Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography

Leah Gauthier; Brian D. Wagner; Sue Boyetchko; Christopher  W. Kirby

doi:10.3791/66967

JoVE Journal > Biochemistry

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Biochemistry

Bioassay-gesteuerte Identifizierung von Naturstoffen für die biologische Kontrolle durch Dünnschichtchromatographie-Direkte Bioautographie

Published: July 26, 2024

doi:

10.3791/66967

Leah Gauthier^1,2, Brian D. Wagner², Sue Boyetchko³, Christopher W. Kirby^1,2

¹Charlottetown Research and Development Centre,Agriculture and Agri-Food Canada, ²Department of Chemistry,University of Prince Edward Island, ³Saskatoon Research and Development Centre,Agriculture and Agri-Food Canada

Summary

Wir beschreiben den Einsatz der Dünnschichtchromatographie, des direkten Bioautographie-Assays und der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie zur Identifizierung von mikrobiellen Naturstoffen, die einen Antagonismus gegenüber pilzlichen Krankheitserregern aufweisen, wobei der Erreger Sclerotinia sclerotiorum und biopestizide Bacillus-Isolate als Modellsystem verwendet werden.

Abstract

Die Dünnschichtchromatographie-Direktbioautographie (TLC-DB) ist ein etablierter Bioassay zur Trennung und Identifizierung von Naturstoffen (NPs), die gegen einen Zielerreger antagonistisch sind. Es handelt sich um eine schnelle, kostengünstige und einfache Option für die Bioassay-gesteuerte Isolierung und Identifizierung von NPs, die auf der Trennung durch DC in Verbindung mit der direkten Anwendung eines Zielpathogens zur Untersuchung der Bioaktivität beruht. Es wird typischerweise für die Analyse von bioaktiven Pflanzenextrakten verwendet, um eine hemmende Wirkung gegen Bakterien, Pilze und Enzyme nachzuweisen. Davon abgesehen hat es ein großes Potenzial für die Entdeckung bakterieller NPs, insbesondere für die Bewertung bakterieller NPs gegen relevante landwirtschaftliche Krankheitserreger, was für die Entdeckung und Entwicklung neuartiger Biopestizide für die Agrarindustrie wertvoll ist. Darüber hinaus handelt es sich um ein abstimmbares Protokoll, das auf andere Zielpathogene oder NP-Quellen in Forschungsprogrammen zur Entdeckung und Identifizierung bioaktiver Verbindungen angewendet werden könnte. Darin beschreiben wir ein Modellsystem zur Entdeckung und Identifizierung von Biopestizid-NPs mittels TLC-DB mit Bacillus spp. und dem landwirtschaftlichen Erreger Sclerotinia sclerotiorum.

Introduction

Schädliche Krankheitserreger in der Landwirtschaft verursachen weltweit erhebliche Verluste bei der Erntequalität und den Erträgen und tragen zu den wirtschaftlichen und versorgungspolitischen Herausforderungen eines stabilen globalen Nahrungsmittelproduktionssystems bei ^1,2. Schäden durch Krankheitserreger können durch die Züchtung resistenter Sorten und den Einsatz integrierter Pflanzenschutzsysteme, einschließlich Fruchtfolgen und Landbewirtschaftungsverfahren, verhindert werden, um die Vermehrung von Krankheitserregern zu unterdrücken ^3,4. Obwohl diese Methoden Schäden an den Nutzpflanzen reduzieren, werden chemische Pestizide in der Regel zusammen eingesetzt, um die Fortpflanzungsstrukturen von Pilzen auf dem Feld aktiv abzutöten und Schäden und Ertragsminderungen weiter zu verhindern. Der Einsatz chemischer Pestizide ist zwar wirksam, hat aber viele Nachteile, darunter die Schädigung der umliegenden Ökosysteme, eine Abnahme der Bodenfruchtbarkeit, die damit verbundenen Risiken für die menschliche Gesundheit und die Entwicklung von Krankheitserregerresistenzen, wobei letzteres dazu führt, dass jedes Jahr höhere Dosen von Pestiziden erforderlich sind ^5,6,7.

