Un protocollo generale per lo studio di invasione delle cellule ospiti da un agente patogeno batterico, concentrandosi su<em> Staphylococcus aureus</em> E cellule endoteliali umane.
Qui si descrive il modo in cui studiare l'invasione di cellule endoteliali umane da Staphylococcus aureus batteri patogeni. Il protocollo generale può essere applicata allo studio di invasione delle cellule da qualsiasi batterio coltivabili. Le fasi in cui aspetti specifici di invasione possono essere studiati, come il ruolo di riassetto actina o caveolae, sarà evidenziata. Cellule ospiti sono coltivate in fiaschi e quando è pronto per l'uso sono seminate in piastre da 24 pozzetti contenenti coprioggetto Thermanox. Utilizzando coprioggetto permette successiva rimozione delle cellule dai pozzi per ridurre le interferenze da proteine del siero depositato sui lati dei pozzi (a cui S. aureus sarebbe allegare). I batteri sono cresciuti alla densità richiesta e lavate per eliminare ogni proteine secrete (ad esempio tossine). Coprioggetto con strati confluenti di cellule endoteliali vengono trasferiti al nuovo 24-pozzetti contenenti mezzo fresco cultura prima che l'aggiunta di batteri. I batteri e le cellule vengono poi incubate insieme per la quantità di tempo in 5% CO 2 a 37 ° C. Per S. aureus questo è in genere tra 15-90 minuti. Coprioggetto Thermanox vengono rimossi da ogni pozzetto e dip-lavati in PBS per rimuovere i batteri separati. Se il totale dei batteri associati (aderente e interiorizzate) devono essere quantificati, lamelle vengono poi poste in un pozzo fresco contenente 0,5% Triton X-100 in PBS. Pipettaggio dolce porta alla completa lisi delle cellule e batteri sono enumerate dalla diluizione seriale e piastrato su agar. Se il numero di batteri che hanno invaso le cellule è necessario, coprioggetto sono aggiunti ai pozzetti contenenti 500 microlitri terreno di coltura di tessuto integrato con gentamicina e incubazione continuato per 1 ora, che uccidono tutti i batteri esterni. Coprioggetto possono poi essere lavate, le cellule lisate e batteri enumerate dalla piastrato su agar come descritto sopra. Se l'esperimento richiede una visualizzazione diretta, coprioggetto possono essere fissate e colorate per la microscopia ottica, fluorescenza o confocale o preparati per microscopia elettronica.
Il test che descriviamo si basa sul test di protezione gentamicina, che è stato ampiamente utilizzato per studiare l'invasione delle cellule ospite da batteri. Osservazioni della incapacità degli antibiotici gentamicina e di altri per uccidere i batteri intracellulari sono state utilizzate nei primi studi l'invasione delle cellule ospiti per 4-8 batteri. L'uso di 24, 48 o anche 96-pozzetti permette la generazione di grandi quantità di dati quantitativi e riproducibile in un breve periodo di tempo ea costi relativamente bassi. Il saggio è interessante anche perché non richiede attrezzature specialistiche, può essere adattata per lavorare con vari batteri e cellule, e può essere utilizzato per studiare il ruolo dei processi cella sia batterica e host in invasione 9. Infatti, sin dai primi esperimenti, l'analisi di protezione gentamicina è stato ampiamente utilizzato per misurare la cellula ospite invasione da una serie di diversi batteri o anche combinazioni di batteri 10,11. Mentre i principi fondamentali sono gli stessi, molte sottili variazioni nel metodo sono stati segnalati. In questo articolo abbiamo descritto la nostra versione e indicato dove le modifiche possono essere necessarie per altri batteri o cellule ospiti. Quando si progetta un esperimento per misurare la cellula invasione host utilizzando questo approccio ci sono una serie di punti importanti da considerare:
Sensibilità batterica alla gentamicina. Questo può sembrare ovvio, ma è importante assicurarsi che il batterio è in fase di studio sensibili alla gentamicina alla temperatura concentrazione, e per tutta la durata di tempo da utilizzare. Nel caso di insensibilità, potrebbe essere possibile utilizzare altri antibiotici 5. Un approccio alternativo può essere quello di utilizzare enzimi litici (lysostaphin, mutanolysin, lisozima) 12.
Incubazione e l'inoculo. Quando si esegue questo test per la prima volta che è importante stabilire i tempi ottimali di incubazione, e l'inoculo dei batteri da utilizzare. Pertanto, esperimenti iniziali dovrebbe esaminare sia l'adesione e l'invasione nel tempo (5 minuti a un massimo di 6 ore). E 'anche importante valutare come l'invasione è influenzata dalla molteplicità di infezione (MOI; numero di batteri per cella). In generale è meglio usare il minor numero possibile di batteri in quanto riduce i danni alle cellule in coltura. Importanti differenze tra ceppi possono essere perse se i periodi di incubazione prolungato o di grandi dimensioni vengono utilizzati inoculi 9,13.
