La invasión de las células humanas por un patógeno bacteriano

El protocolo siguiente se describe el estudio de la invasión de las células endoteliales por S. aureus, pero en teoría puede ser utilizada para estudiar la invasión celular por cualquier bacteria cultivables. Etapas específicas de S. Las células endoteliales aureus y se indican. 1. Preparación de las bacterias Cultura S. por cepas de Staphylococcus 04.16 h (en función de la fase de crecimiento es necesario) en 10 ml de infusión cerebro-corazón (BHI) caldo de cultivo a 37 ° C en el aire con agitación a 200 rpm. Estas condiciones de crecimiento son específicos para S. aureus y pueden necesitar ser adaptado para otras bacterias. Lávese las bacterias en tres ocasiones en la Dulbecco modificado de Eagle (DMEM; Invitrogen) por rondas alternas de centrifugación a temperatura ambiente (5.000 x g, 10 min), la eliminación del sobrenadante del cultivo y la resuspensión del sedimento bacteriano en un volumen equivalente de DMEM. Medir la densidad óptica de la suspensión resultante de bacterias que se pueden ajustar según sea necesario. Para S. aureus, preparamos una suspensión a OD 600 = 1, que corresponde a ~ 10 9 ufc ml -1. 2. Cultivo de células endoteliales La cultura de la línea de células endoteliales EA.hy926 1 en DMEM suplementado con suero bovino fetal (FBS; 10%) y L-glutamina (2 mM) a 37 ° C en CO2 al 5%. Por otra parte, se agruparon las células humanas primarias endoteliales de vena umbilical (HUVEC) se pueden adquirir de Lonza (Basilea, Suiza) y se cultivaron en un medio endotelial basal suplementado con FBS al 2%, extracto de cerebro bovino (incluida la heparina), el factor humano de crecimiento del endotelio y la hidrocortisona a 37 ° C en 5% de CO 2 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Lonza). Estas condiciones de crecimiento son específicos para estas células y pueden necesitar ser adaptados para otros tipos de la célula huésped. Se cultivan las células endoteliales en frascos T75 para completar la confluencia, verificado por los ojos. Preparar las placas de 24 pozos para la inserción de los cubreobjetos. Pinzas finas (llama esterilización) se necesitan para mover el cubreobjetos, que tienen una superficie brillante y opaco uno. Cubreobjetos a cabo en los pozos de la placa de 24 pocillos con la superficie opaca hacia arriba para permitir la adhesión celular. Liberar a las células del frasco T75 con 3 ml de tripsina-EDTA (0,25%) y añadir 10 ml del medio de cultivo correspondiente. Añadir 500 l de células se resuspendió en 24 y placas que contienen cubreobjetos Thermanox vidrio. Un frasco T75 confluentes de células proporcionan suficientes células por dos placas de 24 pozos, lo que resulta en aproximadamente 5 × 10 5 células por pozo (en 500 l medio). Incubar las placas durante 48 horas como se describe anteriormente, y verificar 100% de confluencia de células al microscopio de luz invertida. Dip de lavado cubreobjetos en PBS y añadir nuevas placas de 24 pocillos que contiene 490 l MEDM con 10% de SFB en cada pozo. Para examinar el papel de determinados procesos metabólicos en la invasión celular, los inhibidores se pueden añadir a las células cultivadas 1 h antes de la adición de las bacterias y las concentraciones de mantener durante el ensayo. Por ejemplo, para determinar el papel de la reorganización de la actina en S. aureus invasión de las células endoteliales, 50 M citocalasina D se pueden añadir, o para el papel de caveolas, 5 mM metil-β-ciclodextrina se puede añadir. 