Dieses Protokoll beschreibt ein chirurgisches Verfahren zur Durchführung einer Rückenmarksoperation und zur Implantation und Befestigung eines optischen Schaftes über dem Rückenmark bei Nagetieren.
Die Neuromodulation kann diagnostische, modulatorische und therapeutische Anwendungen bieten. Während umfangreiche Arbeiten im Gehirn durchgeführt wurden, ist die Modulation des Rückenmarks noch relativ unerforscht. Das von Natur aus empfindliche und bewegliche Rückenmarksgewebe stellt Einschränkungen dar, die die präzise Implantation von neuralen Sonden zu einer Herausforderung machen. Trotz der jüngsten Fortschritte bei Neuromodulationsgeräten, insbesondere bei der flexiblen Bioelektronik, sind die Möglichkeiten, ihren Einsatz im Rückenmark zu erweitern, durch die chirurgische Komplexität der Geräteimplantation begrenzt. Hier bieten wir eine Reihe von chirurgischen Protokollen an, die speziell auf die Implantation eines maßgeschneiderten optoelektronischen Geräts zugeschnitten sind, das bei Nagetieren mit dem Rückenmark verbunden ist. Die Schritte zum Platzieren und Verankern eines optischen Schaftes auf einem bestimmten Segment des Rückenmarks über zwei verschiedene chirurgische Implantationsmethoden werden hier detailliert beschrieben. Diese Methoden sind für eine Vielzahl von Geräten und Anwendungen optimiert, die für die optische Stimulation einen direkten Kontakt mit dem Rückenmark erfordern können oder auch nicht. Um die Methodik zu verdeutlichen, wird zunächst die Wirbelanatomie referenziert, um markante Orientierungspunkte zu identifizieren, bevor ein Hautschnitt vorgenommen wird. Es werden die chirurgischen Schritte zur Sicherung eines optischen Schaftes über der Halswirbelsäule bei Nagetieren demonstriert. Anschließend werden Verfahren zur Befestigung des optoelektronischen Geräts, das mit dem optischen Schaft verbunden ist, in einem subkutanen Raum vom Rückenmark entfernt beschrieben, wodurch unnötiger direkter Kontakt minimiert wird. Verhaltensstudien, in denen Tiere, die die Implantate erhielten, mit denen verglichen wurden, die sich einer Scheinoperation unterzogen wurden, deuten darauf hin, dass die optischen Schäfte die Funktion der Hinter- oder Vordergliedmaßen sieben Tage nach der Implantation nicht negativ beeinflussten. Die vorliegende Arbeit erweitert das Instrumentarium der Neuromodulation für den Einsatz in zukünftigen Studien, die darauf abzielen, verschiedene Interventionen des Rückenmarks zu untersuchen.
Das Rückenmark ermöglicht eine Reihe von wesentlichen Funktionen des zentralen Nervensystems, von der Koordination motorischer Verhaltensweisen bis hin zur Regulierung homöostatischer Prozesse wie der Atmung 1,2. Um die Rolle des ausgeklügelten Schaltkreisnetzwerks im gesamten Rückenmark aufzuklären, sind Schnittstellen erforderlich, sei es für die elektrische Stimulation, die Aufzeichnung, die Verabreichung von Medikamenten oder die optische Stimulation von Zielbereichen 3,4,5,6. Obwohl Vorrichtungen entwickelt wurden, um solche Befragungen zu ermöglichen 7,8,9,10,11, sind für ihre chronische Implantation in das Rückenmark spezielle chirurgische Techniken erforderlich 4. Insbesondere das Rückenmark und die zugehörigen Wirbel weisen eine erhöhte Anfälligkeit für mechanische Verformungen auf, die durch natürliche Bewegungen wie Streckung und Beugung verursacht werden 8,12,13. Diese einzigartigen Eigenschaften des Rückenmarks machen es zu einer intrinsischen Herausforderung, sicherzustellen, dass die implantierten Sonden über längere Zeiträume stabil, funktionsfähig und in einem bestimmten Segment gesichert bleiben.