Produkte zur Bekämpfung von Schädlingen und Krankheitserregern auf mikrobieller Basis gelten seit langem als potenzielle Alternativen oder ergänzend zu synthetischen Pestiziden. Seit den frühen 1900er Jahren wird Bacillus thuringiensis in großem Umfang zur Bekämpfung von landwirtschaftlichen Schädlingen und Krankheitserregern als Saatgutbehandlung, als Blattspray und in der direkten Bodenbehandlung eingesetzt⁸. Solche Produkte wurden als Biopestizide bezeichnet und sind als natürlich vorkommende Mikroorganismen oder Biochemikalien gekennzeichnet, die einen Zielschädling oder Krankheitserreger abtöten, unterdrücken oder seine Vitalität verringern können. Biopestizide können das Wachstum eines Krankheitserregers durch verschiedene Mechanismen kontrollieren, am häufigsten jedoch durch die Sekretion von Sekundärmetaboliten⁹. Sekundärmetaboliten, die oft als Naturstoffe bezeichnet werden, sind nicht am Primärstoffwechsel beteiligt, sondern werden als evolutionärer Vorteil produziert, um andere Mikroorganismen zu verdrängen¹⁰.

Biopestizide bieten viele Vorteile gegenüber ihren synthetischen Pendants. Sie stellen im Vergleich zu synthetischen Schädlingsbekämpfungsmitteln ein geringes Toxizitätsrisiko für Umwelt, Fauna und Mensch^dar ^9,10. Da die meisten Biopestizide seit Jahrtausenden natürlich in der Umwelt vorkommen, gibt es in der Umwelt biologische Abbauwege für mikrobielle Metaboliten, die die Möglichkeit einer Kontamination des Bodens oder des Ökosystems begrenzen und die Verweilzeiten verkürzen, die dazu beitragen, dass synthetische Pestizide so umweltzerstörerisch sind¹¹. Darüber hinaus weisen viele Biopestizide, die zur Eindämmung von Krankheitserregerinfektionen eingesetzt werden, auch pflanzenwachstumsfördernde Eigenschaften auf, die die Bioverfügbarkeit von Nährstoffen erhöhen und eine systemische Resistenz der Pflanzen induzieren können¹².

Am häufigsten werden Biopestizide in Form von mikrobiellem Inokulum ausgebracht, und NPs werden von lebenden Mikroorganismen in situ sezerniert ^12,13. In einem solchen Fall ist die Identifizierung der Quelle der Aktivität eines Biopestizids von großem Wert. Dies ermöglicht einen Einblick in den Wirkmechanismus des Biopestizids, hilft dabei, ein Patent für den Schutz eines Mikroorganismus zu rechtfertigen, und kann erhebliche wissenschaftliche Auswirkungen haben, wenn ihre Strukturen neu sind. Am wichtigsten ist jedoch, dass die Identifizierung der bioaktiven Quelle Aufschluss über die Formulierungsmöglichkeiten für ein nachgeschaltetes Biopestizidprodukt gibt. Wenn der NP selbst aktiv ist, kann man den Mikroorganismus als Biomolekülfabrik für die großtechnische Produktion von Biopestiziden nutzen. Darüber hinaus haben viele NPs, die für die biologische Schädlingsbekämpfung erforscht wurden, auch potenzielle Anwendungen in der Humanmedizin, was sie wirtschaftlich noch wertvoller macht⁸.

Dünnschichtchromatographie-Direktbioautographie-Assays (TLC-DB) sind eine kostengünstige und unkomplizierte Methode zur bioaktivitätsgesteuerten Isolierung und Identifizierung von biopestiziden Metaboliten. Obwohl die Technik häufig für die Trennung von Bioaktivitätstests von sekundären Pflanzenstoffen aus rohen Pflanzenextrakten verwendet wird, hat sie auch ein großes Potenzial für die Analyse von mikrobiellen Extrakten¹⁴. TLC ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Trennung von NPs in einem rohen mikrobiellen Extrakt, und nach der Beschichtung mit einer Medienerregersuspension können Zonen, die aktive Metaboliten enthalten, leicht sichtbar gemacht werden. Diese Zonen können von der Platte abgekratzt und für die chemische Analyse mittels Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie in Verbindung mit Massenspektrometrie (UPLC-MS) extrahiert werden, um bekannte Metaboliten zu identifizieren. Metaboliten, die nicht mit den zuvor berichteten Verbindungen übereinstimmen, können in größeren Mengen mittels Flüssigchromatographie isoliert werden, um Strukturaufklärungsstudien mit Techniken wie Kernspinresonanzspektroskopie und Röntgenkristallographie zu unterziehen¹⁵.