3. La invasión de ensayo Añadir 10 l de bacterias lavado (aproximadamente, 2 x 10 7 ufc ml -1 S. aureus) a cada pocillo con un cubreobjetos se lavaron con una capa confluente de células endoteliales en 490 l DMEM con 10% de SFB. Incubar durante 15-90 minutos a 37 ° C en 5% de CO 2. Para medir el número total de bacterias asociadas con las células (adherente e internalizado), baño de lavado de los cubreobjetos tres veces en PBS y se añade a los pozos nuevos con 500 l 0,5% de Triton X-100 en PBS. Para asegurarse de que las células totalmente lisis y la liberación de todas las bacterias internalizadas, pipeta varias veces, señalando que la punta de la pipeta directamente en la superficie del cubreobjetos. Enumerar las bacterias en placas de la suspensión líquida (o diluciones de esta en caso necesario) sobre la superficie de las placas de TSA. Desde TX-100 se lisar muchas bacterias Gram-negativas, la saponina se puede utilizar en lugar de dos. Para medir el número de bacterias internalizadas, separar el sobrenadante de cultivo de cada bacteria no consolidados y que contiene y reemplazar con 500 l de FBS DMEM/10% suplementado con 200 mg ml -1 gentamicina. Nosotros usamos la gentamicina en lugar de lysostaphin aquí, ya que es más barato y nos permite cambiar entre los experimentos con diferentes tipos de bacterias (por ejemplo, los estafilococos y Lactococci) sin tener que cambiar el protocolo experimental. Incubar las placas a 37 ° C en 5% CO 2 durante 60 minutos para matar todas las bacterias extracelulares. Lave cubreobjetos 3 veces en PBS,lisis y enumerar en placas TSA a la descrita para el ensayo de adhesión anteriormente. En algunos casos puede ser preferible contar visualmente el número de bacterias mediante microscopía de luz. En este caso, y específico para S. aureus invasión celular, el uso lysostaphin (10 mg ml -1) en lugar de gentamicina para destruir físicamente las bacterias extracelulares. Incubar cubreobjetos de 20 minutos a 37 ° C en CO 2 en la solución de lysostaphin, luego enjuague y fijar con Cytopath (Cellpath). Inundar el cubreobjetos con cristal violeta (0,5% w / v) durante 5 minutos. Dip-enjuague con agua, aire seco y montaje en portaobjetos de vidrio. El número de bacterias por mm 2 de las células endoteliales confluentes se puede cuantificar mediante microscopía de luz. 4. Los resultados representativos: Expresión de proteínas de unión a la fibronectina (FnBPA y FnBPB) en la superficie de S. aureus confiere la capacidad de invadir las células endoteliales. Un trabajo reciente ha redefinido el dominio de unión a fibronectina de FnBPA 3. De tipo salvaje (WT) S. aureus 8.325,4 invade las células endoteliales con una alta eficiencia, mientras que una cepa que carecen de ambos FnBPA y B (Δ FNB) mostraron niveles significativamente reducidos de internalización (Figura 1). Complementación del mutante con un plásmido que codifica una FNB menos el dominio de unión a fibronectina (pFnR0) no promover la invasión (Figura 1). Por el contrario, la complementación de los mutantes con un plásmido que codifica la FNB todo un gen (pFnBA4) restauró la invasión de los niveles de WT (Figura 1). El papel de FnBPA en la invasión de las células endoteliales también se puede demostrar utilizando la expresión heteróloga Lactococcus lactis anfitrión. Expresión de plásmidos codifican FnBPA en L. lactis (pRM9 9) no mejoran significativamente la adhesión a células endoteliales en comparación con las bacterias que expresan no FnBPA (CTL) (bares abiertos, Figura 1B). Por el contrario, FnBPA expresan L. lactis invadido las células endoteliales a niveles significativamente más altos que la cepa no expresa (bares cerrados, Figura 1B). Los experimentos se llevaron a cabo cuatro veces por duplicado y la media ± desviación estándar se presenta. * Representan los datos que son estadísticamente significativa (p = <0,05) de los valores de WT o CTL. Figura 1. La invasión de EA. Hy926 las células endoteliales de S. aureus (A) o L. lactis (B).