このプロトコルは、樹脂の埋め込み脳組織を走査型電子顕微鏡、集束イオンビームの3次元で準備し、画像化する方法について説明します。
このプロトコルは、どのように生物学的サンプルは、脳組織のように、集束イオンビーム/走査型電子顕微鏡(FIB / SEM)を用いて3次元でイメージングすることができますについて説明します。サンプルは、四酸化オスミウムと酢酸ウラニルを用いてアルデヒド類、重金属で染色して固定されています。そして、彼らはアルコールで脱水し、硬化される樹脂、で浸潤。光学顕微鏡とガラスナイフを持つウルトラミクロトームを用いて、表面に近い領域の関心を含む小さなブロックが行われます。ブロックが次にFIB / SEM、およびブロックの片側に沿ってほぼ工場の垂直面をするために使用されるイオンビーム内に配置され、この地域に近い。画像基本的な構造をして後方散乱電子を用いて、小さな顔は、細かいイオンビームで粉砕し、表面には、イメージングと粉砕される顔の正確な領域を決定するために、より密接に吟味されている。顕微鏡のパラメータは、シリアル画像がブロックのボリュームを介して収集されるように顔が繰り返し粉砕し、結像されるように設定されています。画像のスタックは通常、各方向に小さな4 nm程度の寸法と等方性ボクセルが含まれます。任意の撮像面でこの画質は、ユーザーが画像スタック内の任意の視野角でセルの超微細構造を分析することができます。
関心領域が大きすぎるではない場合FIB / SEMの手法は、最適に動作します。画像化されたボリュームの上限は、イオンビームとそれが多くの時間以上繰り返し圧延一貫してできる領域に依存する。今のところ、これが約60 × 60ミクロンの領域で行われている、しかし、画像はこの領域全体では、適切な画像解像度と大きな画像を収集する時間的要因が主な要因は不可能である。ピクセルと例4 KX 4 Kのイメージとして10マイクロ秒までの滞留時間を取得するには、2分40秒かかります、と60ミクロンの視野のために、これはわずか15ナノメートルのピクセルサイズを与えるだろう。イメージング、細胞と組織の超微細構造の場合は、小さい画素サイズがより適している;通常4〜10nmの/ピクセル間。 60 × 60ミクロンの領域のために画像は顕微鏡がこの能力を持っている場合でも、10時間で取得される。これらの理由から、顕微鏡で10 × 10 × 10ミクロン、または全細胞の有意な地域のために画像のボリュームに最適なツールです。これは簡単に、この手順でうまく対比されているサンプルに48時間の期間内に行うことができます。
これまでのプロトコルは、脳組織だけでなく、カバーガラスに付着している哺乳動物培養細胞の様々なタイプで主に使用されています。しかし、固定と染色の手順は同様に、コントラストの画像スタックを生成するために植物材料を含む生物学的材料の他の多くの種類、使用することができます。
したがって、この手法の主な利点は、等方性ボクセルによる画像のボリュームにその容量です。このタイプの画像のスタックは、スタック内の任意の平面で撮影した画像を使って3Dボリュームの分析が可能になります。これの利点は、あらゆる方向からの画像シリーズで、より大きなイメージの詳細(図3)を提供する画像の特徴にオブザーバをできるようにすることです。
The authors have nothing to disclose.
Name of Reagent | Company | Catalogue number |
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Cyanoacrylate glue | ||
Dissecting microscope: Leica MZ8 | Leica Microsystems, Germany | |
Durcupan resin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland | |
FIB/SEM microscope (Zeiss, NVision 40) | ||
Glass histology slides | Menzel-Gläser, Germany | AA00008032E |
Glass knife maker: Leica EM KMR2 | Leica Microsystems, Germany | |
Glass scintillation vials (20ml) | EMS, USA | 72634 |
Glutaraldehyde | EMS, USA | 16222 |
Jeweler’s saw | EMS, USA | 72010 |
Mould separating agent | Glorex, Switzerland | 62407445 |
Osmium tetroxide | EMS, USA | 19110 |
Paraformaldehyde | EMS, USA | RT 19208 |
Phosphate salts for phosphate buffer | Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland | 71642 and 71496 |
Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland | 20840 |
Sputter Coater with gold target | Cressington, USA | |
Tris base (TBS) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Switzerland | T1378 |
Ultramicrotome: Leica UCT | Leica Microsystems, Germany | |
Uranyl acetate | EMS, USA | RT 22451 |