Purificación y caracterización biofísica de miosina-7a humana basada en el sistema MultiBac

NOTA: Aquí describimos un protocolo para sintetizar la holoenzima miosina-7a humana intacta y caracterizar su motilidad in vitro. Este protocolo se divide en tres secciones: en primer lugar, la expresión de la miosina-7a humana mediante el sistema de expresión de proteínas del baculovirus MultiBac; En segundo lugar, purificar las cadenas ligeras de miosina-7a por separado utilizando el sistema E.coli His6-SUMO; y, por último, el estudio de la motilidad de la miosina-7a humana mediante el ensayo de deslizamiento de actina-filamento. 1. Producción del complejo miosina-7a basado en el sistema MultiBac Creación de un casete multigénico de baculovirus para la expresión del complejo miosina-7a humano (16 días)NOTA: Se requiere un ciclo de clonación (4 días) para insertar los ADNc de las subunidades de miosina-7a en los vectores pACEBac1 y tres ciclos de clonación para completar la ligadura escalonada de todos los módulos de multiplicación necesarios para expresar el complejo miosina-7a, lo que da como resultado un total de 16 días.Clone los ADNc que codifican la cadena pesada de miosina-7a (HC), calmodulina, CALML4 y RLC en los vectores pACEBac1 utilizando un kit comercial siguiendo los protocolos del fabricante (consulte la Tabla de materiales; Figura 1A). Se inserta una etiqueta FLAG en el extremo C de la miosina-7a HC para ayudar en la purificación.NOTA: La miosina-7a de los mamíferos se produce como dos isoformas de empalme, que difieren solo en un segmento de 11 aminoácidos en el extremoN-terminal 23. Esta corta extensión N-terminal desempeña un papel fundamental en la regulación de la actividad ATPasa de la miosina-7a14. Se ha demostrado que la adición de una etiqueta N-terminal puede interrumpir la regulación normal por esta extensión N-terminal y reducir significativamente la actividad enzimática y la motilidad del motor14. Por lo tanto, se emplea una etiqueta FLAG C-terminal para evitar interrumpir la regulación natural de la proteína. Construya el casete de expresión multigénica para la holoenzima miosina-7a utilizando la multiplicación de endonucleasa homing/BstXI como se describe a continuación (Figura 1B).NOTA: La endonucleasa homing I-CeuI produce extremos cohesivos que son compatibles con los extremos generados por la digestión BstXI. Tras la ligadura, se crea un sitio de restricción híbrido endonucleasa/BstXI que no puede ser cortado por ninguna de las enzimas. El mismo procedimiento se puede repetir para integrar más módulos de multiplicación. Si hay varios sitios de restricción para I-CeuI y BstXI en las construcciones de inserción o vector, estos sitios adicionales deben eliminarse mediante mutagénesis dirigida al sitio para garantizar que los sitios de corte I-CeuI y BstXI sean únicos. Preparación del inserto: Digiera la construcción del inserto (p. ej., pACEBac-M7a HC) con la endonucleasa homing I-CeuI (consulte la tabla de materiales) y, a continuación, purifique el plásmido linealizado mediante un kit de purificación de PCR (consulte la tabla de materiales). Además, digiera el plásmido linealizado con BstXI (consulte la tabla de materiales), separe el fragmento que contiene el casete de expresión génica mediante electroforesis en gel y purifique con un kit de extracción en gel (consulte la tabla de materiales).NOTA: I-CeuI y BstXI requieren diferentes condiciones de búfer, de acuerdo con los protocolos del fabricante, para lograr el 100% de actividad. Además, un corte completo con I-CeuI requiere un mínimo de 3 h, mientras que BstXI requiere solo 15 min de tiempo de incubación. Por lo tanto, las digestiones deben realizarse secuencialmente. Preparación del vector: Linealizar la construcción del vector (por ejemplo, pACEBac-CaM) a través de la digestión BstXI. La fosfatasa alcalina se incluye en la