基于 MultiBac 系统的人肌球蛋白 7a 纯化和生物物理表征

注意：这里我们描述了一种合成完整人肌球蛋白 7a 全酶并在体外表征其运动性的方案。该方案分为三个部分：首先，使用 MultiBac 杆状病毒蛋白表达系统表达人肌球蛋白 7a;其次，使用 大肠杆菌 His6-SUMO 系统分别纯化肌球蛋白 7a 轻链;最后，使用肌动蛋白丝滑动测定研究人肌球蛋白 7a 的运动。 1. 基于 MultiBac 系统的肌球蛋白-7a 复合物生产 创建用于表达人肌球蛋白 7a 复合物的杆状病毒多基因盒（16 天）注：需要一个克隆周期（4 天）将肌球蛋白-7a 亚基的 cDNA 插入 pACEBac1 载体中，需要三个克隆周期才能完成表达肌球蛋白-7a 复合物所需的所有增殖模块的逐步连接，总共需要 16 天。按照制造商的方案，使用商业试剂盒将编码 肌球蛋白-7a 重链 （HC）、钙调蛋白、CALML4 和 RLC 的 cDNA 克隆到 pACEBac1 载体中（参见 材料表; 图 1A）。在肌球蛋白 7a HC 的 C 端插入 FLAG 标签以帮助纯化。注：哺乳动物肌球蛋白 7a 以两种剪接亚型形式产生，仅在 N 端23 处的 11 个氨基酸片段不同。这种短的 N 末端延伸在调节肌球蛋白-7a 的 ATP 酶活性中起关键作用14。已经表明，添加 N 端标签会破坏这种 N 端延伸的正常调节，并显着降低电机的酶活性和运动性14。因此，采用 C 端 FLAG 标签以避免破坏蛋白质的自然调节。 如下所述，使用归巢核酸内切酶/BstXI 增殖构建肌球蛋白 7a 全酶的多基因表达盒（图 1B）。注：归巢核酸内切酶 I-CeuI 产生与 BstXI 消化产生的末端兼容的粘性末端。连接后，会产生一个归巢核酸内切酶/BstXI 杂交限制性位点，该位点不能被任何一种酶切割。可以重复相同的过程来集成更多的乘法模块。如果插入片段或载体构建体上存在 I-CeuI 和 BstXI 的多个限制性位点，则必须通过定点诱变消除这些额外的位点，以确保 I-CeuI 和 BstXI 切割位点是唯一的。 插入片段制备：用归巢核酸内切酶 I-CeuI 消化插入片段构建体（例如 pACEBac-M7a HC）（参见 材料表），然后使用 PCR 纯化试剂盒纯化线性化质粒（参见 材料表）。此外，用 BstXI 消化线性化质粒（参见 材料表），使用凝胶电泳分离含有基因表达盒的片段，并使用凝胶提取试剂盒进行纯化（参见 材料表）。注意：根据制造商的方案，I-CeuI 和 BstXI 需要不同的缓冲条件才能达到 100% 活性。此外，使用 I-CeuI 完全切割至少需要 3 小时，而 BstXI 只需要 15 分钟的孵育时间。因此，需要按顺序进行消化。 载体制备：通过 BstXI 消化线性化载体构建体（例如 pACEBac-CaM）。碱性磷酸酶包含在载体制备中，以防止载体质粒连接到自身（参见 材料表）。通过电泳获得消化产物，并使用凝胶提取试剂盒进行纯化。 连接：用 T4 DNA 连接酶连接 I-CeuI/BstXI 处理的插入片段和 BstXI 处理的载体（参见 材料表）。在室温 （20 °C -25 °C） 下以 1：1 的质量比进行连接反应 10 分钟，使插入 DNA 与载体 DNA 的质量比接近 100 ng，在每次连接反应中保持总质量接近 100 ng。 转化和质粒分析：按照制造商的建议将连接混合物转化到 DH5α 细胞中（参见 材料表），并筛选庆大霉素抗性的阳性菌落。使用市售试剂盒纯化质粒（参见 材料表），并根据特异性限制性消化模式和插入片段的 DNA 测序验证正确的克隆（例如，同时含有 M7a HC 和 CaM 的质粒）。 