زرع الأجهزة الإلكترونية الضوئية في الحبل الشوكي للقوارض
Summary
يفصل هذا البروتوكول إجراء جراحيا لإجراء جراحة الحبل الشوكي ولزرع وتأمين ساق بصرية فوق الحبل الشوكي في القوارض.
Abstract
يمكن أن يوفر التعديل العصبي تطبيقات تشخيصية وتعديلية وعلاجية. في حين تم إجراء عمل مكثف في الدماغ ، لا يزال تعديل الحبل الشوكي غير مستكشف نسبيا. يفرض نسيج الحبل الشوكي الرقيق والمتحرك بطبيعته قيودا تجعل الزرع الدقيق للمجسات العصبية أمرا صعبا. على الرغم من التطورات الحديثة في أجهزة التعديل العصبي ، وخاصة الإلكترونيات الحيوية المرنة ، فإن فرص توسيع استخدامها في الحبل الشوكي كانت محدودة بسبب التعقيدات الجراحية لزرع الجهاز. هنا ، نقدم سلسلة من البروتوكولات الجراحية المصممة خصيصا لزرع جهاز إلكتروني بصري مصنوع خصيصا يتفاعل مع الحبل الشوكي في القوارض. يتم تفصيل خطوات وضع وتثبيت ساق بصرية على جزء معين من الحبل الشوكي عبر طريقتين مختلفتين للزرع الجراحي هنا. تم تحسين هذه الطرق لمجموعة متنوعة من الأجهزة والتطبيقات ، والتي قد تتطلب أو لا تتطلب اتصالا مباشرا بالحبل الشوكي للتحفيز البصري. لتوضيح المنهجية ، تتم الإشارة إلى تشريح العمود الفقري أولا لتحديد المعالم البارزة قبل إجراء شق الجلد. يتم توضيح الخطوات الجراحية لتأمين ساق بصرية فوق العمود الفقري العنقي في القوارض. ثم يتم تحديد الإجراءات لتأمين الجهاز الإلكتروني البصري المتصل بالساق البصرية في مساحة تحت الجلد بعيدا عن الحبل الشوكي ، مما يقلل من الاتصال المباشر غير الضروري. تشير الدراسات السلوكية التي تقارن التي تتلقى الغرسات بتلك التي تخضع لجراحات وهمية إلى أن السيقان البصرية لم تؤثر سلبا على وظيفة الأطراف الخلفية أو الأمامية بعد سبعة أيام من الزرع. يوسع العمل الحالي مجموعة أدوات التعديل العصبي لاستخدامها في الدراسات المستقبلية التي تهدف إلى التحقيق في تدخلات الحبل الشوكي المختلفة.
Introduction
يسهل الحبل الشوكي مجموعة من وظائف الجهاز العصبي المركزي الأساسية ، من تنسيق السلوكيات الحركية إلى تنظيم عمليات الاستتباب مثل التنفس 1,2. يتطلب توضيح دور الشبكة المتطورة من الدوائر عبر الحبل الشوكي واجهات ، سواء للتحفيز الكهربائي أو التسجيل أو توصيل الدواء أو التحفيز البصري للمناطق المستهدفة3،4،5،6. على الرغم من تطوير الأجهزة لتمكين مثل هذه الاستجوابات7،8،9،10،11 ، إلا أن التقنيات الجراحية المتخصصة مطلوبة لزرعها المزمن في الحبل الشوكي4. على وجه الخصوص ، زاد الحبل الشوكي والفقرات المرتبطة به من التعرض للتشوهات الميكانيكية الناجمة عن الحركات الطبيعية مثل التمديد والانحناء8،12،13. هذه الخصائص الفريدة للحبل الشوكي تجعل من الصعب جوهريا ضمان بقاء المجسات المزروعة مستقرة ووظيفية ومؤمنة في جزء معين على مدى فترات طويلة من الزمن.