preparación del vector para evitar que el plásmido vectorial se una a sí mismo (ver Tabla de Materiales). Obtener el producto de digestión por electroforesis y purificarlo con un Kit de Extracción en Gel. Ligadura: Ligar el inserto tratado con I-CeuI/BstXI y el vector tratado con BstXI con ADN ligasa T4 (ver Tabla de Materiales). Realizar reacciones de ligadura a temperatura ambiente (20 °C -25 °C) durante 10 min con una proporción de 1:1 en masa del ADN del inserto al ADN vectorial, manteniendo la masa total cercana a 100 ng en cada reacción de ligadura. Transformación y análisis de plásmidos: Transformar las mezclas de ligadura en células DH5α (ver Tabla de Materiales) siguiendo las recomendaciones del fabricante y examinar las colonias positivas para detectar resistencia a la gentamicina. Purifique los plásmidos utilizando un kit comercial (consulte la Tabla de materiales) y verifique los clones correctos (por ejemplo, plásmidos que contienen M7a HC y CaM) en función de los patrones de digestión de restricción específicos y la secuenciación del ADN de los insertos. Integración de múltiples casetes de expresión génica: Repita los pasos 1.1.2 a 1.1.6 para integrar casetes de genes adicionales que expresan otras subunidades de miosina-7a. Producción y purificación de ADN bacmid recombinante (4 días; Figura 1C).NOTA: Día 1 – Transformación bacteriana y crecimiento de colonias transformadas. Días 2-3 – Crecimiento de colonias y selección para una transformación exitosa. Día 3 – Selección y rayado de colonias positivas, comenzando la inoculación durante la noche. Día 4 – Purificación del ADN de bacmid.Transforme las células competentes DH10Bac (ver Tabla de Materiales) con 1 ng del plásmido pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM secuenciado siguiendo las recomendaciones del fabricante. Colocar 20-200 μL de las células en una placa de agar que contenga 50 μg/mL de kanamicina, 7 μg/mL de gentamicina, 10 μg/mL de tetraciclina, 100 μg/mL de indolil-β-galactósido halogenado y 40 μg/mL de IPTG (ver Tabla de Materiales) e incubar la placa a 37 °C durante 48 h para permitir el desarrollo de un color azul intenso en clones negativos.NOTA: El indolil-β-galactósido halogenado tiñe las colonias que continúan expresando LacZ (lo que indica que la transposición no tuvo éxito), lo que permite la selección de colonias blancas donde la transposición fue exitosa. Seleccione cuidadosamente una colonia blanca aislada y cultive células durante la noche en 5 mL de medio LB que contenga 50 μg/mL de kanamicina, 7 μg/mL de gentamicina y 10 μg/mL de tetraciclina a 37 °C en un agitador orbital a 225 rpm. Centrifugar el cultivo a 2.465 x g durante 10 min para granular la E. coli. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 300 μL de tampón P1 del kit.NOTA: Si bien aquí se utilizan tampones del kit Miniprep, el protocolo para purificar el producto bacmid varía del protocolo proporcionado con el kit. Añada 300 μL del tampón P2 del kit. Mezcle invirtiendo los tubos unas cuantas veces y luego incube a temperatura ambiente durante 3 minutos. Añadir 300 μL del tampón N3 del kit y mezclar por inversión para detener la reacción de lisis. Centrifugar a 17.885 x g durante 10 min a 4 °C. Transfiera el sobrenadante a un tubo estéril limpio y repita la centrifugación durante otros 10 minutos. Transfiera 800 μL del sobrenadante a otro tubo de microcentrífuga estéril de 1,7 mL (ver Tabla de Materiales) y agregue 600 μL de isopropanol frío (ver Tabla de Materiales), mezclando por inversión rigurosa. A continuación, centrifugar a 17.885 x g durante 20 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y localice la pequeña bolita blanca. Lavar el pellet con 800 μL de etanol frío al 70% (ver Tabla de Materiales) y centrifugar a 17.885 x g durante 5 min a 4 °C. Agregue etanol con cuidado a lo largo de la pared del tubo para evitar