Darin wird ein chirurgisches Protokoll zum Einsetzen und Fixieren eines optischen Schaftes in einem Zielsegment des Rückenmarks beschrieben (Abbildung 1A). Da sich gezeigt hat, dass insbesondere die Schnittstelle zum zervikalen Bereich einzigartige Herausforderungen mit sich bringt9, werden die Implantationsschritte speziell im zervikalen Bereich des C5 demonstriert. Es wird postuliert, dass die Komplexität der Halswirbelsäule aus ihrer tieferen Positionierung und dem Reichtum an Muskulatur entsteht, eine Eigenschaft, die im Rest des Rückenmarks nicht so ausgeprägt ist. Unabhängig davon sind die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren so konzipiert, dass sie für Operationen in verschiedenen Rückenmarksregionen angepasst werden können. Es werden schrittweise Anweisungen zur Lokalisierung und Identifizierung von Rückenmarkssegmenten unter Verwendung ausgeprägter anatomischer “Orientierungspunkte” gegeben, die über der Haut erkennbar sind (Abbildung 1B). Das Protokoll erläutert dann zwei Techniken für die chirurgische Implantation: eine für Sonden, die einen direkten Kontakt mit dem Rückenmark erfordern, und eine andere für Sonden, die möglicherweise keinen direkten Kontakt benötigen. Die beschriebenen Schritte sind so konzipiert, dass sie von jedem Forscher mit einer Ausbildung in der Überlebenschirurgie von Nagetieren reproduziert werden können.
Dieses Protokoll umfasst eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die Implantation eines optoelektronischen Geräts (18 mm x 13 mm) mit einem angebrachten flexiblen optischen Schaft über der Gebärmutterhalshöhe C5. Das implantierbare Gerät wird subkutan kaudal zu C5 befestigt und besteht aus einem mikroskaligen Leuchtdiodenindikator (μLED), der aufleuchtet, wenn eine optische Stimulation des Rückenmarks stattfindet, und eine Live-Rückmeldung über die Funktionalität des Geräts liefert. Die Wirkung des implantierten optischen Schaftes auf die natürliche Motorik wurde an Nagetieren, die Implantate erhalten hatten, untersucht und mit Nagetieren mit Scheinoperationen verglichen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Sonden die natürliche Funktion der Hinter- und Vordergliedmaßen des Tieres sieben Tage nach der Implantation nicht beeinträchtigen.
Neuromodulation und therapeutische Eingriffe des Rückenmarks erfordern oft die Platzierung von Sonden in präzisen, zielgerichteten Segmenten 3,4,7,13. Aufgrund der inhärenten Beweglichkeit des Rückenmarks muss die Sonde zuverlässig gesichert werden, um chronische Untersuchungen zu ermöglichen. Abhängig von der spezifischen Anwendung kann es wichtig sein zu kontrollieren, ob die Sonde in physischem Kontakt mit dem Rückenmark steht oder ob der Kontakt reduziert werden kann, um die Entzündungsreaktion des Gewebes nach Möglichkeit zu verringern. Daher werden für jede der beiden Methoden chirurgische Schritte beschrieben. Das Protokoll beschreibt genau, wie eine Sonde im zervikalen Segment des Rückenmarks bei C5 platziert wird. Nichtsdestotrotz kann die Sonde unter Verwendung des beschriebenen Orientierungspunkts für T2 oder T10 des Rückenmarks in ähnlicher Weise an einer genauen Stelle über dem Brust- oder Lendenwirbelbereich platziert werden, indem die Wirbel von T2 bzw. T10 heruntergezählt werden, sobald sie freigelegt sind. Um die Schädigung des Rückenmarksgewebes zu minimieren, haben wir den Gerätekörper, der im Vergleich zur angeschlossenen Sonde oft größer und steifer ist, in einem subkutanen Raum vom Rückenmark entfernt befestigt.