整合多个基因表达盒：重复步骤 1.1.2 至 1.1.6 以整合表达其他肌球蛋白-7a 亚基的其他基因盒。 重组杆粒 DNA 生产和纯化（4 天; 图 1C）。注：第 1 天 – 细菌转化和转化菌落的生长。第 2-3 天 – 生长菌落和筛选成功转化。第 3 天 – 选择并划线阳性菌落，开始过夜接种。第 4 天 – 杆粒 DNA 的纯化。按照制造商的建议，用 1 ng 测序的 pACE-M7aHC-RLC-CALML4-CaM 质粒转化 DH10Bac 感受态细胞（参见 材料表）。 将 20-200 μL 细胞铺在含有 50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 庆大霉素、100 μg/mL 四环素、100 μg/mL 卤代吲哚基-β-半乳糖苷和 40 μg/mL IPTG 的琼脂平板上（参见 材料表），并将板在 37°C 下孵育 48 小时，以允许在阴性克隆中形成深蓝色。注：卤化吲哚基-β-半乳糖苷对继续表达 LacZ 的菌落进行染色（表明转座不成功），从而能够选择转座成功的白色菌落。 仔细选择一个分离的白色集落，并在 5 mL 含有 50 μg/mL 卡那霉素、7 μg/mL 庆大霉素和 10 μg/mL 四环素的 LB 培养基中，在 37 °C 下在轨道振荡器中以 225 rpm 的速度培养细胞过夜。 将培养物以 2,465 x g 离心 10 分钟以沉淀大 肠杆菌。弃去上清液，将沉淀重悬于试剂盒中的 300 μL 缓冲液 P1 中。注：虽然此处使用了 Miniprep 试剂盒中的缓冲液，但纯化杆粒产物的方案与试剂盒提供的方案不同。 从试剂盒中加入 300 μL 缓冲液 P2。将试管倒置几次进行混合，然后在室温下孵育 3 分钟。 从试剂盒中加入 300 μL N3 缓冲液，倒置混合以终止裂解反应。在 4 °C 下以 17,885 x g 离心 10 分钟。 将上清液转移到干净的无菌管中，再重复离心 10 分钟。 将 800 μL 上清液转移到另一个无菌 1.7 mL 微量离心管中（参见 材料表），并加入 600 μL 冷异丙醇（参见 材料表），通过严格倒置混合。然后在 4 °C 下以 17,885 x g 离心 20 分钟。 弃去上清液并找到白色小颗粒。用 800 μL 冷的 70% 乙醇洗涤沉淀（参见 材料表），并在 4 °C 下以 17,885 x g 离心 5 分钟。 沿管壁小心添加乙醇，以免干扰沉淀。 弃去上清液并重复乙醇洗涤一次。在室温下风干沉淀 5 分钟。如有必要，小心吸出多余的液体。 用试剂盒中的 20 μL EB 缓冲液溶解沉淀。通过轻弹试管或通过移液轻轻混合确保沉淀完全溶解。使用分光光度计测定浓度（参见 材料表）。 根据需要调整缓冲液体积，使杆粒浓度约为 1 μg/μL。将杆粒 DNA 储存在 4 °C 直至准备好生产 P0 病毒。注意：纯化的杆粒可以保持在 4 °C 并保持有效数月。我们已经看到 1 岁以下的杆粒产品成功转染。或者，可以将杆粒等分并储存在 -20 °C。应避免多次冻融循环，因为它们会降低转染效率。 用杆粒转染 Sf9 昆虫细胞以产生重组杆状病毒（6 天; 图 1D）注：第 1 天 – 用杆粒 DNA 转染细胞。第 2-6 天 – 观察细胞的生长和表达。第 6 天 – 收集 P0 病毒。将培养基中的 Sf9 细胞（参见 材料表）以 0.33 x 106 个细胞/mL 的浓度加入 6 孔板中，每孔 3 mL。让板在室温下静置 30 分钟，让细胞附着在板的底部。 