Dieser Artikel beschreibt ein Modellsystem zur Entdeckung und Identifizierung von Biopestizid-NPs mittels TLC-DB mit Bacillus spp. und dem landwirtschaftlichen Erreger Sclerotinia sclerotiorum. Abbildung 1 zeigt einen schematischen Überblick über das TLC-DB-Verfahren.

Abbildung 1: Schematische Übersicht der Schritte 4-7 des Vorgehens von TLC-DB. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Protocol

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt. 1. Auswahl der Kandidaten für die mikrobielle biologische Schädlingsbekämpfung Wählen Sie mithilfe von Wettbewerbsplatten-Assays mikrobielle Isolate aus, die einen Antagonismus gegenüber dem interessierenden Erreger aufweisen.HINWEIS: Neun Bacillus-Isolate , die einen Antagonismus gegen S. sclerotiorum aufwiesen, wurden ausgewählt, darunter Bacillus atrophaeus, Mojavensis und Subtilis-Arten , um dieses Protokoll zu demonstrieren. 2. Vorbereitung der Medien Bereiten Sie Kartoffel-Dextrose-Agar (PDA) vor, indem Sie 39 g Medium pro Liter Wasser auflösen. Bereiten Sie Pseudomonas F-Agar zu, indem Sie 45 g Medium pro Liter Wasser hinzufügen. Bereiten Sie Kartoffel-Dextrose-Brühe (PDB) mit 1 % Agar zu, indem Sie 24 g Medium und 0,24 g Agar pro Liter Wasser hinzufügen. Hefe-Glukose-Mangan (YGM) Brühe zubereiten. Es wird eine Pufferlösung bestehend aus 2,5 g KH2PO4 und 2,5 g K2HPO4 in 100 mL Wasser und eine Salzlösung bestehend aus 0,58 g MnSO4 hergestellt. H20, 0,5 g NaCl und 0,05 g FeSO 4,7H20 in 100 mL Wasser.Fügen Sie anschließend 1 g Hefeextrakt, 1,25 g Dextrose, 400 ml Wasser, 5 ml der Pufferlösung, 5 ml der Salzlösung und 90 ml Wasser hinzu, um sicherzustellen, dass die Metallsalze nicht in Lösung ausfallen. Sterilisieren Sie das Medium im Autoklavier, gießen Sie den Agar in 100 x 15 mm große Petriplatten und lassen Sie alles vor der Verwendung auf Raumtemperatur abkühlen. 3. Vorbereitung auf Krankheitserreger Fünf Platten Sclerotinia sclerotiorum auf PDA (in Schritt 2.1 hergestellt) kultivieren und 3 Tage lang bei 25 °C inkubieren. 4. Zubereitung von Naturprodukt-Extrakten Jedes Bakterienisolat wird auf Pseudomonas F-Agar (hergestellt in Schritt 2.2) kultiviert und wachsen, bis einzelne Kolonien beobachtet werden. Einzelne Bakterienkolonien in 25 mL YGM-Medium in Zentrifugen- oder Kulturröhrchen subkultivieren und 3 Tage lang unter Schütteln inkubieren. 5 ml Aliquote jedes Extrakts in 1 l YGM überführen und weitere 3 Tage unter den gleichen Bedingungen inkubieren. Zentrifugieren Sie jede Kultur bei 3000 x g für 15 min bei 25 °C, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wird dreimal mit Ethylacetat dekantiert und gewaschen, um die Metaboliten aus dem Nährmedium zu extrahieren. Kombinieren und trocknen Sie die Ethylacetatschicht jeder Schicht durch Rotationsverdampfung. Lösen Sie den Extrakt in minimalem Methanol wieder auf, geben Sie ihn in ein kleines Szintillationsfläschchen und trocknen Sie ihn erneut durch Rotationsverdampfung.HINWEIS: Wenn der Extrakt zu einem öligen oder harzigen Material trocknet, lyophilisieren Sie das Material, um ein trockenes Pulver zu erhalten, das genau gewogen werden kann. 5. Vorbereitung der DC-Platte Bereiten Sie die 20 cm x 20 cm große TLC-Platte vor, indem Sie eine Linie 2 cm von der Unterseite und 2 cm von der Oberseite der Platte ziehen. Platzieren Sie auf der unteren Linie neun Punkte im Abstand von 2 cm. Platzieren Sie oberhalb der oberen Linie vier Punkte im Abstand von 4 cm. Lösen Sie 5 mg jedes Extrakts in 15 μl Methanol auf und tragen Sie mit einer Pipette 5 μl jedes Extrakts auf die neun Punkte auf der unteren Linie auf. Lassen Sie jeden Extrakt auf der DC-Platte punktuell trocknen und tragen Sie weitere 5 μl aliquot auf die gleiche Stelle auf. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis das gesamte Material auf die DC-Platte geladen ist. Entwickeln Sie die DC-Platte in einem Entwicklungsbecken unter Verwendung einer 1:2-Lösung aus Dichlormethan und Methanol, bis das Lösungsmittel die Linie erreicht, die 2 cm von der Oberseite der Platte entfernt markiert ist (ca. 45 Minuten). Entfernen Sie nach der Entwicklung die DC-Platte und wenden Sie eine Reihe von Positivkontrollen auf die vier Punkte an, die über der Lösungsmittellinie markiert sind. Es werden vier Konzentrationen derselben Kontrolle verwendet. Für S. scl. sind 0,5 μg/ml, 5 μg/ml, 50 μg/ml und 500 μg/ml Hygromycin B Positivkontrollen. Bevor das gesamte Lösungsmittel aus der Platte verdunstet, legen Sie es in eine mit Ethanol sterilisierte DC-Plattenbox. 