perturbar el pellet. Deseche el sobrenadante y repita el lavado con etanol una vez. Seque el pellet al aire libre a temperatura ambiente durante 5 min. Aspire con cuidado el exceso de líquido, si es necesario. Disuelva el pellet con 20 μL de tampón EB del kit. Asegúrese de que el pellet se disuelva por completo moviendo el tubo o mezclando suavemente mediante pipeteo. Determine la concentración utilizando un espectrofotómetro (ver Tabla de Materiales). Ajuste el volumen del tampón según sea necesario para obtener la concentración de bacmid en aproximadamente 1 μg/μL. Almacene el ADN de bacmid a 4 °C hasta que esté listo para la producción del virus P0.NOTA: El bacmid purificado puede mantenerse a 4 °C y sigue siendo eficaz durante varios meses. Hemos visto transfecciones exitosas con productos bacmid de hasta 1 año de edad. Alternativamente, el bacmid puede ser alícuota y almacenado a -20 °C. Deben evitarse los ciclos múltiples de congelación/descongelación, ya que disminuyen la eficiencia de la transfección. Transfectar células de insecto Sf9 con bacmid para producir baculovirus recombinante (6 días; Figura 1D)NOTA: Día 1 – Transfección de células con ADN de bacmid. Días 2-6 – Observar el crecimiento y la expresión de las células. Día 6 – Recolección del virus P0.Agregue células Sf9 en medios de cultivo (consulte la Tabla de materiales) a una placa de 6 pocillos a una concentración de 0,33 x 106 células/mL con 3 mL por pocillo. Deje reposar la placa a temperatura ambiente durante 30 minutos para permitir que las células se adhieran a la parte inferior de la placa. Para cada pocillo, prepare una mezcla de transfección combinando 10 μL de reactivo de transfección de lípidos catiónicos (ver Tabla de Materiales) con 250 μL de medio de Medio Mínimo Esencial (MEM) mejorado (ver Tabla de Materiales) en un tubo de microcentrífuga estéril. Mezclar por inversión e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Añadir 1 μg (sobre la base de la concentración determinada en el paso 1.2.12) de miosina-7a bacmid sin diluir a la mezcla de transfección. Mezclar por inversión e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Distribuya uniformemente toda la mezcla de ADN y lípidos gota a gota en los pocillos. Deje un pozo para las células no transfectadas como control negativo. Selle la placa de 6 pocillos con una película (consulte la Tabla de materiales) e incube a 27 °C durante 6 días. Observa el crecimiento y el desapego a lo largo de este tiempo. Si hay una etiqueta fluorescente presente en la construcción, verifique el desarrollo de fluorescencia (Figura 2). Cuando las células transfectadas muestren signos de infección en etapa tardía, transfiera el medio que contiene el virus de los pocillos infectados a un tubo cónico de 15 mL y centrifugue a 805 x g durante 10 min. Transfiera el sobrenadante a un tubo cónico limpio de 15 mL, envuélvalo en papel de aluminio y guárdelo a 4 °C. Según nuestra experiencia, este producto es ahora el virus P0 y puede almacenarse y usarse de manera efectiva hasta por cuatro meses. Amplificar el stock de baculovirus (3-5 días; Figura 1E)Prepare 100 mL (o el volumen deseado) de células Sf9 a una concentración de 2 x 106 células/mL en un medio de cultivo celular Sf9 en un matraz Erlenmeyer de 250 mL (ver Tabla de Materiales). Añadir una proporción 1:100 (v/v) de material del virus P0 al cultivo en suspensión de células Sf9 e incubar a 27 °C en un agitador orbital a 135 rpm. Controle el crecimiento cada 24 h hasta que las células alcancen ~90% de muerte celular. Una vez en este rango, centrifugar la suspensión celular a 500 x g durante 10 min y recoger el sobrenadante que contiene el virus P1. Filtre el sobrenadante mediante una filtración al vacío de 0,22 μm (consulte la tabla de materiales). Mantenga el producto filtrado en la oscuridad y guárdelo a 4 °C. Este producto es ahora el