Invasie van menselijke cellen door een bacteriële pathogenen

Het volgende protocol beschrijft de studie van de endotheelcellen invasie van S. aureus, maar kan theoretisch worden gebruikt om cellulaire invasie studie door een kweekbare bacterie. Stages die specifiek zijn voor S. aureus en endotheelcellen worden aangegeven. 1. Voorbereiding van de bacteriën Cultuur S. aureus stammen voor 4-16 uur (afhankelijk van de gewenste groei-fase) in 10 ml Brain Heart Infusion-(BHI) bouillon bij 37 ° C in lucht met schudden bij 200 rpm. Deze groei voorwaarden zijn specifiek voor S. aureus en moet mogelijk worden aangepast voor andere bacteriën. Was bacteriën drie keer in Dulbecco's Modified Eagle's (DMEM, Invitrogen) door plaatsvervangers rondes van centrifugatie bij kamertemperatuur (5000 x g, 10 min), het verwijderen van de cultuur supernatant en resuspensie van de bacteriële pellet in een equivalent volume van DMEM. Meet de optische dichtheid van de resulterende suspensie van bacteriën, die vervolgens kunnen worden aangepast als nodig is. Voor S. aureus, bereiden we een schorsing bij OD 600 = 1, wat overeenkomt met ~ 10 9 kve ml -1. 2. Endotheelcellen Cultuur Cultuur van de endotheelcellen lijn EA.hy926 een in DMEM aangevuld met foetaal bovine serum (FBS, 10%) en L-glutamine (2 mm) bij 37 ° C in 5% CO 2. Als alternatief kan gepoolde primaire humane navelstreng endotheel cellen (HUVEC) te koop bij Lonza (Basel, Zwitserland) en gekweekt in endotheliale basaal medium aangevuld met 2% FBS, runderen hersenen extract (inclusief heparine), humane endotheliale groeifactor en hydrocortison op 37 ° C in 5% CO 2 volgens de instructies van de fabrikant (Lonza). Deze groei voorwaarden zijn specifiek voor deze cellen en moet mogelijk worden aangepast voor andere gastheercel types. Groeien endotheelcellen in T75 flesjes te vullen confluentie, geverifieerd door het oog. De voorbereiding van de 24-well platen voor het inbrengen van de dekglaasjes. Fijn pincet (vlam gesteriliseerd) zijn nodig om de dekglaasjes, die een ondoorzichtig en een glanzend oppervlak hebben bewegen. Plaats dekglaasjes in de putjes van de 24-well plaat met de ondoorzichtige oppervlak naar boven om celhechting mogelijk te maken. Bevrijd cellen van de T75 kolf met 3 ml trypsine-EDTA (0,25%) en toevoegen aan 10 ml van de desbetreffende kweekmedium. Voeg 500 ul van de geresuspendeerde cellen om 24-well platen die Thermanox glas dekglaasjes. Een T75 confluente fles van cellen voldoende cellen voor twee 24-wells platen, wat resulteert in ongeveer 5 x 10 5 cellen per well (in 500 ul medium). Incubeer de platen gedurende 48 uur zoals hierboven beschreven, en controleer of cellen van 100% confluentie door omgekeerd lichtmicroscopie. Dip-wash dekglaasjes in PBS en toe te voegen aan nieuwe 24-well platen met 490 ul DMEM met 10% FBS in elk putje. Om te onderzoeken de rol van specifieke metabole processen in de cel invasie, kan remmers worden toegevoegd aan de gekweekte cellen een uur voorafgaand aan de toevoeging van bacteriën en concentraties gehandhaafd tijdens de test. Bijvoorbeeld, om de rol van actine herschikking in S. bepalen aureus invasie van endotheelcellen, kan 50 uM cytochalasine D worden toegevoegd, of voor de rol van caveolae, 5 mM methyl-β-cyclodextrine kan worden toegevoegd. 