对于每个孔，通过在无菌微量离心管中混合 10 μL 阳离子脂质体转染试剂（参见 材料表）和 250 μL 改进的最低必需培养基 （MEM） 培养基（参见 材料表）来制备转染混合物。倒置混合并在室温下孵育 5 分钟。 向转染混合物中加入 1 μg（基于步骤 1.2.12 中确定的浓度）未稀释的肌球蛋白-7a 杆粒。倒置混合并在室温下孵育 5 分钟。 将整个 DNA-脂质混合物均匀滴加到孔中。为未转染的细胞留出一个孔作为阴性对照。 用薄膜密封 6 孔板（参见 材料表）并在 27 °C 下孵育 6 天。在这段时间里观察成长和分离。如果构建体上存在荧光标签，请检查荧光发展（图 2）。 当转染的细胞出现晚期感染的迹象时，将含有病毒的培养基从感染的孔中转移到 15 mL 锥形管中，并以 805 x g 离心 10 分钟。 将上清液转移到干净的 15 mL 锥形管中，用铝箔包裹，并在 4 °C 下储存。 该产品现在是 P0 病毒，根据我们的经验，可以有效储存和使用长达四个月。 扩增杆状病毒原液（3-5 天; 图 1E）在 250 mL 锥形瓶中的 Sf9 细胞培养基中制备浓度为 2 x 106 个细胞/mL 的 100 mL（或所需体积）的 Sf9 细胞（参见 材料表）。 向 Sf9 细胞悬浮培养物中加入 1：100 比例 （v/v） 的 P0 病毒原液，并在 27 °C 下在轨道振荡器中以 135 rpm 孵育。 每 24 小时监测一次生长，直到细胞达到 ~90% 的细胞死亡。一旦达到此范围，将细胞悬液以 500 x g 离心 10 分钟，并收集含有 P1 病毒的上清液。 使用 0.22 μm 真空过滤过滤上清液（参见 材料表）。将过滤后的产品避光保存并储存在 4 °C。 该产品现在是 P1 病毒。注：病毒滴度在 4 °C 下长期储存会降低。如果新鲜病毒储液已储存 4 个月以上，请考虑制备新鲜病毒储液，或在用于表达34 之前对病毒储液进行滴定。 蛋白质表达（从开始表达到收集细胞沉淀之间 60 -72 小时; 图 1E）制备浓度为 2 x 106 个细胞/mL 的对数期生长 Sf9 细胞，并以 12 mL 病毒与 300 mL 细胞悬液的比例添加 P1 病毒。注：蛋白质产量约为 1 mg/L。建议至少使用 1.5 L 细胞悬液进行这种蛋白质表达。 在 27 °C 的轨道振荡器中以 135 rpm 培养细胞约 60 小时。注：可以在不同的时间点收集小样品，并使用 SDS 凝胶进行分析以评估蛋白质表达水平。此外，如果蛋白质与荧光标签融合，则可以使用荧光显微镜评估表达水平。细胞应在细胞死亡开始前收获。 将细胞悬液在 4 °C 下以 3,735 x g 离心 5 分钟以沉淀细胞。沉淀物可以储存在 -80 °C 下直至进一步使用或保存以长期储存。我们通常在几周内使用细胞沉淀，但在冷冻几个月后已经回收了活性蛋白。 蛋白质纯化（2 天; 图 1F)注：第 1 天 – 使用 FLAG 亲和层析进行蛋白质提取和纯化。第 2 天 – 透析过夜后分装并冷冻样品。下面描述的方案用于从 1.5 L 细胞沉淀中纯化肌球蛋白-7a。制备含有 10 mM MOPS （pH 7.2）、500 mM NaCl、10 mM MgCl2、1 mM EGTA、1 μg/mL 亮肽素和 100 μg/mL 苯甲基磺酰氟 （PMSF） 的主缓冲液。用 0.22 μm 孔径过滤器过滤，并将缓冲液储存在 4 °C（参见 材料表）。注：PMSF 在水溶液中不稳定。在 100% 乙醇中制备 1 M 的 PMSF 储备溶液，并在 -20 °C 下储存长达 6 个月。 