virus P1.NOTA: El título del virus disminuye con el almacenamiento a largo plazo a 4 °C. Considere la posibilidad de hacer caldo de virus fresco si se ha almacenado durante más de 4 meses, o valorar el caldo de virus antes de usarlo en la expresión34. Expresión de proteínas (60 -72 h entre el inicio de la expresión y la recolección de la célula pellet; Figura 1E)Prepare células Sf9 en crecimiento en fase logarítmica a una concentración de 2 x 106 células/mL y agregue el virus P1 en una proporción de 12 mL de virus por 300 mL de suspensión celular.NOTA: El rendimiento de proteína es de aproximadamente 1 mg/L. Se recomienda utilizar un mínimo de 1,5 L de suspensión celular para la expresión de esta proteína. Cultivar las células a 27 °C en un agitador orbital a 135 rpm durante aproximadamente 60 h.NOTA: Se pueden recolectar muestras pequeñas en diferentes puntos de tiempo y analizarlas utilizando geles SDS para evaluar los niveles de expresión de proteínas. Además, si las proteínas se fusionan con etiquetas fluorescentes, los niveles de expresión se pueden evaluar mediante microscopía de fluorescencia. Las células deben recolectarse a más tardar al inicio de la muerte celular. Centrifugar la suspensión celular a 3.735 x g durante 5 min a 4 °C para peletizar las celdas. Los pellets pueden almacenarse a -80 °C hasta su uso posterior o conservarse para su almacenamiento a largo plazo. Por lo general, usamos gránulos celulares en semanas, pero hemos recuperado la proteína activa varios meses después de la congelación. Purificación de proteínas (2 días; Figura 1F)NOTA: Día 1 – Extracción y purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad FLAG. Día 2 – Alícuota y congelación de muestras después de la diálisis nocturna. El protocolo que se describe a continuación es para purificar la miosina-7a a partir de gránulos de celdas de 1,5 L.Prepare el tampón maestro que contiene 10 mM de MOPS (pH 7,2), 500 mM de NaCl, 10 mM de MgCl2, 1 mM de EGTA, 1 μg/mL de leupeptina y 100 μg/mL de fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF). Fíltrelo con un filtro de tamaño de poro de 0,22 μm y almacene el tampón a 4 °C (consulte la tabla de materiales).NOTA: PMSF es inestable en soluciones acuosas. Prepare la solución madre de PMSF como 1 M en etanol al 100% y almacene a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Prepare 75 mL de tampón de extracción complementando el tampón maestro con 3 comprimidos de inhibidores de la proteasa sin EDTA, 2 mM de ATP y 0,1 mM de ditiotreitol (DTT; ver Tabla de Materiales). Agregue 75 mL de tampón de extracción al pellet mientras aún está congelado. Deje el pellet en el tampón de extracción sobre hielo hasta que se descongele. Utilice una pipeta serológica para romper el pellet y acelerar el proceso de descongelación. Con una punta de 1/2 pulgada (13 mm), sonique la resuspensión en hielo durante 10 minutos al 50% de amplitud, 5 segundos encendidos, 5 segundos apagados. Centrifugar el lisado total a 33.746 x g durante 30 min a 4 °C. Durante la centrifugación, prepare 1,5 mL de resina FLAG lavando 3 mL de la suspensión al 50% de resina de afinidad Anti-FLAG (ver Tabla de Materiales) con 40 mL de PBS. Granular la resina centrifugando a 800 x g durante 2 min a 4 °C. Retire con cuidado el PBS sin alterar la resina. Añadir el sobrenadante de la centrifugación del lisado a la resina lavada e incubar con rotación continua a 4 °C durante 1 h. Granular la resina centrifugando a 800 x g durante 2 min a 4°C. Sin alterar la resina, retire el sobrenadante. Vuelva a suspender la resina en 40 mL de Master Buffer y centrifugue a 800 x g durante 2 min a 4 °C. Retire con cuidado el sobrenadante sin alterar la resina. Repite el lavado 1 vez. Transfiera la resina lavada a dos columnas de centrifugado de polipropileno (consulte la tabla de materiales). Lave cada columna 1 vez con 2 ml de tampón