6. Direkter Bioautographie-Assay Autoklavieren Sie die Materialien, die für den Assay verwendet werden sollen (Glaskomponenten des Chromatographie-Sprühgeräts, Metallspatel, vier Blatt Papiertuch, Zellulose oder Filterpapier, Wasser und Medien) in einem großen, mit Alufolie bedeckten Becherglas.HINWEIS: Papiermaterialien (Papiertuch, Zellulosepapier) sollten in Alufolie eingewickelt werden, um zu vermeiden, dass sie im Autoklaven nass werden. Schließen Sie eine Luftquelle, ein Manometer und ein Chromatographie-Sprühgerät mit ethanolsterilisierten PTFE-Schläuchen an. Schließen Sie einen HEPA-Filter zwischen dem Chromatographie-Sprühgerät und dem Manometer an. Sammeln Sie die Myzelmatte der fünf Erregerplatten mit dem sterilen Metallspatel in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen mit einem sterilen Spatel.HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf eine kleine Menge flüssiger Brühe, um das Myzel zu entfernen, und übertragen Sie es mit einer sterilen Pipette. Geben Sie 25 ml PDB, ergänzt mit Agar und sterilen Glasperlen, in das 50-ml-Zentrifugenröhrchen und wirbeln Sie es 5 Minuten lang, um die Myzelmatte aufzubrechen. Übertragen Sie die Myzelsuspension mit einer sterilen Spritze mit einer Nadelspitze in ein Chromatographie-Sprühgerät, um sicherzustellen, dass große Myzelstücke das Chromatographie-Sprühgerät nicht verstopfen. Legen Sie die zuvor entwickelten DC-Platten auf sterile Papiertücher in eine Laminar-Flow-Haube, um den Handkontakt mit der Platte beim Auftragen der Mediensuspension zu reduzieren. Erhöhen Sie den Luftdruck auf ca. 4 bar und tragen Sie drei Schichten der Suspension auf die DC-Platte auf, damit die Platte zwischen den Anwendungen vollständig trocknen kann.HINWEIS: Es wurde festgestellt, dass drei Schichten die optimale Menge sind. Weniger als das, und der Erreger hat nicht genügend Medien, auf denen er wachsen kann. Darüber hinaus ist das Medium zu dickflüssig, was einen Kontakt von Krankheitserregern mit aktiven Metaboliten möglicherweise nicht zulässt. Geben Sie 500 ml steriles Wasser in eine sterilisierte Plastikplattenschachtel und legen Sie sterilisierte gefaltete Zelluloseblätter oder Filterpapier auf jede Seite, um die Feuchtigkeit zu speichern. Legen Sie die fertige Assay-Platte auf vier leere Petrischalen in der Box. Inkubieren Sie den Assay 3 Tage bis 1 Woche lang oder bis eine gleichmäßige Myzelschicht gleichmäßig über die DC-Platte wächst, mit Ausnahme der Positivkontrollen und der Inhibitionszone (ZOIs). 7. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Analyse Stellen Sie den fertigen Assay fotografisch dar. Berechnen Sie den Retentionsfaktor für jede Hemmzone, indem Sie den Abstand von der unteren Linie zum ZOI durch den Abstand von der unteren Linie zur oberen Linie dividieren. Kratzen Sie die Kieselsäure von den Hemmzonen ab und geben Sie sie in Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie 500 μl Methanol in jedes Röhrchen und wirbeln Sie es auf, um die Metaboliten aus der Kieselsäure zu extrahieren. Bei 8.500 x g bei 20 °C 10 min zentrifugieren und den Überstand in ein kleines Fläschchen überführen. Durch Rotationsverdampfung oder unter einem Stickstoffstrom bis zur Trockenheit verdampfen. Den Extrakt in 50 μl Methanol in einem LC-Fläschchen resuspendieren. Analysieren Sie die Metaboliten in der Zone der Hemmung durch LC-MS und vergleichen Sie sie mit den Metaboliten im Rohextrakt, um zu bestimmen, welche Metaboliten im Rohextrakt für die Hemmung des Erregers verantwortlich sind16. Durchsuchen Sie anhand der Gattung und Spezies des Ausgangsmikroorganismus und der im ZOI identifizierten Massen die Literatur und relevante Datenbanken wie Antibase und das Wörterbuch der Naturstoffe, um die Metaboliten zu identifizieren.

