Summary

薄層クロマトグラフィーによるバイオコントロールのための天然物のバイオアッセイガイド下同定-ダイレクトバイオオートグラフィー

Published: July 26, 2024
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Summary

病原体 Sclerotinia sclerotiorum および生物殺虫 剤Bacillus 分離株をモデルシステムとして使用して、真菌病原体に対して拮抗作用を示す微生物天然物を同定するための薄層クロマトグラフィー、直接バイオオートグラフィーアッセイ、および液体クロマトグラフィー質量分析の使用について説明します。

Abstract

薄層クロマトグラフィーダイレクトバイオオートグラフィー(TLC-DB)は、標的病原体に対して拮抗する天然物(NP)を分離および同定するために使用される、確立されたバイオアッセイです。これは、バイオアッセイガイドによるNPの単離と同定のための迅速で安価でシンプルなオプションであり、TLCによる分離と、標的病原体の直接適用による生物活性の検査にかかっています。通常、生理活性植物抽出物の分析に使用され、細菌、真菌、および酵素に対する阻害活性を検出します。そうは言っても、細菌のNPの発見、特に関連する農業病原体に対する細菌のNPの評価には大きな可能性を秘めており、これは農業業界向けの新しい生物農薬の発見と開発に価値があります。さらに、これは、生理活性化合物の発見と同定に関する研究プログラムにおいて、他の標的病原体またはNPの供給源に適用できる調整可能なプロトコルです。ここでは、TLC-DBを用いて Bacillus spp.および農業病原体 Sclerotinia sclerotiorumを用いて生物農薬NPを発見・同定するためのモデルシステムについて述べる。

Introduction

真菌性の農業病原体は、世界中で作物の品質と収量に大きな損失をもたらし、安定した世界的な食料生産システムの経済的および供給上の課題に貢献しています1,2。病原体の被害は、感染に耐性のある品種を育種し、病原体の増殖を抑制するための輪作や土地管理の実践を含む統合作物管理システムを使用することで防ぐことができる3,4。これらの方法は作物への被害を軽減しますが、化学農薬は一般的に併用して、野外で真菌の生殖構造を積極的に殺し、被害と収量の減少をさらに防ぎます。化学農薬の使用は効果的ではあるが、周囲の生態系へのダメージ、土壌肥沃度の低下、それに伴う人間の健康リスク、病原体耐性の発現など、多くの欠点があり、後者は毎年大量の農薬が必要になる原因となる5,6,7

微生物ベースの害虫および病原体管理製品は、合成農薬の潜在的な代替品または補完物と長い間考えられてきました。1900年代初頭以来、 Bacillus thuringiensis は、種子処理、葉面散布、および直接土壌処理8として、農業害虫や病原体の防除に広く使用されてきました。このような製品は生物農薬と呼ばれ、対象となる害虫や病原体の活力を殺したり、抑制したり、減らしたりできる天然に存在する微生物または生化学物質として特徴付けられています。生物農薬は、さまざまなメカニズムを通じて病原体の増殖を制御することができますが、最も一般的には二次代謝産物の分泌によって制御されます9。二次代謝産物は、しばしば天然物と呼ばれ、一次代謝に関与していませんが、他の微生物に打ち勝つための進化上の利点として産生されます10

生物農薬は、合成農薬に比べて多くの利点があります。それらは、合成害虫管理製品9,10と比較して、環境、動物相、および人間への毒性リスクが低い。ほとんどの生物農薬は何千年もの間環境中に自然に存在してきたため、微生物代謝産物の生分解経路は環境中に存在し、土壌や生態系の汚染の可能性を制限し、合成農薬が環境を破壊する原因となる滞留時間を短縮します11。さらに、病原体感染を緩和するために使用される多くの生物農薬も植物の成長促進特性を示し、栄養素のバイオアベイラビリティを高め、植物の全身耐性を誘導する可能性があります12