هنا ، يتم وصف بروتوكول جراحي لإدخال وتأمين ساق بصرية في جزء مستهدف من الحبل الشوكي (الشكل 1 أ). نظرا لأنه ثبت أن التواصل مع منطقة عنق الرحم على وجه الخصوص يقدم تحديات فريدة9 ، يتم عرض خطوات الزرع على وجه التحديد على منطقة عنق الرحم C5. من المفترض أن تعقيد العمود الفقري العنقي ينشأ من وضعه الأعمق ووفرة العضلات ، وهي خاصية ليست بارزة على طول بقية الحبل الشوكي. بغض النظر ، تم تصميم الإجراءات الموضحة في هذا البروتوكول لتكون قابلة للتكيف مع العمليات الجراحية عبر مناطق الحبل الشوكي المختلفة. يتم توفير تعليمات تدريجية لتحديد موقع أجزاء الحبل الشوكي وتحديدها باستخدام “معالم” تشريحية واضحة يمكن التعرف عليها من فوق الجلد (الشكل 1 ب). ثم يوضح البروتوكول تقنيتين للزرع الجراحي: واحدة مصممة للتحقيقات التي تتطلب اتصالا مباشرا بالحبل الشوكي ، والأخرى للتحقيقات التي قد لا تتطلب اتصالا مباشرا. تم تصميم الخطوات الموصوفة ليتم استنساخها من قبل أي باحث لديه تدريب في جراحة بقاء القوارض.
يشمل هذا البروتوكول تعليمات خطوة بخطوة لزرع جهاز إلكتروني بصري (18 مم × 13 مم) مع ساق بصرية مرنة متصلة على مستوى عنق الرحم C5. يتم تأمين الجهاز القابل للزرع تحت الجلد ذيليا إلى C5 ويتكون من مؤشر الصمام الثنائي الباعث للضوء المجهري (μLED) ، والذي يضيء عند حدوث التحفيز البصري للحبل الشوكي ، مما يوفر ردود فعل حية لوظائف الجهاز. تم تقييم تأثير الساق البصرية المزروعة على الوظيفة الحركية الطبيعية على القوارض التي تلقت غرسات وتمت مقارنتها بالقوارض ذات العمليات الجراحية الوهمية. تشير النتائج إلى أن المجسات لا تؤثر سلبا على وظيفة الطرف الخلفي والطرف الأمامي الطبيعي للحيوان بعد سبعة أيام من الزرع.
Protocol
Representative Results
Discussion
غالبا ما يتطلب التعديل العصبي والتدخلات العلاجية للحبل الشوكي وضع مجسات في شرائح دقيقة ومستهدفة3،4،7،13. نظرا للحركة المتأصلة في الحبل الشوكي ، يجب تأمين المسبار بشكل موثوق لتمكين الدراسات المزمنة. بناء على التطبيق المحدد ، قد يكون من المهم التحكم فيما إذا كان المسبار على اتصال جسدي بالحبل الشوكي ، أو إذا كان من الممكن تقليل الاتصال لتقليل استجابة الأنسجة الالتهابية عندما يكون ذلك ممكنا. لذلك ، يتم وصف الخطوات الجراحية لكل من الطريقتين. يوضح البروتوكول على وجه التحديد كيفية وضع مسبار في الجزء العنقي من الحبل الشوكي في C5. ومع ذلك ، باستخدام المعلم الموصوف ل T2 أو T10 من الحبل الشوكي ، يمكن وضع المسبار بالمثل في مكان دقيق فوق المنطقة الصدرية أو القطنية عن طريق العد التنازلي للفقرات من T2 أو T10 ، على التوالي ، بمجرد تعرضها. علاوة على ذلك ، لتقليل تلف أنسجة الحبل الشوكي ، قمنا بتأمين جسم الجهاز ، والذي غالبا ما يكون أكبر وأكثر صلابة مقارنة بالمسبار المتصل ، في مساحة تحت الجلد بعيدا عن الحبل الشوكي.