Danno cellulare. E 'importante lavare i batteri prima dell'uso. Tuttavia, il danno cellulare non si limita alla produzione di tossine. Invasione batterica, induzione di apoptosi e di interruzione delle normali funzioni cellulari possono causare danni cellulari. Questo può portare alla penetrazione di gentamicina nella cellula, uccidendo i batteri interiorizzato e dando l'impressione che l'invasione non si è verificato 14.
Condizioni di incubazione. La temperatura e la composizione del terreno di coltura può avere un impatto significativo sulla invasione. Per esempio, l'invasione delle cellule HeLa da Streptococcus pyogenes dipende dalla presenza di fibronectina solubile, che è tipicamente presente nel siero 15. Un'altra considerazione è la crescita dei batteri nel terreno di coltura nel corso dell'esperimento.
Cultura e quantificazione dei batteri intracellulari. Sebbene TX-100 non può uccidere i batteri intracellulari, può inibire la loro crescita. Come tale, è importante controllare la replicazione batterica su terreno solido, in presenza del detergente. Qualora interessati, può essere possibile usare concentrazioni più basse di detersivo o di utilizzare in alternativa come saponina. Un vantaggio del test di protezione gentamicina sulla colorazione viola cristallo e analisi di microscopia è che è meno laborioso, e consente il rilevamento e la differenziazione di sub-popolazioni di batteri interiorizzato. Per esempio, S. aureus può produrre sia un tipo normale colonia (NCT) o la variante piccola colonia (SCV) 16, che non sarebbero distinguibili al microscopio di singole cellule batteriche. Un vantaggio della colorazione viola cristallo e analisi di microscopia sui test di protezione gentamicina è aggregazione delle cellule possono essere considerati e che i batteri intracellulari che entrano in un 'vitale ma non coltivabili' stato verrà rilevato 17.
Esaminando il ruolo dei processi nella cellula ospite invasione batterica. Molti studi hanno impiegato inibitori della funzione della cellula ospite come citocalasina D, che interferisce con riarrangiamento actina. Tali studi possono includere anche gli anticorpi che colpiscono i recettori della superficie cellulare e knockdown siRNA di specifici geni 18. È di vitale importanza per garantire che questi trattamenti non influiscono sulla vitalità o attaccamento di cellule in coltura o avere effetti tossici sui batteri.
Direzioni future:
CONTENUTO "> Perché questo test è di solito eseguita in lastre multi-cellula e cultura, è teoricamente possibile adattare ad un high-throughput operazione di screening, che potrebbe comportare l'esame di librerie di potenziali cellule funzione inibitori, anti-infettivi o antibiotici progettate per colpire i batteri intracellulari. In alternativa, un tale approccio potrebbe essere utilizzato per lo screening di librerie di mutanti identificare i geni coinvolti nella adesione, invasione o la sopravvivenza intracellulare. In alcuni casi può essere opportuno inserire forze di taglio (flusso) nel sistema modello, per esempio quando la modellazione l'endotelio, per imitare più da vicino l'ambiente in vivo. attuali progressi nella progettazione e nella produzione di celle di flusso e microfluidica sistemi di colture cellulari offrono la possibilità di impiegare il dosaggio protezione gentamicina in ospite-patogeno modelli che incorporano forze di taglio.In sintesi, il protocollo qui descritto si basa su approcci simili utilizzati per molti anni. È ampiamente applicabile a molti tipi di cellule in coltura e specie batteriche e in grado di generare grandi quantità di dati in modo rapido ed a costi relativamente poco.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust (WT 0795880).
Material Name | Tip | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Invitrogen | 31885-023 | ||
Brain heart infusion | BioChemika | 53286 | ||
Foetal bovine serum | Invitrogen | 10091-148 | ||
HUVECs | Lonza | CC-2519 | ||
Endothelial basal medium | Lonza | CC-3121 | ||
Bovine brain extract (including heparin) | Lonza | CC-4092 | ||
Human endothelial growth factor | Lonza | CC-4017C | ||
Hydrocortisone | Lonza | CC-4035C | ||
GA-1000 | Lonza | CC-4092C | ||
Gentamicin | Invitrogen | 15710 | ||
Lysostaphin | AMBI | LSPN-50 | ||
Thermanox coverslips | Thermo Fisher | TKT-210-330P | ||
Triton X-100 | Sigma | T8787 | ||
Cytopath | TCS Biosciences | HC8595 | ||
Crystal violet | Sigma | C3886 | ||
Trypsin-EDTA | Sigma | T4049 | ||
T75 flasks | Thermo Fisher | 430641 | ||
Cytochalasin D | Sigma | C2618 | ||
Methyl-B-cyclodextrin | Sigma | 332615 |