最も一般的には、生物農薬は微生物接種物の形で適用され、NPはin situ12,13の生きた微生物によって分泌されます。このような場合、生物農薬の活性源を特定することは大きな価値があります。そうすることで、生物農薬の作用機序についての洞察が得られ、特許を持つ微生物の保護のケースを構築するのに役立ち、その構造が新規である場合には、科学的な大きな影響を与えることができます。しかし、最も重要なことは、生物活性源の同定が、下流の生物農薬製品の製剤化の可能性を知らせることです。NP自体が活性化すれば、微生物を大規模な生物農薬生産のための生体分子工場として利用することができます。さらに、生物的防除のために研究されている多くのNPは、人間の医療にも応用できる可能性があり、経済的にさらに価値があります8

薄層クロマトグラフィーダイレクトバイオオートグラフィー(TLC-DB)アッセイは、バイオペストリクティカル代謝物のバイオ活性ガイドによる単離と同定のための安価で簡単な方法です。この技術は、植物化学物質の生物活性試験を粗植物抽出物から分離するために一般的に使用されていますが、微生物抽出物の分析にも大きな可能性を秘めています14。TLCは、粗微生物抽出物中のNPを迅速かつ安価に分離し、培地病原体懸濁液でコーティングした後、活性代謝物を含むゾーンを容易に可視化することができます。これらのゾーンをプレートから掻き取り、超高速液体クロマトグラフィーと質量分析(UPLC-MS)を組み合わせて化学分析を行い、既知の代謝物を同定することができます。以前に報告された化合物と一致しない代謝物は、液体クロマトグラフィー を介して 大量に分離し、核磁気共鳴分光法やX線結晶構造解析などの技術を用いた構造解明研究を受けることができる15

本稿では、TLC-DBと Bacillus spp.および農業病原体 Sclerotinia sclerotiorumを用いて、生物農薬NPを発見・同定するためのモデルシステムについて述べる。 図 1 は、TLC-DB 手順の概略図を示しています。

Figure 1
図1:TLC-DBの手順のステップ4〜7の概略図概要この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Protocol

