1. לדוגמה קיבוע והטבעה שרף דוגמאות של רקמות ותאים טרי קבועים לפחות 2 שעות paraformaldehyde 2% ו -2.5% glutaraldehyde במאגר M 0.1 פוספט ב-pH של 7.4. גודל המדגם לא יעלה על 0.150 מ"מ עובי על מנת לאפשר חדירה מקבע נאותה או, ולא צריך להשאיר לתקן את יותר מ 12 שעות. מניחים את דגימות צלוחיות זכוכית scintillation 20ml ולשטוף אותם שלוש פעמים, 5 דקות כל אחד, במאגר cacodylate 0.1M. הכתם עם 1.5% (w / v) אוסמיום אשלגן tetroxide פרוציאני ו 1% (w / v) במאגר cacodylate 0.1 M (0.1 מ ', pH 7.4) במשך 30 דקות. הכתם עם tetroxide אוסמיום 1.0% (w / v) במאגר cacodylate 0.1M 30 דקות. יש לשטוף מיד עם מים מזוקקים כפול 3 דקות. הכתם עם 1% (w / v) אצטט uranyl במים מזוקקים כפול במשך 30 דקות. יש לשטוף את החלקים במשך 5 דקות במים מזוקקים כפול, ולאחר מכן מייבשים בסדרה אלכוהול ציון, 2 דקות כל שינוי (1 x 50%, 1 x 70%, 1% 90 x, 1% 95 x, 2 x 100%). הטמע בריכוזים הגוברת של שרף Durcupan מעורבב עם אתנול, 30 דקות כל שינוי, החל Durcupan 50% אתנול, לאחר מכן על ידי: 70%, 90%, 95%, ולאחר מכן 100%. החלף Durcupan טריים להתסיס לאט במשך 4 שעות. סעיפים מקום, באמצעות מקלות עץ קוקטייל, על מיקרוסקופים שקופיות הזכוכית מצופה סוכן עובש הפרדה, ומכניסים לתנור 65 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. 2. הכנת המדגם עבור FIB / SEM הפרד את שכבת שרף, המכיל את הדגימות, החל בין שתי שקופיות מיקרוסקופ זכוכית ולשטוף ביסודיות כדי להסיר עובש הפרדת סוכן. באמצעות מיקרוסקופ האור המועבר עם מטרות צריכת חשמל נמוכה, או לנתח מיקרוסקופ עם תאורה לשדר, כדי לזהות את האזור של עניין בתוך פרוסה של שרף. גזור קטן (3 מ"מ x 3 מ"מ) מרובע סביב האזור של עניין באמצעות סכין גילוח מקל זו לראש לחסום שרף ריק עם דבק אקרילי (איור 1). המתן 5 דקות הדבק להתקשות ולאחר מכן להמשיך לשלב הבא. הצמד את הבלוק לתוך בעל ulramicrotome ו, באמצעות stereomicroscope המצורפת, מטופח סביב האזור של עניין עם סכין גילוח עד פירמידה קטנה בלבד של חומר נשאר. יתר על כן לקצץ את הבלוק, בעזרת סכין זכוכית קבוע לתוך ultramicrotome, כך האזור של עניין יכול להיות ממוקם בדיוק ביחס ממדים של פני השטח של בלוק (איור 1). חותכים קצה אחד של הרחוב, קרוב לאזור של עניין, כך צעד בניצב היא לחתוך המדגם (איור 1 ו – 2). צעד זה מהווה את הפנים הדמיה (איור 2). הסר את הבלוק מן ultramicrotome ולצלם את האזור של עניין בתוך הבלוק, באמצעות מיקרוסקופ האור המועבר. חותכים את גוש גזוז הרחק בדל שרף הנותרים. הדבר נעשה באמצעות ראתה של צורף ומבטיח כי רק גוש קטן ממוקם בתוך FIB / SEM. הגובה הכולל של גוש זה לא צריך להיות יותר מ 5 מ"מ. דבק לחסום את בדל אלומיניום עם הדבק פחמן להבטיח שהצד להיות צילמו נמצא בקצה החיצוני (איור 1). לאחר הדבק התייבש, המעיל לחסום בשכבה דקה של זהב (> 20 ננומטר, אידוי Cressington שואב אבק). 