maestro. Retire el tampón maestro centrifugando la columna a 1.400 x g durante 2 min a 4 °C. La resina se empaquetará en la parte inferior. Prepare un tampón de elución añadiendo 100 μg/mL de péptido FLAG (consulte la tabla de materiales) al tampón maestro. Añade 300 μL de tampón de elución a la resina empaquetada en cada columna y mezcla suavemente mediante pipeteo para asegurarte de que la resina esté completamente hidratada por el tampón de elución. Deja que la resina se incube con el tampón de elución en hielo durante 10 min. Centrifugar las columnas a 1.400 x g durante 2 min a 4 °C. Transfiera el flujo a un tubo de microcentrífuga limpio y manténgalo en hielo. Esta es la primera fracción. Repita los pasos 1.6.11-1.6.12 de modo que se recojan 4 fracciones de cada columna. Realizar electroforesis en gelSDS-PAGE 35 con las fracciones de elución para determinar sus concentraciones relativas. Mientras el gel funciona, prepare un tampón de diálisis que contenga 500 mM de NaCl, 10 mM de MOPS, 2 mM de MgCl2, 0,1 mM de EGTA y 1 mM de DTT. Combina las fracciones más concentradas. Transfiera la muestra a un casete de diálisis MWCO de 10K (consulte la tabla de materiales) y dialice durante la noche a 4 °C. Utilice 1 L de tampón de diálisis para aproximadamente 500 μL de proteína. Realice al menos tres cambios del tampón de diálisis.NOTA: La columna de centrifugación y el método de elución por centrifugación permiten eluir las proteínas a altas concentraciones (0,5-1 mg/mL). Por lo general, no se requieren pasos de concentración adicionales. Sin embargo, si se desean proteínas más concentradas, cargue las muestras en tubos concentradores de 100.000 MWCO (consulte la tabla de materiales) y centrifugue a 1.400 x g durante 5 minutos a 4 °C. Repita este proceso hasta alcanzar el volumen deseado de solución proteica. Al día siguiente, descargue con cuidado la muestra del casete de diálisis. Alícuota 15 μL por tubo de PCR y coloque los tubos en un recipiente de nitrógeno líquido para la congelación instantánea. Las proteínas congeladas pueden almacenarse a -80 °C para su uso futuro (Figura 3A).NOTA: El rendimiento de miosina-7a utilizando este método suele estar entre 0,5 y 1 mg/L. 2. Purificación de las cadenas ligeras RLC y CALML4 utilizando el sistema E. coli His6-SUMO (7 días) NOTA: Días 1-4 – Clonación y purificación de los plásmidos. Día 5 – Transformación bacteriana. Días 6-7 – Purificación, alícuota y congelación de proteínas finales. Clone los ADNc que codifican RLC y CALML4 en un vector pET-SUMO, que contiene una secuencia His6 antes de SUMO para ayudar en la purificación. Cuando es necesario, el dominio His6-SUMO puede separarse de la proteína de fusión utilizando una proteasa SENP226,36. Para cada proteína de cadena ligera, transforme las células BL21 de E. coli competentes (consulte la Tabla de materiales) con el plásmido e inicie un cultivo líquido de 5 ml durante la noche con las células transformadas. Al día siguiente, inocular los 5 mL de cultivo durante la noche en 1 L de caldo Luria-Bertani (LB) que contenga 50 μg/mL de kanamicina. Deje que el cultivo crezca a 37 °C con agitación continua a 270 rpm hasta que la densidad óptica (O.D.) alcance 0,6 – 1,0.NOTA: El valor de O.D. se duplica aproximadamente cada 20 minutos una vez que llega a 0,2. Monitoree el diámetro exterior con frecuencia. Iniciar la expresión de proteínas añadiendo 250 μM de isopropil b-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) al cultivo. Incubar durante 3-5 h a 37 °C o 16 °C durante la noche con agitación continua a 270 rpm. Granular la E. coli centrifugando la suspensión celular a 4.347 x g durante 15 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante. Prepare el tampón de resuspensión que contiene 50 mM de Tris-HCl, 1 M de NaCl, 5 mM de Imidazol y 10% de glicerol, pH 7.4 (ver Tabla de Materiales). Mantener en