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。 1. 微生物バイオコントロール候補の選定 コンペティションプレートアッセイを使用して、目的の病原体に対して拮抗作用を示す微生物分離株を選択します。注:このプロトコルを実証するために、S. sclerotiorumに対して拮抗作用を示した9つのBacillus分離株が選択されました。これには、Bacillus atrophaeus、mojavensis、およびsubtilis種が含まれます。 2. 培地の準備 ジャガイモデキストロース寒天(PDA)を、水1リットルあたり39gの培地を溶解して調製します。 水1リットルあたり45gの培地を加えて、シュードモナスF寒天培地を調製します。 24 gの培地と水1リットルあたり0.24 gの寒天を加えて、1%寒天でジャガイモデキストロースブロス(PDB)を準備します。 酵母-グルコース-マンガン(YGM)ブロスを準備します。100mLの水に2.5gのKH2PO4と2.5gのK2HPO4からなる緩衝液と、0.58gのMnSO4からなる塩溶液を作成します。H20、0.5 gのNaClおよび0.05 gのFeSO4.7H 20を100 mLの水に。次に、酵母抽出物1g、デキストロース1.25g、水400mL、緩衝液5mL、塩溶液5mL、水90mLを加えて、金属塩が溶液中に沈殿しないようにします。 培地をオートクレーブ滅菌し、寒天を100 x 15 mmのペトリプレートに注ぎ、室温まで冷ましてから使用します。 3.病原体の準備 Sclerotinia sclerotiorumの5プレートをPDA(ステップ2.1で調製)で培養し、25°Cで3日間インキュベートします。 4.天然物抽出物の準備 各細菌分離株をPseudomonas F Agar(ステップ2.2で調製)で培養し、個々のコロニーが観察されるまで増殖します。 単一細菌コロニーを遠心分離機または培養チューブで25 mLのYGM培地に継代培養し、3日間振とうしながらインキュベートします。 各抽出物の5 mLのアリコートを1 LのYGMに移し、同じ条件でさらに3日間インキュベートします。 各培養物を3000 x g で15分間、25°Cで遠心分離し、細胞をペレット化します。 上清をデカントし、酢酸エチルで3回洗浄して、培地から代謝物を抽出します。 それぞれの酢酸エチル層をロータリーエバポレーションで組み合わせて乾燥させます。 抽出物を最小限のメタノールに再溶解し、小さなシンチレーションバイアルに移し、ロータリーエポベーションによって再度乾燥させます。注:抽出物が乾燥して油性または樹脂性の材料になる場合は、材料を凍結乾燥して、正確に計量できる乾燥粉末を得てください。 5. TLCプレートの準備 20cm×20cmのTLCプレートは、プレートの下から2cm、上から2cmのところに線を引いて準備します。一番下の行に、2cm間隔で9つのドットを配置します。一番上の線の上に、4つのドットを4cm離して配置します。 各抽出物5 mgを15 μLのメタノールに溶解し、ピペットを使用して、下部の行にマークされた9つのドットに各抽出物5 μLを塗布します。各抽出物をTLCプレート上でスポット乾燥させ、同じスポットにさらに5μLのアリコートを塗布します。すべての材料がTLCプレートにロードされるまで繰り返します。 ジクロロメタンとメタノールの1:2溶液を使用して、液溶媒がプレートの上部から2cmの線に達するまで(約45分)、現像タンクでTLCプレートを現像します。 開発が完了したら、TLCプレートを取り外し、溶媒ラインの上にマークされた4つのドットに一連のポジティブコントロールを適用します。同じコントロールの4つの濃度が使用されます。 S. scl.の場合、 0.5 μg/mL、5 μg/mL、50 μg/mL、および500 μg/mLのハイグロマイシンBがポジティブコントロールです。 プレートからすべての溶媒が蒸発する前に、エタノール滅菌したTLCプレートボックスに入れます。 6. ダイレクトバイオオートグラフィーアッセイ アッセイで使用する材料(クロマトグラフィー噴霧器のガラス部品、金属ヘラ、ペーパータオル4枚、セルロースまたはフィルターペーパー、水、メディア)を、ティンフォイルで覆われた大きなビーカーでオートクレーブします。注:紙の材料(ペーパータオル、セルロース紙)は、オートクレーブで濡れないように錫箔で包む必要があります。 エタノール滅菌PTFEチューブを使用して、空気源、圧力計、クロマトグラフィー噴霧器を接続します。クロマトグラフィー噴霧器と圧力計の間にHEPAフィルターを接続します。 滅菌金属ヘラを使用して5つの病原体プレートの菌糸体マットを滅菌スパチュラを使用して50mLの遠心分離チューブに収集します。注:必要に応じて、菌糸体を取り除くために少量の液体ブロスを使用し、滅菌ピペットで移します。 寒天と滅菌ガラスビーズで修正した25 mLのPDBを50 mLの遠心分離チューブに加え、5分間ボルテックスして菌糸体マットを破砕します。 菌糸体懸濁液を針先付きの滅菌シリンジを使用してクロマトグラフィー噴霧器に移し、大きな菌糸体がクロマトグラフィー噴霧器を詰まらせないようにします。 以前に開発したTLCプレートを層流フードの滅菌ペーパータオルに置き、メディア懸濁液を塗布しながらプレートとの手の接触を減らします。 空気圧を約4バールに上げ、サスペンションをTLCプレートに3回塗布して、塗布の合間にプレートを完全に乾燥させます。注:3つの層が最適な量であることがわかりました。これより少ないと、病原体は成長するための十分な培地を持っていません。それ以上に、培地が厚すぎるため、病原体が活性代謝物と接触できない場合があります。 滅菌したプラスチックプレートボックスに滅菌水500mLを入れ、滅菌した折り畳みセルロースシートまたは濾紙を両側に置き、水分を保持します。 完成したアッセイプレートを、箱の中の4つの空のシャーレに置きます。 アッセイを3日間から1週間、または菌糸体の均一な層がポジティブコントロールと阻害ゾーン(ZOI)の周囲を除いてTLCプレート全体に均一に成長するまでインキュベートします。 7. 液体クロマトグラフィー質量分析 写真を使用して、完成したアッセイを画像化します。 下部のラインからZOIまでの距離を下部のラインから上部のラインまでの距離で割ることにより、各抑制ゾーンの保持係数を計算します。 シリカを阻害ゾーンからこすり落とし、微量遠心チューブに入れます。 各チューブとボルテックスに500μLのメタノールを加えて、シリカから代謝物を抽出します。 8,500 x g 、20°Cで10分間遠心分離し、上清を小さなバイアルに移します。 ロータリーエポベーションまたは窒素の流れの下で蒸発して乾燥させます。 抽出物をLCバイアル中の50 μLのメタノールに再懸濁します。 LC-MSによる阻害ゾーンの代謝物を分析し、それらを粗抽出物中の代謝物と比較して、粗抽出物中のどの代謝物が病原体の阻害に関与しているかを決定します16。 発生源微生物の属と種、およびZOIで同定された質量を用いて、AntibaseやDictionary of Natural Productsなどの文献や関連データベースを検索し、代謝物を特定します。