通过在主缓冲液中补充 3 片不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂、2 mM ATP 和 0.1 mM 二硫苏糖醇（DTT;参见 材料表），制备 75 mL 提取缓冲液。 在沉淀仍冷冻时向沉淀中加入 75 mL 提取缓冲液。将沉淀物放在冰上的提取缓冲液中，直至其解冻。使用血清移液管打碎沉淀以加速解冻过程。 使用 1/2 英寸（13 毫米）尖端，以 50% 振幅、5 秒开、5 秒关，在冰上对重悬液进行超声处理 10 分钟。 将总裂解物在 4 °C 下以 33,746 x g 离心 30 分钟。 在离心过程中，用 40 mL PBS 洗涤 3 mL 的 50% 抗 FLAG 亲和树脂浆液（参见 材料表），制备 1.5 mL FLAG 树脂。通过在 4 °C 下以 800 x g 离心 2 分钟来沉淀树脂。 小心去除 PBS，不要干扰树脂。 将裂解物离心的上清液加入到洗涤的树脂中，并在 4 °C 下连续旋转孵育 1 小时。 在 4°C 下以 800 x g 离心 2 分钟，使树脂沉淀。 在不干扰树脂的情况下，去除上清液。 将树脂重悬于 40 mL 主缓冲液中，并在 4 °C 下以 800 x g 离心 2 分钟。 小心去除上清液，不要干扰树脂。重复洗涤 1 次。 将洗涤后的树脂转移到两个聚丙烯离心柱中（参见 材料表）。用 2 mL 主缓冲液洗涤每根色谱柱 1 次。在 4 °C 下以 1,400 x g 离心色谱柱 2 分钟，除去主缓冲液。 树脂将填充在底部。 向主缓冲液中加入 100 μg/mL FLAG 肽（参见 材料表）制备洗脱缓冲液。 向每根色谱柱的填充树脂中加入 300 μL 洗脱缓冲液，并通过移液轻轻混合，以确保树脂被洗脱缓冲液完全水合。让树脂与洗脱缓冲液在冰上孵育 10 分钟。 将色谱柱在 4 °C 下以 1,400 x g 离心 2 分钟。 将流出液转移到干净的微量离心管中，并将其保存在冰上。这是第一个部分。 重复步骤 1.6.11-1.6.12，以便从每列中收集 4 个馏分。 用洗脱级分进行 SDS-PAGE 凝胶电泳35 以确定它们的相对浓度。凝胶电泳时，制备含有 500 mM NaCl、10 mM MOPS、2 mM MgCl2、0.1 mM EGTA 和 1 mM DTT 的透析缓冲液。 合并最浓缩的馏分。将样品转移到 10K MWCO 透析盒中（参见 材料表）并在 4 °C 下透析过夜。 使用 1 L 透析缓冲液处理约 500 μL 蛋白质。至少更换 3 次透析缓冲液。注：离心柱和离心洗脱方法允许在高浓度 （0.5-1 mg/mL） 下洗脱蛋白质。通常不需要进一步的浓缩步骤。然而，如果需要更浓缩的蛋白质，将样品加载到 100,000 MWCO 浓缩管上（参见 材料表），并在 4 °C 下以 1,400 x g 离心 5 分钟。重复此过程，直到达到所需的蛋白质溶液体积。 第二天，小心地从透析盒中取出样品。每个 PCR 管分装 15 μL，然后将试管放入液氮容器中进行快速冷冻。冷冻的蛋白质可以储存在 -80 °C 以备将来使用（图 3A）。注：使用这种方法的肌球蛋白-7a 的产量通常在 0.5 至 1 mg/L 之间。 2. 使用 大肠杆菌 His6-SUMO 系统纯化轻链 RLC 和 CALML4（7 天） 注：第 1-4 天 – 质粒的克隆和纯化。第 5 天 – 细菌转化。第 6-7 天 – 最终蛋白质的纯化、等分和冷冻。 将编码 RLC 和 CALML4 的 cDNA 克隆到 pET-SUMO 载体中，该载体在 SUMO 之前包含 His6 序列以帮助纯化。需要时，可以使用 SENP2 蛋白酶从融合蛋白上切割 His6-SUMO 结构域26,36。 