このプロトコルは、脊髄手術を行うための外科的手順と、げっ歯類の脊髄上に光学シャンクを移植して固定するための外科的手順を詳述しています。
ニューロモデュレーションは、診断、調節、および治療のアプリケーションを提供できます。脳では広範な研究が行われてきましたが、脊髄の調節は比較的未解明のままです。本質的に繊細で可動性のある脊髄組織は、神経プローブの正確な移植を困難にする制約を課しています。近年、ニューロモデュレーションデバイス、特にフレキシブルバイオエレクトロニクスの進歩にもかかわらず、デバイス埋め込みの外科的複雑さにより、脊髄での使用を拡大する機会は限られています。ここでは、げっ歯類の脊髄とインターフェースするカスタムメイドの光電子デバイスの移植用に特別に調整された一連の外科的プロトコルを提供します。ここでは、2つの異なる外科的移植方法を使用して、脊髄の特定のセグメントに光学シャンクを配置して固定する手順について詳しく説明します。これらの方法は、光刺激のために脊髄との直接接触が必要な場合とそうでない場合がある、さまざまなデバイスやアプリケーション向けに最適化されています。方法論を解明するために、皮膚を切開する前に、まず脊椎の解剖学的構造を参照して目立つランドマークを特定します。げっ歯類の頸椎に光学シャンクを固定するための外科的手順が実証されています。次に、光学シャンクに接続されたオプトエレクトロニクスデバイスを脊髄から離れた皮下空間に固定し、不必要な直接接触を最小限に抑えるための手順が概説されます。インプラントを受けた動物と偽手術を受けた動物を比較した行動研究では、インプラント後7日で光学シャンクが後肢または前肢の機能に悪影響を及ぼさなかったことが示されています。本研究は、さまざまな脊髄インターベンションの調査を目的とした将来の研究で使用するための神経調節ツールキットを広げます。
脊髄は、運動行動の調整から呼吸などの恒常性プロセスの調節まで、さまざまな重要な中枢神経系機能を促進します1,2。脊髄を横切る回路の高度なネットワークの役割を解明するには、電気刺激、記録、薬物送達、または標的領域3,4,5,6への光刺激のいずれであっても、インターフェースが必要です。このような尋問7,8,9,10,11を可能にする装置が開発されているが、脊髄4への慢性的な移植には特殊な外科的技術が必要である。特に、脊髄および関連する椎骨は、伸展および曲げなどの自然な動きによって引き起こされる機械的変形に対する感受性が増している8,12,13。脊髄のこれらのユニークな特性により、埋め込まれたプローブが長期間にわたって特定のセグメントで安定し、機能し、固定されたままであることを保証することは本質的に困難になります。
本明細書では、脊髄の標的セグメントに光学シャンクを挿入し固定するための外科的プロトコルが記載されている(図1A)。特に頸部とのインターフェースは独自の課題をもたらすことが示されているため9、移植手順はC5頸部領域で具体的に実証されています。頸椎の複雑さは、そのより深い位置と豊富な筋肉組織から生じると仮定されています。この特性は、脊髄の残りの部分に沿ってそれほど目立たないものです。いずれにせよ、このプロトコルで概説されている手順は、さまざまな脊髄領域にわたる手術に適応できるように設計されています。皮膚の上から識別可能な顕著な解剖学的「ランドマーク」を使用して脊髄セグメントを位置特定および識別するための段階的な指示が提供されています(図1B)。次に、このプロトコルでは、外科的移植のための2つの技術を解明します:1つは脊髄との直接接触を必要とするプローブ用に調整され、もう1つは直接接触を必要としないプローブ用に調整されます。記載されている手順は、げっ歯類の生存手術の訓練を受けた研究者なら誰でも再現できるように設計されています。
このプロトコルには、C5 頸部レベルにフレキシブル光学シャンクが取り付けられたオプトエレクトロニクス デバイス (18 mm x 13 mm) を埋め込むための段階的な手順が含まれています。埋め込み型デバイスは、C5の尾側に皮下固定され、脊髄の光刺激が発生すると点灯するマイクロスケールの発光ダイオード(μLED)インジケーターで構成されており、デバイスの機能のライブフィードバックを提供します。埋め込まれた光学シャンクが自然な運動機能に及ぼす影響は、インプラントを受けたげっ歯類で評価され、偽の手術を受けたげっ歯類と比較されました。結果は、プローブが着床後7日で動物の自然な後肢および前肢の機能に悪影響を及ぼさないことを示しています。