3. הדמיה של FIB / SEM בהגדלה נמוכה, ושימוש משני אלקטרונים הדמיה (5 kV, 0.5 nAmp), המזרח לחסום כך את האזור שנבחר עניין הצד של הבלוק להיות צילמו עומדת בפני המפעיל (איור 2 ג, ד). המזרח לחסום כך את פני להיות צילמו שקרים במקביל הקורה כרסום. זאת אומרת כי אלומת אלקטרונים מכוונת על 54 ° להתמודד עם זה (2 ב איור). באמצעות אלומת יונים הנוכחי של 13-27 nAmps ב kV 30 להסיר רצועה צרה של שרף מהחזית האזור להיות צילמו. מעבר למצב הדמיה backscattered להציג את הפנים הסתובבו כי overlies האזור של עניין. שימוש במיקרוסקופ אור התייחסות תמונה (נלקחה ב שלב 16) ואת התמונה של הפנים הסתובבו לאתר את האזור המדויק ברחוב להיות הסתובבו וצילמו (איור 2). הפקדה שכבת מגן (כ 1 מיקרון עבה) של פחמן (או מתכת), באמצעות מערכת הזרקת דלק של המיקרוסקופ, על פני השטח של הבלוק, מעל האזור של עניין (איור 2). השימוש הנוכחי של 700 picoAmps, טחנה עד דק את האזור של גוש שבתוכו תמונות הסופי יילקחו. השאר את קרן כרסום לטחנת לחלוטין את הפנים בתמונה עד אין ממצאים כרסום ניתן לראות על הפנים. מפעל שלם של הפנים נבדק על ידי התבוננות שינויים כל תמונה שלאחר מכן על פני השדה כולו מבט. כרסום לקוי ניתן לראות גם פסים לבנים או "וילונות" המופיע vertically בתמונה. השאירו את המיקרוסקופ במשך 2 שעות לפחות עבור כל שינוי תרמית להתפוגג. פעולה זו מפחיתה את הסיכון כי הפנים לחסום ייסחף במהלך הדמיה, וכתוצאה מכך תמונות misaligned. בחר את הפרמטרים מיקרוסקופ הדמיה פני סדרתי. ודא כי אלומת אלקטרונים יש מתח כי היא נמוכה מספיק כדי תמונה רק בעומק רדוד מאוד של חומר מול לחסום. זה צריך להיות גם הרבה יותר רדוד יותר בעובי של הפנים כדי להסירו. פרמטרים אופייניים הדמיה הם מתח של בין 1.2-2.0 kV עם גודל פיקסל של בין 4-20 ננומטר. פיקסל לשכון זקוק לזמן כדי להיות כל הזמן סביב 10 μsecs כך את סך כל הזמן אל טחנת הקמח פנים לרכוש תמונה אחת נשמרת מתחת ל -2 דקות (איור 3). 4. סודות להצלחה שלב 1) ודא דוגמאות אינן יותר עבה 150 מיקרון. זה יאפשר חדירה נאותה של כתמים שונים שרף לתוך החומר. זו יכולה להיות מושגת על ידי חתך את דגימות עם vibratome מיד לאחר קיבעון. עובי זה מתאים ברקמת המוח. רקמות אחרות צריכים להיבדק על מנת להבטיח קיבוע מכתים נאותים. שלב 3) דגימות חייב להיות מופץ בחופשיות ברחבי פתרון, ולא בכבדות יחד בחלק אחד של הבקבוקון בעוד זה מקבע המשני הוא הציג. פעולה זו תבטיח חדירה מקסימלית של המדגם ולהפחית את המדגם נעשה מעוות במהלך תהליך זה קיבעון. זו מושגת על ידי בעדינות מתערבל דגימות בתוך הבקבוקון מיד אחרי הפתרון הוא הוסיף. שלב 15) ודא כי האזור של עניין נמצא מיד מתחת (<30 מיקרון) את פני השטח של הבלוק. זה יקטין את כמות הטחינה על ידי יון הקורה בשלב רכישת התמונה. שלב 22) בפעם סריקה של יון הקורה צריך להיות adequte כדי להבטיח את פני