对于每种轻链蛋白，用质粒转化 BL21 大肠杆菌 感受态细胞（参见 材料表），并用转化的细胞开始 5 mL 过夜液体培养。 第二天，将 5 mL 过夜培养物接种到 1 L 含有 50 μg/mL 卡那霉素的 Luria-Bertani （LB） 肉汤中。让培养物在 37 °C 下生长，以 270 rpm 的速度连续振荡，直到光密度 （O.D.） 达到 0.6 – 1.0。注意：一旦达到 0.2，OD 值大约每 20 分钟翻一番。经常监控 O.D.。 通过向培养物中加入 250 μM 异丙基 b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷 （IPTG） 来启动蛋白质表达。在 37 °C 或 16 °C 下孵育 3-5 小时过夜，并以 270 rpm 连续振荡。 通过在 4 °C 下以 4,347 x g 离心细胞悬液 15 分钟来沉淀大肠杆菌。 丢弃上清液。 制备含有 50 mM Tris-HCl、1 M NaCl、5 mM 咪唑和 10% 甘油的重悬缓冲液，pH 值为 7.4（参见 材料表）。保持在冰上。 将沉淀重悬于 15-25 mL 重悬缓冲液中，并将悬浮液转移到干净的烧杯中，将总体积调节至 35 mL。以 1：1000 （v/v） 的比例向悬浮液中加入 DNase 和 RNase，终浓度分别为 1 μg/mL 和 2 μg/mL。向悬浮液中加入一份不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂片剂、4 mM 2-巯基乙醇和 1% Triton X（参见 材料表）。在冰上保持 20 分钟。 在冰水中对沉淀悬浮液进行超声处理，开启 1 秒，关闭 1 秒，以 100% 振幅共 1 分钟。将匀浆裂解物在 4 °C 下连续旋转 2 小时。注：添加 Triton X 有助于裂解细胞，为超声处理做准备。 将裂解物在 4 °C 下以 26,900 x g 离心 45 分钟。此时，开始准备钴树脂（参见 材料表）。使用 500 μL 钴树脂进行 1 L 大肠杆菌 培养。在 4 °C 下以 4,347 x g 离心 2 分钟，用超纯水洗涤树脂 2 次，然后用悬浮缓冲液洗涤 1 次。 裂解物离心后，将上清液与洗涤的树脂混合，并在 4 °C 下轻轻摇动 30 分钟。 将裂解物 – 树脂悬浮液在 4°C 下以 4,347 x g 离心 2 分钟。 树脂将填充在试管底部。在不干扰树脂的情况下，去除上清液。 在 4 °C 下以 4,347 x g 离心 2 分钟，用重悬缓冲液洗涤树脂。 去除上清液。重复洗涤，直到上清液变为无色。 制备含有 50 mM Tris HCl、300 mM NaCl、5 mM 咪唑、10% 甘油、4 mM 2-巯基乙醇和 0.25 μM SENP2 蛋白酶的洗脱缓冲液（参见 材料表）。把它放在冰上。 将树脂重悬于 1 mL 重悬缓冲液中，并在 4 °C 下连续旋转孵育过夜。 第二天，以 4,347 x g 离心 2 分钟以沉淀树脂。收集上清液，其中含有裂解的轻链蛋白和蛋白酶。 向填料中加入 1 mL 洗脱缓冲液。重复离心并收集上清液。 通过快速蛋白质液相色谱 （FPLC） 去除蛋白酶。简而言之，用含有 50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10% 甘油和 5 mM DTT （pH 7.4） 的缓冲液制备体积排阻柱（参见 材料表）。使用 10,000 MWCO 浓缩管将上清液浓缩至 500 μL。