3. Invasie Assay Voeg 10 ul van gewassen bacteriën (resulterend in ongeveer 2 × 10 7 cfu ml-1 S. aureus) aan elk putje met een dekglaasje aan gewassen met een confluente laag van endotheelcellen in 490 ul DMEM met 10% FBS. Incubeer gedurende 15-90 minuten bij 37 ° C in 5% CO 2. Voor het meten van het totale aantal bacteriën geassocieerd met de cellen (hechtende en geïnternaliseerd), dip-wash de dekglaasjes drie keer in PBS en toe te voegen aan verse putjes die 500 ul 0,5% Triton X-100 in PBS. Om ervoor te zorgen de cellen volledig te lyseren en laat al de geïnternaliseerde bacteriën, pipet het meerdere malen, wijzend de punt van de pipet rechtstreeks op het oppervlak van het dekglaasje. Inventariseer de bacteriën door de beplating vloeibare suspensie (of verdunningen van deze waar nodig) op het oppervlak van TSA platen. Aangezien de TX-100 zal lyseren van een groot aantal Gram-negatieve bacteriën, kan saponine in plaats daarvan 2 worden gebruikt. Voor het meten van het aantal geïnternaliseerde bacteriën, verwijder de kweeksupernatant van elk putje met ongebonden bacteriën en te vervangen door 500 ul DMEM/10% FBS, aangevuld met 200 ug ml-1 gentamicine. We routinematig gebruik van gentamicine in plaats van lysostaphin hier zoals het is goedkoper en laat ons toe om tussen de experimenten met verschillende soorten bacteriën (zoals stafylokokken en Lactococci) switch zonder de experimentele protocol te wijzigen. Incubeer de platen bij 37 ° C in 5% CO 2 gedurende 60 minuten aan alle extracellulaire bacteriën te doden. Was coverslips drie keer in PBS,lyseren en sommen door uitplating op TSA zoals beschreven voor de hechting assay hierboven. In sommige gevallen kan het de voorkeur om visueel tellen het aantal bacteriën met behulp van licht microscopie. In dit geval, en specifiek voor S. aureus cel invasie, gebruik lysostaphin (10 ug ml-1) in plaats van gentamicine om fysiek te vernietigen de extracellulaire bacteriën. Incubeer coverslips voor 20min bij 37 ° C in CO 2 in de lysostaphin oplossing, daarna afspoelen en bevestig met Cytopath (Cellpath). Flood de dekglaasjes met crystal violet (0,5%, w / v) voor 5min. Dip-spoelen in water, lucht drogen en monteren op glas dia's. Het aantal bacteriën per mm 2 die confluente endotheelcellen kunnen worden gekwantificeerd met behulp van lichtmicroscopie. 4. Representatieve resultaten: Expressie van fibronectine-bindende eiwitten (FnBPA en FnBPB) op het oppervlak van S. aureus geeft de mogelijkheid om endotheelcellen binnen te vallen. Recent werk heeft opnieuw de fibronectine-bindende domein van FnBPA 3. Wild-type (WT) S. aureus 8325,4 binnendringt endotheliale cellen met een hoog rendement, terwijl een stam ontbreekt zowel FnBPA en B (Δ FNB) toonde significant verminderd niveau van internalisering (Figuur 1A). Complementeren van de mutant met een plasmide coderend voor FNB A minus de fibronectine-bindend domein (pFnR0) niet bevorderen invasie (Figuur 1A). Daarentegen aanvulling van de mutant met een plasmide dat codeert voor het gehele FNB A gen (pFnBA4) gerestaureerd invasie aan WT niveaus (figuur 1A). De rol van de FnBPA in endotheelcellen invasie kan ook worden aangetoond met behulp van de heterologe expressie gastheer Lactococcus lactis. Expressie van plasmide-gecodeerd zijn FnBPA in L. lactis (pRM9 9) had geen significante verbetering van hechting op de endotheliale cellen in vergelijking met bacteriën hadden geen FnBPA (CTL) (open bars, figuur 1B). In tegenstelling FnBPA expressie L. lactis endotheelcellen binnengevallen op een beduidend hoger niveau dan de niet-expressie stam (gesloten bars, figuur 1B). Experimenten werden uitgevoerd vier keer in duplo en de gemiddelde ± standaarddeviatie wordt gepresenteerd. * Vertegenwoordigen gegevens die statistisch significant verschillend (p = <0,05) van WT of CTL waarden. Figuur 1. Invasie van EA. Hy926 endotheliale cellen door S. aureus (A) of L. lactis (B).