هناك بعض النقاط الحرجة لزرع الجهاز المقترن بالمسبار. أولا ، من الأهمية بمكان تحديد موقع جسم الجهاز قبل تدعيم المسبار. يضمن ذلك تحسين المسافة بين طرف المسبار وجسم الجهاز لتقليل التوتر على المسبار وكذلك تجنب وجود طول إضافي للمسبار ، والذي يمكن أن يتسبب ، على سبيل المثال ، في التواء المسبار أو إزاحته. الهدف الأساسي هو التأكد من أن طول المسبار مشابه للمسافة من المساحة تحت الجلد حيث يتم وضع جسم الجهاز إلى منطقة الحبل الشوكي المستهدفة حيث يتم تثبيت المسبار. من خلال إجراء إجراءات الجراحة النهائية التي يتم فيها اختبار أطوال مسبار مختلفة ، يمكن تحديد الحجم الأمثل للجزء المستهدف.
للحفاظ على العقم ، يجب التعامل مع الجهاز بعناية لمنع ملامسة الطبقة الخارجية من الجلد أثناء الإدخال في الجيب تحت الجلد. يمكن أن يؤدي هذا الاتصال إلى تعريض عقم الجهاز للخطر ، مما قد يؤدي إلى الإصابة بعد الجراحة. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم تقليل مقدار القوة المطبقة على الجهاز عند حمله بالملقط لمنع إتلاف طلاءه ، والذي عادة ما يكون طبقة رقيقة واقية وعازلة ومعقمة20,21. قد تؤدي إزالة الطلاء إلى تقليل عمر الجهاز بشكل كبير عن طريق ، على سبيل المثال ، تقصير الدائرة ، والتسبب في صدمة كهربائية للحيوان ، و / أو إثارة استجابة التهابية في الجسم. قد يساعد التعامل مع الجهاز باستخدام ملقط طرف بلاستيكي في تقليل هذه المضاعفات.
عند خياطة الجهاز إلى الأنسجة الرخوة ، من المهم تجنب خياطة الأنسجة الدهنية تحت الجلد. كما لوحظ في التجارب الأولية ، فإن طبقات الدهون ليست نقطة تثبيت موثوقة للخيوط لأنها عرضة للتمزق. بدلا من ذلك ، تم خياطة جسم الجهاز إلى طبقة عضلية مجاورة في الفضاء تحت الجلد باستخدام خيوط غير قابلة للامتصاص لوضع الجهاز بشكل دائم في الجسم. من ناحية أخرى ، عند تأمين المسبار للعمليات الشائكة ، من المهم التأكد من أن الموقع الذي يتم تأمين المسبار فيه جاف قبل وضع الأسمنت. العظم الرطب / المسبار يطيل وقت المعالجة وقد يؤدي إلى الفشل الكامل للعملية.
هناك بعض الاعتبارات الحاسمة المرتبطة بجهاز قابل للزرع تحتاج إلى معالجة بعناية قبل جراحة الزرع. (1) يجب تغليف الأجزاء النشطة كهربائيا من الجهاز بطبقة تخميل عازلة. قد يتسبب أي حرمان في طبقة التخميل في حدوث عطل وظيفي للجهاز. (2) يجب تعقيم الزرع تماما وفقا لبروتوكول المنشأة. (3) يجب تشكيل الوصلة بين الجهاز والمجسات العصبية أو السيقان التحفيزية بشكل آمن. سيمر الاتصال بضغط ميكانيكي قابل للتكرار بسبب حركات المستمرة. (4) يجب أن تكون المجسات العصبية أو السيقان التحفيزية المرفقة بالجهاز مرنة وقابلة للتمدد بدرجة كافية لتجنب الانجذاب في نقاط مختلفة.