Representative Results

TLCによる微生物抽出物の分離時には、代謝物をTLCプレートに沿って垂直に分散させる必要があります。可視光線下では、可視光域で吸収されない代謝物を見るのが難しい場合があります。したがって、UV光下でのイメージングは、 図2A、Bに見られるように、代謝物の分離を見るのに役立ちます。 インキュベーション期間後、病原体は、 図2Cに示されているように、ポジティブコントロールと活性代謝物が存在する阻害ゾーンを除いて、プレート全体にわたって均一に成長しているように見えるはずです。 図2:TLCによる微生物抽出物の分離 (A)可視光下で画像化された9種類の バチルス 抽出物を含むTLCプレートを開発し、(B)真菌接種物の適用前に320nmのUV光下で画像化。(C)プレート全体で病原体の成長が観察されたバイオオートグラフィーアッセイの完了。ただし、ポジティブコントロールの周囲で成長が阻害されている場所、および各抽出物のZOIを除く。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 阻害ゾーンから抽出された代謝物をLC-MSで分析し、粗抽出物と比較することで、病原体に対する拮抗作用の原因となるNPを決定します。一致する代謝物は、一致と見なされるには、保持時間および分子イオン種が同じである必要があります。活性代謝物が同定されたら、細菌培養物を大量に増殖させて、構造化学や生物学的研究に関心のある活性代謝物を分離することができます。

Discussion

TLC-DBは、価値があり、定評のあるNP研究ツールであり、マイクロプレートバイオアッセイガイド下単離法のシンプルで安価な代替手段です17。液体クロマトグラフィー技術を用いた代謝物分離を必要とするマイクロプレートアッセイと比較して、必要な時間と材料リソースは最小限です。これは、酵素阻害剤181920212223に加えて、抗菌、抗真菌、抗寄生虫、および抗酸化NPを検出するために使用できる非常に汎用性の高いアッセイです。生理活性植物化学物質の検出と同定に最も一般的に使用されますが、このプロトコル18で検討されているのと同じ方法を細菌のNPにも適用できます。さらに、このプロトコルは、さまざまなNPソースおよび標的病原体との使用に最適化して、新規の生理活性NPの発見と評価に役立てることができます。

細菌の増殖に使用される培地や抽出に使用される溶媒は、天然物の発見結果に大きな影響を与える可能性があります。このプロトコールで使用される培地は、 シュードモナス(Pseudomonas )や バチルス属(Bacillus spp)などの環状リポペプチドを産生する細菌に最適化されていますしかし、他の属を探索する場合は、他の培地と栄養源を考慮する必要があります。1つの分離株からの代謝物の多様性の全範囲を評価するために、さまざまな培地で成長した同じ微生物を使用してTLC-DBを完成させることも、より広い範囲の分離株に対して同一の増殖条件を使用することを選択することもできます。抽出溶媒の選択は、検出される天然物にも影響します。一般に、ほとんどの生理活性NPは極性が低いから中程度であることが理解されており、酢酸エチルは沸点が低く、除去が容易であるため、適切な選択肢となっています。ただし、極性画分と非極性画分も調べたい場合は、他の溶媒で複数回抽出できます。あるいは、無細胞抽出物を凍結乾燥してアッセイで使用し、培地に放出されたすべての代謝物を確認することもできます。ただし、凍結乾燥材料中の乾燥培地成分を考慮するために、TLCプレートにより多くの材料を充填する必要があることがよくあります。同様に、この分析法を接種菌などの異なる病原体で使用する場合、TLC-DBアッセイに使用する菌糸体の5つの寒天プレートを得るためには、使用する培地とインキュベーション条件を最適化する必要があります。