使用注射器将浓缩的样品加载到连接到自动色谱系统的色谱柱上，用含有 50 mM Tris-HCl、300 mM NaCl、10% 甘油和 5 mM DTT （pH 7.4） 的缓冲液流出。使用紫外分光光度法监测收集的馏分。收集分子量对应于轻链的蛋白质级分。注：如果在蛋白酶中设计了纯化标签（例如 GST 标签），则蛋白酶也可以通过亲和层析去除。 用洗脱级分运行 SDS-PAGE 凝胶，以确定每个级分中轻链蛋白的纯度和相对浓度。所需组分是那些含有浓缩轻链蛋白且没有任何可见蛋白酶条带的组分。合并所需的蛋白质组分，并使用 10,000 MWCO 浓缩管35. 在液氮中快速冷冻蛋白质等分试样，并立即转移至 -80 °C 进行长期储存（图 3B）。注：使用 大肠 杆菌 His6-SUMO 系统的 RLC 和 CALML4 的产量约为 1-2 mg/L。 3. 肌球蛋白 7a 定制肌动蛋白丝滑动测定 （3 h） 注意：本节中使用的方法类似于其他肌球蛋白31 描述的方法，主要修改是肌球蛋白在高离子强度缓冲液中的孵育和应用，以及实现准确测量帧到帧位移所需的长间隔。 通过在聚合缓冲液（50 mM KCl、25 mM MOPS、2 mM MgCl 2 、1 mM DTT（pH 7.0））中聚合球状肌动蛋白（G-肌动蛋白）在4°C下过夜来制备 20 μM 丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）。通过添加 1.2 倍摩尔过量的罗丹明 – 鬼笔环肽来标记 F-肌动蛋白（参见 材料表）。用铝箔覆盖并在冰上孵育至少 2 小时。注：G-肌动蛋白可从商业供应商处购买（参见材料表）或从兔肌肉丙酮粉末31,37 中纯化。标记的 F-肌动蛋白可以在该浓度下在 4 °C 下储存长达 2 个月。 如前所述准备一个流动室31.简而言之，将两条相距 2-3 毫米的双面胶带放在清洁和硝酸纤维素处理的显微镜载玻片上（参见 材料表）。将盖玻片硝酸纤维素面朝下放在试纸条上，形成一个体积约为 10 μL 的流通室（图 4）。 进行肌动蛋白丝滑动测定向流通室中，在 500 mM NaCl 运动缓冲液（500 mM NaCl、20 mM MOPS、5 mM MgCl2、0.1 mM EGTA （pH 7.4））中加入一个体积为 0.2 mg/mL 纯化的人肌球蛋白-7a 蛋白的腔室。在室温下孵育 5 分钟。注意：在高盐缓冲液中添加肌球蛋白 7a 至关重要，因为这可以缓解自身抑制状态并允许肌球蛋白 7a 以活化构象粘附在表面。 在 150 mM NaCl 运动缓冲液（150 mM NaCl、20 mM MOPS、5 mM MgCl2、0.1 mM EGTA、1 mM DTT（pH 7.4））中，用三室体积的 1 mg/mL BSA（参见材料表）洗涤流通室，通过在出口处使用干净的抹布吸收多余的液体。第 3 次洗涤后孵育 1 分钟。 在 150 mM NaCl 运动缓冲液中，将一个腔室体积的 10 nM 罗丹明鬼笔环肽标记的 F-肌动蛋白流过流动室。在具有 100 倍物镜的荧光显微镜下监测肌动蛋白丝与表面的结合。肌动蛋白丝的密度应该是最佳的（图 5A），确保在视野中有足够的细丝进行跟踪，但又足够稀疏以防止多根细丝重叠，这会使跟踪复杂化。 用三腔体积的 150 mM NaCl Motility Buffer 清洗流动室，以去除未结合的肌动蛋白丝和过量的罗丹明-鬼笔环肽。 通过添加一个腔室体积的最终缓冲液（200 mM NaCl、20 mM MOPS、5 mM MgCl2、0.1 mM EGTA、50 mM DTT、2 mM ATP、2.5 mg/ml 葡萄糖、100 μg/mL 葡萄糖氧化酶、2 μM RLC、2 μM CaM、2 μM CALML4）来启动运动。 