Representative Results

Bei der Trennung von mikrobiellen Extrakten durch DC sollten die Metaboliten vertikal entlang der DC-Platte dispergiert werden. Unter sichtbarem Licht kann es schwierig sein, Metaboliten zu erkennen, die im sichtbaren Lichtbereich nicht absorbiert werden. Daher kann die Bildgebung unter UV-Licht helfen, die Trennung der Metaboliten zu sehen, wie in Abbildung 2A, B zu sehen ist. Nach der Inkubationszeit sollte der Erreger gleichmäßig über die gesamte Platte wachsen, mit Ausnahme der Positivkontrollen und der Hemmzonen, in denen sich aktive Metaboliten befinden, wie in Abbildung 2C dargestellt. Abbildung 2: Trennung von mikrobiellen Extrakten durch DC. (A) Entwickelte DC-Platte mit neun Bacillus-Extrakten , die unter sichtbarem Licht und (B) unter 320 nm UV-Licht vor der Anwendung des Pilzinokulums abgebildet wurden. (C) Abgeschlossener Bioautographie-Assay, bei dem das Erregerwachstum auf der gesamten Platte beobachtet wurde, außer in den Fällen, in denen das Wachstum um die Positivkontrollen und den ZOI jedes Extrakts herum gehemmt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Metaboliten, die aus den Hemmzonen extrahiert werden, werden mittels LC-MS analysiert und mit dem Rohextrakt verglichen, um die NPs zu bestimmen, die für den Antagonismus gegen den Erreger verantwortlich sind. Übereinstimmende Metaboliten sollten die gleiche Retentionszeit und die gleichen molekularen Ionenspezies aufweisen, um als übereinstimmend zu gelten. Sobald die aktiven Metaboliten identifiziert sind, kann die Bakterienkultur in großen Mengen gezüchtet werden, um aktive Metaboliten zu isolieren, die für die Strukturchemie oder biologische Studien von Interesse sind.