脊髄の神経調節および治療的介入は、しばしば、精密で標的を絞ったセグメント3,4,7,13にプローブを配置する必要がある。脊髄の固有の可動性を考えると、慢性的な研究を可能にするためには、プローブを確実に固定する必要があります。特定のアプリケーションに基づいて、プローブが脊髄と物理的に接触しているかどうか、または可能であれば接触を減らして炎症組織の反応を軽減できるかどうかを制御することが重要になる場合があります。したがって、2つの方法のそれぞれについての外科的ステップが説明される。このプロトコルでは、C5の脊髄の頸部にプローブを配置する方法を具体的に詳しく説明しています。それにもかかわらず、脊髄のT2またはT10について記載されたランドマークを使用して、プローブは、椎骨が露出した後、それぞれT2またはT10からカウントダウンすることにより、胸部または腰部上の正確な位置に同様に配置することができる。さらに、脊髄組織の損傷を最小限に抑えるために、接続されたプローブに比べて大きくて硬いことが多いデバイス本体を、脊髄から離れた皮下空間に固定しました。
プローブと結合されたデバイスを埋め込むには、いくつかの重要なポイントがあります。まず、プローブをセメントで固定する前に、デバイス本体の位置を決定することが重要です。これにより、プローブの先端とデバイス本体の間の距離が最適化され、プローブの張力が軽減されるだけでなく、プローブのねじれや変位などを引き起こす可能性のある余分なプローブの長さを回避できます。基本的に、目標は、プローブの長さが、デバイス本体が配置されている皮下空間からプローブがセメントで固定されている標的の脊髄領域までの距離とほぼ同じであることを確認することです。さまざまなプローブの長さを試験する末期外科手術を行うことで、対象部位に最適なサイズを決定することができます。
無菌性を維持するために、皮下ポケットへの挿入中に皮膚の外層に接触しないように、デバイスを慎重に取り扱う必要があります。.このような接触は、デバイスの無菌性を損ない、術後感染につながる可能性があります。さらに、鉗子でデバイスを保持するときにデバイスに加えられる力の量を最小限に抑えることが重要であり、これは通常、薄い保護層、絶縁性、および滅菌層であるコーティングの損傷を防ぐために20,21。コーティングを剥がすと、回路が短くなったり、動物に電気ショックを引き起こしたり、体内で炎症反応を引き起こしたりするなど、デバイスの寿命が大幅に短くなる可能性があります。プラスチック製の先端鉗子でデバイスを扱うと、このような合併症を減らすのに役立つ場合があります。
デバイスを軟部組織に縫合する場合、皮下脂肪組織への縫合を避けることが重要です。予備試験で観察されたように、脂肪層は破裂しやすいため、縫合糸の信頼できる固定点ではありません。代わりに、デバイス本体は、非吸収性縫合糸を使用して皮下腔の隣接する筋肉層に縫合され、デバイスを体内に恒久的に配置されました。一方、プローブを棘突起に固定する場合は、セメントを塗布する前に、プローブを固定する場所が乾燥していることを確認することが重要です。骨やプローブが濡れていると硬化時間が長くなり、プロセスが完全に失敗する可能性があります。
埋め込み型デバイスには、埋め込み手術の前に慎重に対処する必要があるいくつかの重要な考慮事項があります。(1)デバイスの電気的に活性な部分は、絶縁パッシベーション層によってカプセル化されなければなりません。パッシベーション層の剥奪は、デバイスの機能障害を引き起こす可能性があります。(2)埋め込み型は、施設の動物プロトコルに従って徹底的に滅菌する必要があります。(3)デバイスと神経プローブまたは刺激シャンクとの間の接合部は、確実に形成されなければなりません。接続は、絶え間ない動物の動きによる反復可能な機械的ストレスを受けます。(4)デバイスに取り付けられた神経プローブまたは刺激シャンクは、さまざまなポイントでスナップしないように十分に柔軟で伸縮性がある必要があります。
記載されたプロトコルは、異なるサイズの動物モデルにデバイスを埋め込むために拡張されてもよい。解剖学的ランドマークを特定した後、記載された外科的方法は、脊髄の標的セグメントで任意の神経プローブまたは刺激シャンクを固定し、それらに関連する制御モジュールを埋め込むように系統的にカスタマイズすることができる。ただし、アプリケーションによっては、このペーパーに埋め込まれたものとは異なるサイズ、材料、および厚さを持つデバイスが異なる場合があります。たとえば、外部制御モジュールに接続されたデバイスには、追加の考慮事項が必要です。さらに、このプロトコルは光遺伝学的刺激用に調整されていますが、薬物送達や電気刺激/記録などの他の神経調節アプリケーションには、わずかに異なる外科的手順が必要であることに注意する必要があります。具体的には、これらのアプリケーションでは、硬膜下の脊髄との直接接触を確保するために硬膜下移植が必要です7.しかし、光遺伝学の場合、げっ歯類の硬膜は光の透過を著しく妨げず、光源を硬膜外に配置することができるため、組織との密接な接触は通常不要である10。