TLC-DBは、寒天および接種物の最も薄い層を使用し、寒天層への代謝産物の拡散への依存を最小限に抑え、少量の天然物が病原体阻害を誘導することを可能にするため、接触および浸漬バイオオートグラフィーと比較して有利です17。TLCバイオオートグラフィック法を用いた以前に発表された知見は、アッセイを完了するために病原体の胞子懸濁液を用いている17。これにより、懸濁液濃度の精密な制御が可能になるが、特定の真菌24の胞子形成を誘導することは非常に困難で時間がかかる場合がある。この変更により、アッセイが大幅に簡素化され、胞子形成が困難で、以前はこの方法では避けられていた可能性のある真菌性病原体を使用してアッセイを完了することができます。

アッセイで使用される細菌抽出物の質量は、結果に影響を与える可能性があります。TLCプレートに塗布する抽出物が少なすぎると、活性化合物の最小阻害濃度を超えず、生理活性が検出されない可能性があります。その結果、 場合によっては、図1図2に見られるように、TLCプレートに過負荷をかけ、活性を容易に検出する能力のために分離を損なうことは価値があります。同様に、プレートに噴霧される病原体負荷は、病原体の成長をサポートするのに十分な培地が適用されないため、低すぎてはなりません。この方法は、さまざまな細菌抽出物や病原体に対応するように簡単に調整でき、プロトコルで概説されている微生物抽出物と接種物の量により、複数の病原体や微生物抽出物の生理活性を検出できます。アッセイの完了時に阻害ゾーンが観察されない場合は、次のいずれかを示している可能性があります。.まず、細菌の増殖に不適合な培地が使用されているか、または細菌の活性がNP産生の結果ではないために、適用された抽出物に活性代謝物が存在しない可能性があります。抽出物を用いた椎間板拡散アッセイを完了して、抽出物中の活性NPの存在を確認または否定することができます。ディスク拡散アッセイで病原体の抑制が示されない場合は、他の培地を試験して、他の条件で生理活性NPが産生されるかどうかを判断できます。ディスク拡散アッセイが抽出物が病原体を抑制することを示した場合、より大きな質量の細菌抽出物をTLCプレートに適用する必要があるかもしれません。

ZOI中の代謝物と粗抽出物の比較は、活性NPの同定に不可欠です。このアッセイでは、粗抽出物からの代謝物を病原体によって代謝または修飾することができ、LC-MSを介して観察することができます。したがって、粗抽出物とZOIの両方に存在する代謝産物のみが、研究対象の細菌によって産生されるNPと見なすことができます。ZOIから抽出された代謝物を粗抽出物中の代謝物と相関させることができない場合は、ステップ5で説明したようにTLCプレートを調製できます。バイオオートグラフィーアッセイを完了せずに、完了したアッセイで観察されたのと同じ保持時間でTLCプレートから代謝物を抽出します。これにより、ZOI中の代謝物と粗抽出物との間の相関が容易になり、病原体の抑制が引き起こされるはずです。