使用 561 nm 激发在荧光显微镜上记录图像，以观察罗丹明鬼笔环肽标记的肌动蛋白。在载玻片上找到具有所需肌动蛋白密度的区域（图 5A），并每 30 秒捕获一次图像，持续 30 分钟。注意：哺乳动物肌球蛋白 7a 的速度约为 5 nm/s。在设置采集帧速率时，重要的是要确保帧之间的细丝位移足够长（超过一个像素）以实现准确跟踪。帧之间的子像素移动可能会导致对速度的高估。30 秒的帧速率允许肌动蛋白丝在帧之间移动约 150 nm，对应于显微镜上的两个以上像素。但是，应注意在所使用的显微镜上可以观察到明显的位移。如果可用，可以使用多位置记录同时收集多个视场进行分析。 使用 FAST 程序（安装在 Mac 上）分析肌动蛋白丝的运动38。注意：此处使用的 FAST 程序只是量化细丝运动的众多选项之一。我们选择使用 FAST，因为它是自动化的、快速的，并且不需要付费软件。其他选项包括基于 MATLAB 的算法（如 FIESTA）、基于 ImageJ/FIJI 的方法（如 MTrack2 和手动跟踪）以及基于 Python 的方法（如 Philament39）。下载并安装 FAST 程序 （github.com/NeilBillington/FASTrack3 – python3 兼容版本，以及用于 nd2 文件转换的附加模块。注意：原始 python2 版本可以在 github.com/turalaksel/FASTrack） 中找到。 按照38 中的说明运行 FAST 程序，使用容差值 33 仅保留平滑移动的细丝。注意：如果图像包含舞台机械问题或同时收集多个系列的漂移，则应首先对影片进行稳定处理。为此，我们推荐斐济插件 Image Stabilizer，可从以下地址下载 – （https://www.cs.cmu.edu/~kangli/code/Image_Stabilizer.html）。 使用 FAST 程序分析新创建的 .tif 图像，方法是首先设置 -xmax 和 -ymax 值。这些参数为程序输出的散点图设置参数，并表示最长细丝长度（以 nm/s 为单位）和最大细丝速度（以 nm/s 为单位）。在此示例中，我们使用 20,000 nm 的 -xmax 和 20 nm/s 的 -ymax 来确保捕获所有数据（图 5D）。 使用 -px 设置采集图像的像素大小，此处为 65 nm，使用 -minv 设置细丝包含在分析中所需的最小速度（以 nm/s 为单位）。对于本例中肌球蛋白-7a 的低速度，请使用 0.1 nm/s。 使用 -maxd 设置帧之间允许链接的灯丝的最大距离。设置此参数是为了避免在帧之间链接单独的细丝，在此示例中，我们使用默认的 2000 nm。 使用 pt 设置细丝速度波动的容差，并且仅包含运动平稳的细丝。此示例使用 33% 的容差阈值。这意味着速度标准差大于速度平均值 33% 的细丝将被排除在进一步分析之外。 最后，使用 -d 表示包含用于分析的.tif堆栈的文件夹。包含给定参数和值的整个命令字符串将为：fast -xmax 20000 -ymax 20 -px 65 -minv 0.1 -maxd 2000 -pt 33 -d [包含影片的文件夹名称]。注意：FAST 程序将输出散点图（图 5D）及其相关的原始数据，可以提取这些数据以便在其他程序中进行分析和可视化（图 5C）。它还将输出跟踪细丝路径的图（图 5B），该图应用于验证跟踪是否按预期工作。下面包括绘图和其他可能的数据可视化的示例。