The authors have nothing to disclose.
S.S.は、ブリティッシュコロンビア大学の4年間の博士課程フェローシップによって部分的に資金提供されています。AMは、カナダ保健研究所(CIHR)のカナダ大学院奨学金-修士号によって部分的にサポートされています。D.S.は、Michael Smith Health Research British Columbia Scholar Awardからの資金提供を認めています。この研究は、カナダ政府のNew Frontiers in Research Fund – Transformation(NFRFT-2020-00238)から一部資金提供を受けました。 図 1 の回路図は Biorender.com を使用して生成し、3D モデルは sketchfab.com の許可を得て取得しました。
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
Alm 3 Point Retractor | Fine Science Tools | 17010-10 | |
Buprenorphine / Vetergesic | CDMV | 124918 | Manufacturer provides at 0.3 mg/mL but must be diluted to 0.03 mg/kg for use in rats |
Chlorhexidine 2% Solution | Partnar | PCH-020 | |
Curved Long Hemostat Forceps | KaamKaaj Tools | 14.5 | Curved Long Hemostat Forceps with A Stainless Steel Ratchet Locking Tweezer |
CVD Parylene Machine: SCS Labcoter 2 | Specialty Coating Systems | PDS 2010 | |
Dental Cement – Catalyst | Parkell, Inc | S371 | |
Dental Cement – Metabond | Parkell, Inc | S398 | |
Dental Cement – Powder | Parkell, Inc | S396 | |
Forceps with Replaceable Plastic Tips | Fine Science Tools | 11980-13 | |
Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Provided at 5% for induction and 2% for mainentance through precision vaporizer |
Isopropyl Alcohol 70% | McKesson | 350600 | |
Lacri-Lube Sterile Eye Ointment | Refresh | ||
Long Evans Rats | Charles River Laboratories | 6 | |
Low temperature solder paste | Chip Quik Inc. | 11.38 | |
Magnets | Radial Magnets, Inc. | 0.53 | Magnet Neodymium Iron Boron (NdFeB) N35 (3.00 mm x 1.00 mm) |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-12 | |
PDMS: SYLGARD 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Solder flux | Chip Quik Inc. | 14.25 | |
Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
Sterile Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments | KWIK-SIL-S | |
UV Flashlight | Vansky | 19.99 | |
Wireless Charger | Nilkin | NKT06 | |
Wireless Charging coil | TDK Corporation | WT202012-15F2-ID |
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