Discussion

TLC-DB ist ein wertvolles und gut etabliertes NP-Forschungsinstrument und eine einfache und kostengünstige Alternative zu Mikroplatten-Bioassay-gesteuerten Isolierungsmethoden¹⁷. Es erfordert nur minimale Zeit- und Materialressourcen im Vergleich zu Mikrotiterplatten-Assays, die eine Metabolitentrennung mit Hilfe von Flüssigchromatographietechniken erfordern. Es handelt sich um einen äußerst vielseitigen Assay, der zum Nachweis von antibakteriellen, antimykotischen, antiparasitären und antioxidativen NPs zusätzlich zu den Enzyminhibitoren 18,19,20,21,22,23 verwendet werden kann. Obwohl sie am häufigsten zum Nachweis und zur Identifizierung bioaktiver phytoaktiver Pflanzenstoffe verwendet wird, kann die gleiche Methode auch für bakterielle NP angewendet werden, die in diesem Protokoll^{untersucht wurde 18}. Darüber hinaus kann das Protokoll für die Verwendung mit einer Vielzahl von NP-Quellen und Zielpathogenen optimiert werden, um die Entdeckung und Bewertung neuartiger bioaktiver NPs zu unterstützen.

Die für das Bakterienwachstum verwendeten Medien und die für die Extraktion verwendeten Lösungsmittel können die Ergebnisse der Entdeckung natürlicher Produkte stark beeinflussen. Das in diesem Protokoll verwendete Medium ist für Bakterien optimiert, die zyklische Lipopeptide produzieren, einschließlich Pseudomonas und Bacillus spp. Bei der Erforschung anderer Gattungen sollten jedoch auch andere Medien und Nährstoffquellen in Betracht gezogen werden. Man kann wählen, ob man die TLC-DB mit demselben Mikroorganismus vervollständigt, der in einer Reihe von Medien gezüchtet wird, um die gesamte Bandbreite der Metabolitenvielfalt aus einem Isolat zu bewerten, oder ob identische Wachstumsbedingungen für ein breiteres Spektrum von Isolaten verwendet werden. Die Wahl des Extraktionslösungsmittels wirkt sich auch auf die nachgewiesenen Naturstoffe aus. Es ist allgemein bekannt, dass die meisten bioaktiven NP eine niedrige bis mittlere Polarität aufweisen, so dass Ethylacetat aufgrund seines niedrigen Siedepunkts, der leicht zu entfernen ist, eine geeignete Wahl ist. Möchte man aber auch die polaren und unpolaren Fraktionen untersuchen, können mehrfache Extraktionen mit anderen Lösungsmitteln durchgeführt werden. Alternativ kann der zellfreie Extrakt lyophilisiert und im Assay verwendet werden, um alle Metaboliten zu sehen, die in das Medium freigesetzt werden. Oft muss jedoch mehr Material auf die DC-Platte geladen werden, um die getrockneten Medienkomponenten im lyophilisierten Material zu berücksichtigen. Wenn diese Methode mit einem anderen Erreger, wie z. B. einem Inokulum, angewendet wird, müssen das verwendete Medium und die Inkubationsbedingungen optimiert werden, um die 5 Agarplatten Myzel zu erhalten, die für den TLC-DB-Assay verwendet werden.

TLC-DB ist im Vergleich zur Kontakt- und Immersionsbioautographie vorteilhaft, da es die dünnste Schicht aus Agar und Inokulum verwendet, wodurch die Abhängigkeit von der Diffusion von Metaboliten in die Agarschicht minimiert wird, wodurch kleinere Mengen von Naturstoffen die Hemmung von Krankheitserregern induzieren können¹⁷. Zuvor veröffentlichte Ergebnisse mit bioautographischen TLC-Methoden haben eine Sporensuspension des Erregers verwendet, um den Assay zu vervollständigen¹⁷. Dies ermöglicht zwar eine genaue Kontrolle der Suspensionskonzentration, doch kann es äußerst schwierig und zeitaufwändig sein, die Sporulation bestimmter Pilze zu induzieren²⁴. Diese Modifikation vereinfacht den Assay erheblich und ermöglicht die Vervollständigung des Assays mit Pilzpathogenen, die schwer zu sporulieren sind und bei dieser Methode bisher möglicherweise vermieden wurden.

