Purificación y caracterización biofísica de la miosina-7a humana basada en el sistema MultiBac

Las miosinas son proteínas motoras moleculares que interactúan con la actina para impulsar numerosos procesos celulares 1,2,3,4. Los seres humanos poseen 12 clases y 39 genes de miosina⁵, que están involucrados en una amplia gama de funciones fisiológicas, como la contracción muscular⁶ y los procesos sensoriales⁷. Cada molécula de miosina es un complejo multimérico compuesto por una cadena pesada y cadenas ligeras. La cadena pesada se divide en regiones de cabeza, cuello y cola. La cabeza contiene sitios de unión a actina y nucleótidos que son responsables de la hidrólisis del ATP y de la generación de fuerza sobre los filamentos de actina². El mástil está formado por varios motivos IQ α-helicoidales donde se unen un conjunto específico de cadenas ligeras. Juntos funcionan como un brazo de palanca para amplificar los cambios conformacionales del motor en grandes movimientos ^8,9,10. La cola contiene subdominios específicos de cada clase y desempeña un papel regulador en el ajuste de la actividad motora de la miosina y en la mediación de las interacciones con los socios de unión celular ^2,11.

La miosina-7a humana, miembro de las miosinas de clase 7, es esencial para los procesos auditivos y visuales^12,13. Los motivos de CI de la miosina-7a humana se asocian con una combinación única de cadenas ligeras, que incluyen la cadena ligera reguladora (RLC), la calmodulina y la proteína similar a la calmodulina 4 (CALML4)14,15,16. Además de estabilizar el brazo de palanca, estas cadenas ligeras regulan las propiedades mecánicas de la miosina-7a en respuesta a la señalización del calcio, una característica que parece ser exclusiva de la isoforma¹⁴ de los mamíferos.

Los defectos en el gen que codifica la cadena pesada de miosina-7a (MYO7A/USH1B) son responsables del síndrome de Usher tipo 1, la forma más grave de pérdida combinada de visión y audición en humanos¹⁷. Además, el gen de cadena ligera CALML4 se encuentra entre los genes candidatos mapeados para contener el alelo causante de USH1H, otra variante del síndrome de Usher tipo 1^15,18. En la retina, la miosina-7a se expresa en el epitelio pigmentario de la retina y en las células fotorreceptoras¹³. Se ha implicado en la localización de melanosomas en el epitelio pigmentario de la retina (EPR)¹⁹ y en la fagocitosis de los discos del segmento externo de los fotorreceptores por parte de las células^EPRP20. En el oído interno, la miosina-7a se encuentra principalmente en los estereocilios, donde desempeña un papel fundamental en la formación de mechones pilosos y en la activación del proceso de transducción mecanoeléctrica 12,21,22.

Si bien la importancia de la miosina-7a en las células sensoriales está bien establecida, sus mecanismos funcionales a nivel molecular siguen siendo poco conocidos. Esta brecha en el conocimiento se debe en parte a los desafíos para purificar la proteína intacta, especialmente la isoforma de mamíferos. Recientemente, se han realizado avances significativos utilizando el sistema MultiBac para expresar de forma recombinante la holoenzima¹⁴ de miosina-7a humana completa. Este avance ha permitido caracterizaciones estructurales y biofísicas de esta proteína motora, lo que ha llevado al descubrimiento de varias propiedades únicas de la miosina-7a humana que están específicamente adaptadas para las funciones auditivas de los mamíferos^14,23.

El sistema MultiBac es una plataforma avanzada de células de baculovirus/insectos diseñada específicamente para la expresión de complejos multiméricos eucariotas^24,25. Una característica clave de este sistema es su capacidad para albergar múltiples casetes de expresión génica, cada uno de los cuales codifica una subunidad del complejo, dentro de un único baculovirus MultiBac. El ensamblaje de los casetes de expresión multigénica se facilita a través de un módulo de multiplicación: un sitio de endonucleasa (HE) y un sitio BstXI de diseño coincidente que flanquea los sitios de clonación múltiple (MCS). Este módulo permite el ensamblaje iterativo de un casete de expresión única por restricción/ligadura, aprovechando el hecho de que los sitios de restricción HE y BstXI se eliminan tras su ligadura. En este artículo, la cadena pesada de miosina-7a humana, RLC, calmodulina y CALML4 se clonan en el módulo de multiplicación dentro del vector pACEBac1 (Figura 1A), que luego se ensamblan en un casete de expresión multigénica a través del proceso iterativo (Figura 1B). El casete multigénico de miosina-7a se integra en el genoma baculoviral (bacmid) a través de la transposición del elemento mini-Tn7 del vector pACEBac1 al sitio diana mini-attTn7 en el genoma (Figura 1C). Siguiendo los procedimientos para la purificación de bacmid, la producción y amplificación de baculovirus (Figura 1D, E), se prepara el baculovirus MultiBac de miosina-7a recombinante y se puede utilizar para la producción de proteínas a gran escala (Figura 1F). Además, las cadenas ligeras de miosina-7a pueden producirse por separado en E. coli y purificarse utilizando una etiqueta His6-SUMO escindible 26,27,28. Las cadenas ligeras purificadas son útiles para estudiar su dinámica de unión y regulación de la miosina-7a.

La proteína miosina-7a purificada puede someterse a estudios estructurales, bioquímicos y biofísicos para obtener información sobre la regulación estructural-funcional de esta proteína motora. Además, sus interacciones con la red de actina y otras proteínas de unión²⁹ pueden examinarse utilizando una variedad de enfoques de reconstitución in vitro. Los hallazgos de estos análisis informarán sobre las propiedades biofísicas de esta miosina, lo que conducirá a una comprensión mecanicista de cómo la miosina-7a impulsa los cambios en el citoesqueleto y, en última instancia, da forma a la morfología y función únicas de las células sensoriales. En este artículo, detallamos un flujo de trabajo para el ensayo de deslizamiento de filamento de actina que se ha adaptado específicamente para la miosina-7a de mamíferos. El ensayo de deslizamiento de filamentos de actina es un robusto ensayo de motilidad in vitro que estudia cuantitativamente el movimiento de filamentos de actina fluorescentes propulsados por un gran número de motores de miosina inmovilizados en una superficie de cubreobjetos 30,31,32. Las ventajas de este ensayo incluyen su simplicidad de configuración, requisitos mínimos de equipo (un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con una cámara digital) y alta reproducibilidad. Además, debido a que el movimiento de los filamentos de actina es impulsado por un grupo de motores de miosina inmovilizados, este ensayo es particularmente útil para estudiar la motilidad de miosinas monoméricas como la miosina-7a^14,33. Los protocolos incluyen varias modificaciones, desde procedimientos experimentales hasta análisis de imágenes, específicamente adaptados a las propiedades móviles únicas de la miosina-7a de los mamíferos. Con la disponibilidad de la proteína miosina-7a intacta y el protocolo de caracterización funcional descrito aquí, este artículo sienta las bases para una mayor investigación sobre las funciones moleculares de la miosina-7a en procesos fisiológicos y patológicos.