hielo. Vuelva a suspender el pellet en 15-25 mL de tampón de resuspensión y transfiera la suspensión a un vaso de precipitados limpio, ajustando el volumen total a 35 mL. Añada DNasa y RNasa a la suspensión en una proporción de 1:1000 (v/v) para una concentración final de 1 μg/mL y 2 μg/mL, respectivamente. Agregue una tableta de inhibidor de proteasa sin EDTA, 4 mM de 2-mercaptoetanol y Triton X al 1% a la suspensión (ver Tabla de Materiales). Mantener en hielo durante 20 min. Sonicar la suspensión de pellets en agua helada con 1 s encendido y 1 s apagado durante un total de 1 min al 100% de amplitud. Dejar el lisado homogeneizado a 4 °C con rotación continua durante 2 h.NOTA: La adición de Triton X ayuda a lisar las células en preparación para la sonicación. Centrifugar los lisados a 26.900 x g durante 45 min a 4 °C. Mientras esto ocurre, comience a preparar la resina de cobalto (consulte la Tabla de materiales). Utilice 500 μL de resina de cobalto para 1 L de cultivo de E. coli . Lavar la resina 2 veces con agua ultrapura y una vez con Suspension Buffer centrifugando a 4.347 x g durante 2 min a 4 °C. Después de la centrifugación del lisado, combine el sobrenadante con la resina lavada y mece suavemente a 4 °C durante 30 min. Centrifugar la suspensión de resina lisada a 4.347 x g durante 2 min a 4 °C. La resina se empaquetará en la parte inferior del tubo. Sin alterar la resina, retire el sobrenadante. Lavar la resina con Resuspension Buffer centrifugando a 4.347 x g durante 2 min a 4 °C. Retire el sobrenadante. Repita los lavados hasta que el sobrenadante esté incoloro. Prepare un tampón de elución que contenga 50 mM de Tris HCl, 300 mM de NaCl, 5 mM de imidazol, 10% de glicerol, 4 mM de 2-mercaptoetanol y 0,25 μM de proteasa SENP2 (ver Tabla de Materiales). Manténgalo en hielo. Vuelva a suspender la resina en 1 mL de tampón de resuspensión e incube durante la noche a 4 °C con rotación continua. Al día siguiente, centrifugar a 4.347 x g durante 2 min para granular la resina. Recoja el sobrenadante, que contiene la proteína de cadena ligera escindida y la proteasa. Agregue 1 mL de tampón de elución a la resina. Repita la centrifugación y recoja el sobrenadante. Eliminación de la proteasa mediante cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC). Brevemente, prepare la columna de exclusión de tamaño (consulte la Tabla de materiales) con un tampón que contenga 50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10% de glicerol y 5 mM de DTT (pH 7,4). Concentrar el sobrenadante a 500 μL utilizando un tubo concentrador de 10.000 MWCO. Cargue la muestra concentrada en una columna conectada a un sistema de cromatografía automatizado mediante una jeringa, fluya con un tampón que contenga 50 mM de Tris-HCl, 300 mM de NaCl, 10% de glicerol y 5 mM de DTT (pH 7,4). Monitorizar las fracciones recogidas mediante espectrofotometría ultravioleta. Recoger las fracciones proteicas con un peso molecular correspondiente a las cadenas ligeras.NOTA: La proteasa también se puede eliminar por cromatografía de afinidad si se diseña una etiqueta de purificación (por ejemplo, una etiqueta GST) en la proteasa. Ejecute un gel SDS-PAGE con las fracciones de elución para determinar la pureza y las concentraciones relativas de las proteínas de cadena ligera en cada fracción. Las fracciones deseadas son aquellas que contienen proteínas de cadena ligera concentradas sin bandas de proteasas visibles. Combine las fracciones de proteína deseadas y concéntrelas utilizando un tubo concentrador de 10.000 MWCO35. Congele rápidamente las alícuotas de proteína en nitrógeno líquido y transfiéralas inmediatamente a -80 °C para su almacenamiento a largo plazo (Figura 3B).NOTA: El rendimiento de RLC y CALML4 utilizando el sistema His6-SUMO de E. coli es de aproximadamente 1-2 mg/L. 3. Ensayo de deslizamiento de filamento de actina adaptado a