضاء مختبرنا ومركز علم الأحياء النظام المتكامل للشيخوخة والتغذية (CISBAN) للحصول على الدعم ومناقشات مفيدة. وأيد هذه الدراسة عن طريق البحث التكنولوجيا الحيوية والعلوم البيولوجية المجلس (BBSRC) (BB/C008200/1) ويلكوم ترست (075294، 093088).
Name of reagent/equipment | Company | Catalogue number | Yorumlar |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | 96 pin manual pintool with 1/8 ” diameter pins |
Mix Mate | Eppendorf | 5353 000.014 | |
Biomek FX | Beckman | A31842 | |
Teleshake | Thermo Scientific | 50095890 | Installed on Biomek FX |
BM3-SC | S&P Robotics Inc | BM3-SC | 192 shelf rotating carousel |
spImager | S&P Robotics Inc | spImager | High resolution manual imaging |
spImager with Cytomat | S&P Robotics Inc | Custom | Temperature controlled automated high resolution imaging |
Cytomat 6001 with heat exchanger | Thermo Scientific | 51022222 | Attached to spImager |
Ecoline RE207 | Lauda | RE207 | Attached to Cytomat |
spImager with carousel | S&P Robotics Inc | Custom | Automated high resolution imaging |
Robot pin tool fixture for FP12pins | V&P Scientific | AFIX96FP12 | N/A |
96 x FP12 pins | V&P Scientific | FP12 | 50.4 mm long, 17 mm exposed pin length |
Docking Station for Pin Tool | V&P Scientific | VP425 | Docking station base removed to allow fan drying of pins |
Pin Cleaning Brush | V&P Scientific | VP425 | N/A |
Replica Plater | Sigma | R-2508 | Manual pin tool |
Nunc OmniTray with Lid | Nunc | 734-0490 | N/A |
96 well sterile polystyrene plates | Greiner BioOne | 655161 | N/A |
96 well sterile polystyrene lids | Greiner BioOne | 656171 | N/A |
Table 3. Specific reagents and equipment.