Es gibt einige kritische Punkte bei der Implantation des Geräts, das mit der Sonde gekoppelt ist. Zunächst ist es wichtig, sich vor dem Zementieren der Sonde für die Position des Gerätekörpers zu entscheiden. Dadurch wird sichergestellt, dass der Abstand zwischen der Spitze der Sonde und dem Gerätekörper optimiert wird, um die Spannung auf der Sonde zu reduzieren und eine zusätzliche Sondenlänge zu vermeiden, die z. B. zu einer Verdrehung oder Verschiebung der Sonde führen kann. Im Wesentlichen besteht das Ziel darin, sicherzustellen, dass die Länge der Sonde dem Abstand vom subkutanen Raum, in dem der Gerätekörper platziert wird, bis zur Zielregion des Rückenmarks, in der die Sonde zementiert ist, ähnlich ist. Durch die Durchführung terminaler chirurgischer Eingriffe, bei denen verschiedene Sondenlängen getestet werden, kann die optimale Größe für ein Zielsegment bestimmt werden.
Um die Sterilität zu erhalten, sollte das Gerät vorsichtig gehandhabt werden, um einen Kontakt mit der äußeren Hautschicht während des Einführens in die Unterhauttasche zu vermeiden. Ein solcher Kontakt kann die Sterilität des Geräts beeinträchtigen und möglicherweise zu einer postoperativen Infektion führen. Darüber hinaus ist es wichtig, die Kraft, die auf die Vorrichtung ausgeübt wird, zu minimieren, wenn sie mit einer Pinzette gehalten wird, um eine Beschädigung ihrer Beschichtung zu verhindern, bei der es sich typischerweise um eine dünne schützende, isolierende und sterile Schichthandelt 20,21. Das Entfernen der Beschichtung kann die Lebensdauer des Geräts drastisch verkürzen, indem beispielsweise der Stromkreis kurzgeschlossen, das Tier einen elektrischen Schlag versetzt und/oder eine Entzündungsreaktion im Körper hervorgerufen wird. Die Handhabung des Geräts mit einer Pinzette mit Kunststoffspitze kann dazu beitragen, solche Komplikationen zu reduzieren.
Beim Nähen des Geräts an Weichgewebe ist es wichtig, das Nähen an subkutanem Fettgewebe zu vermeiden. Wie in Vorversuchen festgestellt, sind Fettschichten kein zuverlässiger Ankerpunkt für Nähte, da sie anfällig für Risse sind. Stattdessen wurde der Gerätekörper mit einer benachbarten Muskelschicht im Unterhautraum unter Verwendung von nicht resorbierbaren Nähten für die dauerhafte Platzierung der Vorrichtung im Körper vernäht. Andererseits ist es bei der Befestigung der Sonde an den Dornfortsätzen wichtig, sicherzustellen, dass die Stelle, an der die Sonde befestigt wird, trocken ist, bevor der Zement aufgetragen wird. Nasser Knochen/Sonde verlängert die Aushärtungszeit und kann zum vollständigen Versagen des Prozesses führen.
Es gibt einige kritische Überlegungen, die mit einem implantierbaren Gerät verbunden sind und die vor einer Implantationsoperation sorgfältig berücksichtigt werden müssen. (1) Elektrisch aktive Teile des Gerätes müssen durch eine isolierende Passivierungsschicht ummantelt sein. Jede Deprivation in der Passivierungsschicht kann zu Funktionsstörungen des Geräts führen. (2) Das Implantierbare muss gemäß dem Tierprotokoll der Einrichtung gründlich sterilisiert werden. (3) Die Verbindung zwischen dem Gerät und den neuralen Sonden oder den Stimulanzienschäften muss sicher geformt sein. Die Verbindung wird durch ständige Tierbewegungen einer wiederholbaren mechanischen Belastung unterzogen. (4) Die an der Vorrichtung befestigten neuralen Sonden oder stimulierenden Schäfte müssen flexibel und dehnbar genug sein, um ein Einrasten an verschiedenen Stellen zu vermeiden.