Die Masse des im Assay verwendeten Bakterienextrakts kann die Ergebnisse beeinflussen. Wenn zu wenig Extrakt auf die DC-Platte aufgetragen wird, ist es möglich, dass die minimale Hemmkonzentration eines Wirkstoffs nicht überschritten wird und die Bioaktivität nicht nachgewiesen wird. Infolgedessen lohnt es sich in einigen Fällen, wie in Abbildung 1 und Abbildung 2 zu sehen, die DC-Platte zu überlasten, wodurch die Trennung beeinträchtigt wird, um Aktivitäten leicht erkennen zu können. Ebenso darf die Erregerlast, die auf die Platte gesprüht wird, nicht zu gering sein, da nicht genügend Medien aufgebracht werden, um das Erregerwachstum zu unterstützen. Diese Methode kann leicht abgestimmt werden, um eine Vielzahl von Bakterienextrakten und Krankheitserregern aufzunehmen, und die im Protokoll beschriebenen Mengen an mikrobiellem Extrakt und Inokulum haben sichergestellt, dass die Bioaktivität für mehrere Krankheitserreger und mikrobielle Extrakte nachgewiesen werden kann. Wenn nach Abschluss des Assays keine Hemmzonen beobachtet werden, kann dies auf eines der folgenden Anzeichen hinweisen. Erstens dürfen aktive Metaboliten in dem applizierten Extrakt nicht vorhanden sein, weil unverträgliche Medien für das Bakterienwachstum verwendet werden oder weil die Aktivität der Bakterien nicht auf die NP-Produktion zurückzuführen ist. Ein Scheibendiffusionsassay mit dem Extrakt kann durchgeführt werden, um das Vorhandensein aktiver NPs im Extrakt zu bestätigen oder zu verneinen. Wenn der Scheibendiffusionsassay keine Unterdrückung des Erregers zeigt, können andere Medien getestet werden, um festzustellen, ob andere Bedingungen bioaktive NPs produzieren. Wenn der Scheibendiffusionsassay anzeigt, dass der Extrakt den Erreger unterdrückt, muss möglicherweise eine größere Masse des Bakterienextrakts auf die DC-Platte aufgetragen werden, in welchem Fall ein weiterer Assay versucht werden kann.

Der Vergleich der Metaboliten im ZOI mit dem Rohextrakt ist für die Identifizierung aktiver NPs unerlässlich. Im Assay können Metaboliten aus dem Rohextrakt durch den Erreger metabolisiert oder modifiziert werden, was mittels LC-MS beobachtet werden kann. Daher können nur Metaboliten, die sowohl im Rohextrakt als auch im ZOI vorkommen, als NP betrachtet werden, die von den untersuchten Bakterien produziert werden. Wenn man die aus dem ZOI extrahierten Metaboliten nicht mit den Metaboliten im Rohextrakt korrelieren kann, kann eine DC-Platte hergestellt werden, wie in Schritt 5 beschrieben. Ohne Abschluss des Bioautographie-Assays sind die Metaboliten aus der DC-Platte mit der gleichen Retentionszeit zu extrahieren, die im abgeschlossenen Assay beobachtet wurde. Dies sollte eine einfachere Korrelation zwischen den Metaboliten in den ZOIs und dem Rohextrakt ermöglichen, was zu einer Unterdrückung der Krankheitserreger führt.