הדמיה כולו מחורץ לגמרי. כרסום לקוי יוצגו כמו פסים לבנים, או "וילונות" המופיע אנכית כלפי מטה מול הדמיה. שלב 26) הפנים הסתובבו הסופי חייב להיות גדול יותר מאשר הפנים כי הוא הדמיה. הסיבה לכך היא שרף הסתובבו הוא נפלט מן הבלוק redeposits על פני השטח לחסום בסביבה הקרובה. Redeposition זה יכול לפלוש למגרש הדמיה של נוף, והוא להימנע על ידי כרסום שטח גדול הרבה יותר מאשר היא הדמיה. עבור חלון הדמיה כי הוא 20 מיקרון רחב, הפנים לחסום הסתובבו גדול מ 30 מיקרון רחב. שלב 29) זה קריטי, כי הפרמטרים אלומת אלקטרונים הן כאלה התמונה נוצרת על ידי אלקטרונים העולות רק את ננומטר הראשונים של פני השטח של בלוק. זה acheved ידי מזעור מתח kV להלן 2 ולהבטיח כי האלקטרונים לא לחדור עמוק מדי. זה עזר גם באמצעות מתח רשת על הגלאי כך שרק אלקטרונים עם האנרגיות הגבוהות ביותר לתרום התמונה הסופית. בדרך כלל, מתח רשת של kV 1.3 משמש מתח הדמיה של 1.5 kV. 5. נציג תוצאות: באיור 1. הכנת לחסום שרף. שרף) מוטבע סעיף העטרה (80 מיקרון עבה) דרך המוח עכברוש מבוגר שנצפו ב steromicroscope. התמונה מראה בבירור את אזורי מוח שונים שניתן לחתוך מהחלק (ב) באמצעות להב סכין המנתחים. כאן, בכיכר 1 מ"מ מהקורטקס מוסר (ג) תקוע לחסום שרף ריק. ד) לחסום שרף חיתוך אז עם סכין זכוכית רכוב ultramicrotome, וברגע לחסום צומצמה רק להשאיר את האזור של עניין (ה), צעד הוא חתך בניצב לפני השטח הקדמי של החומר מוטבע. ו) זה האזור מטופח כולו ואז לחתוך מיתר שרף ועלה על בדל אלומיניום מוכן ציפוי מתכת הדמיה ב סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים. איור 2. הכנת הפנים לחסום עבור FIB / SEM הדמיה. א) ו ב) להראות איורים של הגוש ואת קצה מחורץ כדי ליצור את הפנים הדמיה (מסומן עם החץ בעל שני ראשים שחורים). העמדה של אלומת יונים (לבן) מוצג במקביל מול הדמיה, לבין אלומת אלקטרונים (אפור) מוצג להכות את הפנים על 54 ° עד יון הקורה. ג) מראה תצוגה של גוש שצולמו עם אלומת אלקטרונים הדמיה עם אלקטרונים משניים. יחד בצד הזה של לחסום את אזור כהה יותר (מסומן עם תיבת לבן מנוקד) מראה חלק של הפנים כי כבר הסתובבו בערך (מוצג פעמיים עם ראשעורך חץ שחור) כדי לחשוף את מדגם הבסיס. ד) כאשר אזור זה הוא צילמו רק באמצעות האלקטרונים backscattered רקמת מוטבע ניתן לראות. כאן, רוחב המלא של הסעיף רקמות מוטבע מסומן בחץ כפול לבן בראשותו. בר סולם ב ג) הוא 100 מיקרון. איור 3. הדמיה נפח של רקמת המוח עם voxels איזוטרופיים.) הפוך לעומת backscattered תמונה של הפנים לחסום מראה את ultrastructure בתוך אזור במוח חולדה. ממברנות כל נראים כמו גם מבנים macromolecular גדול. ב) סך של 1600 תמונות שנאספו על המרווח 5 ננומטר וכתוצאה מכך מחסנית תמונה עם voxels איזוטרופיים. ג) מערך זה ניתן הדמיה במישור כלשהו עם רזולוציה זהה. תמונה זו מראה קשר סינפטי יחיד הדמיה במישור xy לבין מטוס YZ.