Das beschriebene Protokoll kann auf Implantate in Tiermodellen unterschiedlicher Größe ausgeweitet werden. Nach der Identifizierung der anatomischen Orientierungspunkte können die beschriebenen Operationsmethoden methodisch angepasst werden, um beliebige neurale Sonden oder stimulierende Schäfte an bestimmten Segmenten des Rückenmarks zu befestigen und die zugehörigen Kontrollmodule zu implantieren. Je nach Anwendung können verschiedene Geräte jedoch unterschiedliche Größen, Materialien und Dicken aufweisen als das in diesem Papier implantierte. Bei Geräten, die an ein externes Steuergerät angeschlossen sind, sind beispielsweise zusätzliche Überlegungen erforderlich. Darüber hinaus muss beachtet werden, dass dieses Protokoll zwar auf die optogenetische Stimulation zugeschnitten ist, andere neuromodulatorische Anwendungen, wie z. B. die Verabreichung von Medikamenten oder die elektrische Stimulation/Aufzeichnung, jedoch etwas andere chirurgische Verfahren erfordern. Konkret ist für diese Anwendungen eine subdurale Implantation erforderlich, um einen direkten Kontakt mit dem Rückenmark unter der Dura mater7 zu gewährleisten. Für die Optogenetik ist jedoch ein intimer Kontakt mit dem Gewebe in der Regel unnötig, da die Dura mater des Nagetiers den Lichteinfall nicht signifikant behindert, was eine epidurale Platzierung von Lichtquellen ermöglicht10.
The authors have nothing to disclose.
S.S. wird teilweise durch ein vierjähriges Doktorandenstipendium der University of British Columbia finanziert. A.M. wird teilweise durch ein Canada Graduate Scholarship – Master des Canadian Institute of Health Research (CIHR) unterstützt. D.S. dankt für die Finanzierung durch den Michael Smith Health Research British Columbia Scholar Award. Diese Arbeit wurde teilweise durch den New Frontiers in Research Fund – Transformation der kanadischen Regierung (NFRFT-2020-00238) finanziert. Der Schaltplan in Abbildung 1 wurde mit Biorender.com erstellt, und das 3D-Modell wurde mit Genehmigung von sketchfab.com erstellt.
Adson Forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
Alm 3 Point Retractor | Fine Science Tools | 17010-10 | |
Buprenorphine / Vetergesic | CDMV | 124918 | Manufacturer provides at 0.3 mg/mL but must be diluted to 0.03 mg/kg for use in rats |
Chlorhexidine 2% Solution | Partnar | PCH-020 | |
Curved Long Hemostat Forceps | KaamKaaj Tools | 14.5 | Curved Long Hemostat Forceps with A Stainless Steel Ratchet Locking Tweezer |
CVD Parylene Machine: SCS Labcoter 2 | Specialty Coating Systems | PDS 2010 | |
Dental Cement – Catalyst | Parkell, Inc | S371 | |
Dental Cement – Metabond | Parkell, Inc | S398 | |
Dental Cement – Powder | Parkell, Inc | S396 | |
Forceps with Replaceable Plastic Tips | Fine Science Tools | 11980-13 | |
Friedman-Pearson Rongeurs | Fine Science Tools | 16121-14 | |
Isoflurane USP | Fresenius Kabi | CP0406V2 | Provided at 5% for induction and 2% for mainentance through precision vaporizer |
Isopropyl Alcohol 70% | McKesson | 350600 | |
Lacri-Lube Sterile Eye Ointment | Refresh | ||
Long Evans Rats | Charles River Laboratories | 6 | |
Low temperature solder paste | Chip Quik Inc. | 11.38 | |
Magnets | Radial Magnets, Inc. | 0.53 | Magnet Neodymium Iron Boron (NdFeB) N35 (3.00 mm x 1.00 mm) |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-12 | |
PDMS: SYLGARD 184 | Sigma Aldrich | 761036 | |
Scalpel Blades – #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
Scalpel Handle – #3 | Fine Science Tools | 10003-12 | |
Solder flux | Chip Quik Inc. | 14.25 | |
Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | Model 900 | |
Sterile Kwik-Sil Adhesive | World Precision Instruments | KWIK-SIL-S | |
UV Flashlight | Vansky | 19.99 | |
Wireless Charger | Nilkin | NKT06 | |
Wireless Charging coil | TDK Corporation | WT202012-15F2-ID |
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