la miosina-7a (3 h) NOTA: Los métodos utilizados en esta sección son similares a los descritos para otras miosinas31 , con las principales modificaciones siendo la incubación y aplicación de miosina en un tampón de alta fuerza iónica y el largo intervalo requerido para lograr una medición precisa de los desplazamientos de fotograma a fotograma. Preparar 20 μM de actina filamentosa (F-actina) polimerizando actina globular (G-actina) en tampón de polimerización (50 mM KCl, 25 mM MOPS, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT (pH 7,0)) a 4 °C durante la noche. Etiquete la F-actina añadiendo 1,2 veces el exceso molar de rodamina-faloidina (ver Tabla de Materiales). Cubrir con papel de aluminio e incubar en hielo durante al menos 2 h.NOTA: La G-actina se puede comprar a proveedores comerciales (ver Tabla de Materiales) o purificada a partir de polvo de acetona muscular de conejo31,37. La F-actina marcada puede almacenarse a 4 °C durante un máximo de 2 meses a esta concentración. Prepare una cámara de flujo como se describió anteriormente31. Brevemente, coloque dos tiras de cinta adhesiva de doble cara a 2-3 mm de distancia en un portaobjetos de microscopio limpio y tratado con nitrocelulosa (consulte la tabla de materiales). Coloque el cubreobjetos con el lado de nitrocelulosa hacia abajo sobre las tiras, creando una cámara de flujo con un volumen aproximado de 10 μL (Figura 4). Realización de un ensayo de deslizamiento de filamento de actinaA la cámara de flujo, agregue un volumen de cámara de proteína de miosina-7a humana purificada de 0,2 mg/mL en tampón de motilidad de NaCl de 500 mM (500 mM de NaCl, 20 mM de MOPS, 5 mM de MgCl2, 0,1 mM de EGTA (pH 7,4)). Deje incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente.NOTA: Es fundamental agregar miosina-7a en un tampón con alto contenido de sal, ya que esto alivia el estado autoinhibido y permite que la miosina-7a se adhiera a la superficie en la conformación activada. Lave la cámara de flujo con volúmenes de tres cámaras de 1 mg/mL de BSA (consulte la Tabla de materiales) con un tampón de motilidad de NaCl de 150 mM (150 mM de NaCl, 20 mM de MOPS, 5 mM de MgCl2, 0,1 mM de EGTA, 1 mM de DTT (pH 7,4)) y aspire el líquido con una toallita limpia en la salida para absorber el exceso de líquido. Incubar durante 1 minuto después del3º lavado. Fluya un volumen de cámara de 10 nM de F-actina marcada con rodamina faloidina en un tampón de motilidad de NaCl de 150 mM a través de la cámara de flujo. Monitoree la unión de los filamentos de actina a la superficie bajo un microscopio fluorescente con un objetivo 100x. La densidad de los filamentos de actina debe ser óptima (Figura 5A), asegurando suficientes filamentos en el campo de visión para el seguimiento, pero lo suficientemente escasa como para evitar la superposición de múltiples filamentos, lo que complica el seguimiento. Lave la cámara de flujo con volúmenes de tres cámaras de 150 mM de tampón de motilidad de NaCl para eliminar los filamentos de actina no unidos y el exceso de rodamina-faloidina. Inicie la motilidad añadiendo un volumen de cámara del tampón final (200 mM de NaCl, 20 mM de MOPS, 5 mM de MgCl2, 0,1 mM de EGTA, 50 mM de DTT, 2 mM de ATP, 2,5 mg/ml de glucosa, 100 μg/mL de glucosa oxidasa, 2 μM RLC, 2 μM CaM, 2 μM CALML4). Grabe imágenes en un microscopio de fluorescencia utilizando una excitación de 561 nm para visualizar la actina marcada con rodamina faloidina. Encuentre un área en el portaobjetos con la densidad de actina deseada (Figura 5A) y capture imágenes cada 30 s durante 30 minutos.NOTA: La velocidad de la miosina-7a de los mamíferos es de aproximadamente 5 nm/s. Al establecer la velocidad de fotogramas de adquisición, es importante asegurarse de que los desplazamientos de los filamentos entre fotogramas sean lo suficientemente largos (más de un píxel) para permitir un