TLC-DBの欠点の1つは、TLCの分離が、分離に液体クロマトグラフィーを必要とする従来のマイクロウェルスクリーニング技術を使用した場合よりも大幅に低いことです。したがって、複数の代謝物が阻害領域に存在するのが一般的であり、一部の代謝産物が生物活性に寄与していない可能性があります。この問題は、生物活性をより明確に観察するためにTLCプレートを過負荷にする慣行によってさらに引き起こされる可能性があります。最近の研究は、高性能TLC(HP-TLC)を使用して発表されており、これにより解像度が大幅に向上し、従来のTLC14,21,22,23では不可能だったTLC開発の自動化が可能になります。また、プレートを2次元(2D-TLC)で開発して、同様の保持時間で代謝物をさらに分離することもできます。そうは言っても、時間と材料費の増加が、HPおよび2D-TLC25から得られる解像度の向上にとって価値のある妥協点であるかどうかを評価する必要があります。

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

私たちは、この研究を可能にした資金を提供してくれたAgriculture and Agri-Food Canadaに感謝します(プロジェクトJ-001843およびJ-002021)。このプロトコルのビデオコンテンツを撮影してくれたBrett van Heyningenに感謝します。また、この原稿で説明されている方法についての洞察を提供してくれた元大学院生(Jennifer VaconとMark Nabuurs)にも感謝します。

Materials

0.5-5 mL single channel Pipette VWR CA11020-004
10 mL Thin Layer Chromatography Sprayer VWR KT422530-0010
100 x 15 mm Petri plates VWR 89038-970
100-1000 µL pipette tips VWR 76322-164
100-1000 µL single channel pipette VWR 76169-240
15 mL sterile centrifuge tubes VWR CA21008-918
1 L glass bottle Millipore Sigma CLS13951L Must be autoclave safe
1 mL sterile syringe with needle Thomas Scientific 8935L75 Detachable needle is recommended
2 mL Microcentrifuge tube VWR 87003-298
50 mL sterile centrifuge tubes VWR CA21008-940
5 mL pipette tips VWR CA11020-008
7 mL scintilation vials VWR 76538-962
95% ethanol Thermo Fisher Scientific A412-500
Autoclave Cole-Parmer UZ-01850-34 8 L, 115 VAC
Bacteriological agar VWR 97064-336
bin Thomas Scientific 1216H91
D-Glucose VWR BDH9230-500G
Dichloromethane ≥99.8% ACS VWR BDH1113-4LG
Ethyl Acetate ≥99.8% ACS VWR BDH1123-4LG
Filter paper VWR CA28297-846
Grinding Beads VWR 12621-148
Hygromycin B VWR CA80501-074
Iron Sulfate Heptahydrate VWR 97061-542
Laminar flow hood CleanTech 1000-6-A
LC-MS Waters LITR10064178 UPLC/MS/MS TQD system
Lyophilizer Labconco 700201000 Temperature collector -50 °C 
Manganese Sulfate Hydrate VWR CAAA10807-14
Methanol ≥99.8% ACS VWR BDH2018-5GLP
Paper towel VWR 89402-824
Potato Dextrose Agar VWR CA90000-758
Potato Dextrose Broth VWR CA90003-494
Potsasium Phosphate Dibasic VWR 470302-246
Potsasium Phosphate Monobasic VWR 470302-252
Pressure Gauge 6mm Union Straight 0-10 bar (0-145 psi) Tameson F25U6
Pseudomonas F Agar VWR 90003-352 Also known as Flo Agar
PTFE Tubing Sigma Aldrich 58697-U 1/16 inch inner diameter 
Sodium Chloride VWR BDH9286-500G
Spatula VWR 82027-490
Sterile Inoculation loops with needle VWR 76534-512
Tinfoil Thomas Scientific 1086F24 Can be purchased from supermarket
TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S 25 Glass Plates 20 X 20 cm Thomas Scientific 1205Q12
Vacuum Pump Labconco 1472100 98 L/min
Vortex VWR 76549-928 Must accomadate 15 mL and 50 mL centrifuge tubes
Whatman in-line HEPA-VENT Millipore Sigma WHA67235000 10 filters, 1/4 to 3/8 inch inlet/outlet
VWR 97063-370

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Gauthier, L., Wagner, B. D., Boyetchko, S., Kirby, C. W. Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography. J. Vis. Exp. (209), e66967, doi:10.3791/66967 (2024).

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