يمكن توسيع البروتوكول الموصوف ليشمل أجهزة الزرع في النماذج الحيوانية ذات الأحجام المختلفة. بعد تحديد المعالم التشريحية ، يمكن تخصيص الطرق الجراحية الموصوفة بشكل منهجي لتأمين أي مجسات عصبية أو سيقان تحفيزية في الأجزاء المستهدفة من الحبل الشوكي وزرع وحدات التحكم المرتبطة بها. ومع ذلك ، اعتمادا على التطبيق ، يمكن أن يكون للأجهزة المختلفة أحجام ومواد وسماكات مختلفة عن تلك المزروعة في هذه الورقة ؛ على سبيل المثال ، تتطلب الأجهزة المتصلة بوحدة تحكم خارجية اعتبارات إضافية. بالإضافة إلى ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه في حين أن هذا البروتوكول مصمم للتحفيز البصري الوراثي ، فإن التطبيقات العصبية الأخرى ، مثل توصيل الدواء أو التحفيز / التسجيل الكهربائي ، تتطلب إجراءات جراحية مختلفة قليلا. على وجه التحديد ، تحتاج هذه التطبيقات إلى زرع تحت الجافية لضمان الاتصال المباشر مع الحبل الشوكي تحت الأم الجافية7. ومع ذلك ، بالنسبة لعلم البصريات الوراثي ، عادة ما يكون الاتصال الحميم بالأنسجة غير ضروري لأن الأم الجافية للقوارض لا تعيق بشكل كبير تغلغل الضوء ، مما يتيح وضع مصادر الضوء فوق الجافية10.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يتم تمويل SS جزئيا من خلال زمالة الدكتوراه لمدة أربع سنوات من جامعة كولومبيا البريطانية. يتم دعم AM جزئيا من خلال منحة الدراسات العليا الكندية – ماجستير من المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR). تعترف D.S. بالتمويل من جائزة مايكل سميث للأبحاث الصحية في كولومبيا البريطانية للباحثين. تم تمويل هذا العمل جزئيا من قبل صندوق الحدود الجديدة في البحوث التابع لحكومة كندا – التحول (NFRFT-2020-00238). تم إنشاء المخطط في الشكل 1 باستخدام Biorender.com ، وتم الحصول على نموذج 3D بإذن من sketchfab.com.
Materials
| Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Alm 3 Point Retractor | Fine Science Tools | 17010-10 | |
| Buprenorphine / Vetergesic | CDMV | 124918 | Manufacturer provides at 0.3 mg/mL but must be diluted to 0.03 mg/kg for use in rats |
| Chlorhexidine 2% Solution | Partnar | PCH-020 | |
| Curved Long Hemostat Forceps | KaamKaaj Tools | 14.5 | Curved Long Hemostat Forceps with A Stainless Steel Ratchet Locking Tweezer |
| CVD Parylene Machine: SCS Labcoter 2 | Specialty Coating Systems | PDS 2010 | |
| Dental Cement – Catalyst | Parkell, Inc | S371 | |
| Dental Cement – Metabond | Parkell, Inc | S398 | |
| Dental Cement – Powder | Parkell, Inc | S396 | |
| Forceps with Replaceable Plastic Tips | Fine Science Tools | 11980-13 | |
| Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
| Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Provided at 5% for induction and 2% for mainentance through precision vaporizer |
| Isopropyl Alcohol 70% | McKesson | 350600 | |
| Lacri-Lube Sterile Eye Ointment | Refresh | ||
| Long Evans Rats | Charles River Laboratories | 6 | |
| Low temperature solder paste | Chip Quik Inc. | 11.38 | |
| Magnets | Radial Magnets, Inc. | 0.53 | Magnet Neodymium Iron Boron (NdFeB) N35 (3.00 mm x 1.00 mm) |
| Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-12 | |
| PDMS: SYLGARD 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
| Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Solder flux | Chip Quik Inc. | 14.25 | |
| Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
| Sterile Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments | KWIK-SIL-S | |
| UV Flashlight | Vansky | 19.99 | |
| Wireless Charger | Nilkin | NKT06 | |
| Wireless Charging coil | TDK Corporation | WT202012-15F2-ID |
References
- Osseward, P. J., Pfaff, S. L. Cell type and circuit modules in the spinal cord. Curr Opin Neurobiol. 56, 175-184 (2019).