seguimiento preciso. Los movimientos de subpíxeles entre fotogramas pueden provocar una sobreestimación de la velocidad. La velocidad de fotogramas de 30 s permite que los filamentos de actina se muevan unos 150 nm entre fotogramas, lo que corresponde a más de dos píxeles en el microscopio. Sin embargo, se debe tener cuidado de que se pueda observar un desplazamiento significativo en el microscopio que se está utilizando. Si está disponible, se puede utilizar la grabación de múltiples posiciones para recopilar simultáneamente varios campos de visión para el análisis. Análisis del movimiento de los filamentos de actina mediante el programa FAST (instalado en un Mac)38.NOTA: El programa FAST utilizado aquí es solo una de las muchas opciones para cuantificar el movimiento del filamento. Elegimos usar FAST porque está automatizado, es rápido y no requiere software de pago. Otras opciones incluyen algoritmos basados en MATLAB, como FIESTA, métodos basados en ImageJ/FIJI, como MTrack2 y Manual Tracking, y métodos basados en Python, como Philament39.Descargue e instale el programa FAST (github.com/NeilBillington/FASTrack3 – versión compatible con python3 con un módulo adicional para la conversión de archivos nd2. NB: La versión original de python2 se puede encontrar en github.com/turalaksel/FASTrack). Ejecute el programa FAST como se describe en38 utilizando un valor de tolerancia de 33 para retener solo los filamentos que se mueven suavemente.NOTA: Si las imágenes contienen desviaciones debido a problemas mecánicos con el escenario o a la recopilación de varias series al mismo tiempo, primero se deben estabilizar las películas. Para ello, recomendamos el plugin FIJI Image Stabilizer, disponible para su descarga en la siguiente dirección – (https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html). Utilice el programa FAST para analizar las imágenes de .tif recién creadas configurando primero los valores -xmax y -ymax. Estos establecen los parámetros para la salida del diagrama de dispersión por el programa y representan la longitud de filamento más larga (en nm) y la velocidad máxima del filamento (en nm/s). En este ejemplo, utilizamos 20.000 nm para -xmax y 20 nm/s para -ymax para garantizar que se capturen todos los datos (Figura 5D). Utilice -px para establecer el tamaño de píxel de la imagen adquirida, que aquí será de 65 nm, y -minv para establecer la velocidad mínima (en nm/s) requerida de un filamento para su inclusión en el análisis. Para la baja velocidad de la miosina-7a en este ejemplo, utilice 0,1 nm/s. Utilice -maxd para establecer la distancia máxima permitida entre fotogramas para que los filamentos se vinculen. Esto se establece para evitar vincular filamentos separados entre marcos y, en este ejemplo, usamos el valor predeterminado de 2000 nm. Use-pt para establecer la tolerancia a las fluctuaciones en las velocidades de los filamentos y solo incluya filamentos con movimientos suaves. En este ejemplo se utiliza un umbral de tolerancia del 33%. Esto significa que los filamentos con una desviación estándar de velocidad superior al 33% de la media de velocidad se excluirán del análisis posterior. Por último, use -d para indicar la carpeta que contiene las pilas de .tif para el análisis. La cadena de comando completa con los parámetros y valores dados será: fast -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [nombre de la carpeta que contiene películas].NOTA: El programa FAST generará diagramas de dispersión (Figura 5D) con sus datos brutos asociados, que se pueden extraer para su análisis y visualización en otros programas (Figura 5C). También generará un gráfico de las trayectorias de los filamentos rastreados (Figura 5B), que debe usarse para verificar que el seguimiento funciona como se espera. A continuación se incluyen ejemplos de los gráficos y otras posibles visualizaciones de datos.