- Alilain, W. J., et al. Light-induced rescue of breathing after spinal cord injury. J Neurosci. 28 (46), 11862-11870 (2008).
- Geng, Y., et al. Advances in optogenetics applications for central nervous system injuries. J Neurotrauma. 40 (13-14), 1297-1316 (2023).
- Montgomery, K. L., Iyer, S. M., Christensen, A. J., Deisseroth, K., Delp, S. L. Beyond the brain: Optogenetic control in the spinal cord and peripheral nervous system. Sci Transl Med. 8 (337), 337rv5 (2016).
- Tan, T., Watts, S. W., Davis, R. P. Drug delivery: Enabling technology for drug discovery and development. iPRECIO Micro infusion pump: Programmable, refillable, and implantable. Front Pharmacol. 2, 44 (2011).
- Suehiro, K., et al. Ecto-domain phosphorylation promotes functional recovery from spinal cord injury. Sci Rep. 4 (1), 4972 (2014).
- Harland, B., et al. A subdural bioelectronic implant to record electrical activity from the spinal cord in freely moving rats. Adv Sci (Weinh). 9 (20), 2105913 (2022).
- Wang, Y., et al. Flexible and fully implantable upconversion device for wireless optogenetic stimulation of the spinal cord in behaving animals. Nanoscale. 12 (4), 2406-2414 (2020).
- Grajales-Reyes, J. G., et al. Surgical implantation of wireless, battery-free optoelectronic epidural implants for optogenetic manipulation of spinal cord circuits in mice. Nat Protoc. 16 (6), 3072-3088 (2021).
- Kathe, C., et al. Wireless closed-loop optogenetics across the entire dorsoventral spinal cord in mice. Nat Biotechnol. 40 (2), 198-208 (2022).
- Hogan, M. K., et al. A wireless spinal stimulation system for ventral activation of the rat cervical spinal cord. Sci Rep. 11 (1), 14900 (2021).
- Lu, C., et al. Flexible and stretchable nanowire-coated fibers for optoelectronic probing of spinal cord circuits. Sci Adv. 3 (3), e1600955 (2017).
- Chen, Y., et al. How is flexible electronics advancing neuroscience research. Biomaterials. 268, 120559 (2021).
- Keomani, E., et al. A murine model of cervical spinal cord injury to study post-lesional respiratory neuroplasticity. J Vis Exp. (87), e51235 (2014).
- Chaterji, S., Barik, A., Sathyamurthy, A. Intraspinal injection of adeno-associated viruses into the adult mouse spinal cord. STAR Protoc. 2 (3), 100786 (2021).
- Agrawal, D. R., et al. Conformal phased surfaces for wireless powering of bioelectronic microdevices. Nat Biomed Eng. 1 (3), 0043 (2017).
- Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proc Natl Acad Sci. 113 (50), E8169-E8177 (2016).
- Manoufali, M., Bialkowski, K., Mohammed, B., Abbosh, A. Wireless power link based on inductive coupling for brain implantable medical devices. IEEE Antennas and Wirel Propaga Lett. 17 (1), 160-163 (2018).
- Martinez, M., Brezun, J. M., Bonnier, L., Xerri, C. A new rating scale for open-field evaluation of behavioral recovery after cervical spinal cord injury in rats. J Neurotrauma. 26 (7), 1043-1053 (2009).
- Yang, Y., et al. Preparation and use of wireless reprogrammable multilateral optogenetic devices for behavioral neuroscience. Nat Protoc. 17 (4), 1073-1096 (2022).
- Yang, Y., et al. Wireless multilateral devices for optogenetic studies of individual and social behaviors. Nat Neurosci. 24 (7), 1035-1045 (2021).
.