Ein Nachteil von TLC-DB besteht darin, dass die Auflösung der DC-Auflösung erheblich geringer ist als bei der Verwendung herkömmlicher Mikrotiter-Screening-Techniken, die eine Flüssigkeitschromatographie zur Trennung erfordern. Daher ist es üblich, dass mehrere Metaboliten in der Hemmzone vorhanden sind, in der einige Metaboliten möglicherweise nicht zur Bioaktivität beitragen. Dieses Problem kann auch durch die Praxis verursacht werden, die DC-Platte zu überlasten, um die Bioaktivität klarer zu beobachten. Jüngste Arbeiten wurden unter Verwendung von Hochleistungs-TLC (HP-TLC) veröffentlicht, das die Auflösung erheblich verbessert und die Automatisierung der TLC-Entwicklung ermöglichen kann, die sonst bei der Verwendung von herkömmlichem TLC 14,21,22,23 unmöglich wäre. Außerdem können Platten in einer zweiten Dimension (2D-TLC) entwickelt werden, um Metaboliten mit ähnlichen Retentionszeiten weiter zu trennen. Davon abgesehen sollte geprüft werden, ob der erhöhte Zeit- und Materialaufwand ein lohnender Kompromiss für die höhere Auflösung ist, die durch HP- und 2D-TLC²⁵ erzielt wird.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Agriculture and Agri-Food Canada für die Finanzierung, unter der diese Forschung ermöglicht wurde (Projekte J-001843 und J-002021). Wir danken Brett van Heyningen für das Filmen des Videoinhalts für dieses Protokoll. Wir danken auch ehemaligen Doktoranden (Jennifer Vacon und Mark Nabuurs) für ihre Einblicke in die in diesem Manuskript beschriebenen Methoden.

Materials

0.5-5 mL single channel Pipette	VWR	CA11020-004
10 mL Thin Layer Chromatography Sprayer	VWR	KT422530-0010
100 x 15 mm Petri plates	VWR	89038-970
100-1000 µL pipette tips	VWR	76322-164
100-1000 µL single channel pipette	VWR	76169-240
15 mL sterile centrifuge tubes	VWR	CA21008-918
1 L glass bottle	Millipore Sigma	CLS13951L	Must be autoclave safe
1 mL sterile syringe with needle	Thomas Scientific	8935L75	Detachable needle is recommended
2 mL Microcentrifuge tube	VWR	87003-298
50 mL sterile centrifuge tubes	VWR	CA21008-940
5 mL pipette tips	VWR	CA11020-008
7 mL scintilation vials	VWR	76538-962
95% ethanol	Thermo Fisher Scientific	A412-500
Autoclave	Cole-Parmer	UZ-01850-34	8 L, 115 VAC
Bacteriological agar	VWR	97064-336
bin	Thomas Scientific	1216H91
D-Glucose	VWR	BDH9230-500G
Dichloromethane ≥99.8% ACS	VWR	BDH1113-4LG
Ethyl Acetate ≥99.8% ACS	VWR	BDH1123-4LG
Filter paper	VWR	CA28297-846
Grinding Beads	VWR	12621-148
Hygromycin B	VWR	CA80501-074
Iron Sulfate Heptahydrate	VWR	97061-542
Laminar flow hood	CleanTech	1000-6-A
LC-MS	Waters	LITR10064178	UPLC/MS/MS TQD system
Lyophilizer	Labconco	700201000	Temperature collector -50 °C
Manganese Sulfate Hydrate	VWR	CAAA10807-14
Methanol ≥99.8% ACS	VWR	BDH2018-5GLP
Paper towel	VWR	89402-824
Potato Dextrose Agar	VWR	CA90000-758
Potato Dextrose Broth	VWR	CA90003-494
Potsasium Phosphate Dibasic	VWR	470302-246
Potsasium Phosphate Monobasic	VWR	470302-252
Pressure Gauge 6mm Union Straight 0-10 bar (0-145 psi)	Tameson	F25U6
Pseudomonas F Agar	VWR	90003-352	Also known as Flo Agar
PTFE Tubing	Sigma Aldrich	58697-U	1/16 inch inner diameter
Sodium Chloride	VWR	BDH9286-500G
Spatula	VWR	82027-490
Sterile Inoculation loops with needle	VWR	76534-512
Tinfoil	Thomas Scientific	1086F24	Can be purchased from supermarket
TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S 25 Glass Plates 20 X 20 cm	Thomas Scientific	1205Q12
Vacuum Pump	Labconco	1472100	98 L/min
Vortex	VWR	76549-928	Must accomadate 15 mL and 50 mL centrifuge tubes
Whatman in-line HEPA-VENT	Millipore Sigma	WHA67235000	10 filters, 1/4 to 3/8 inch inlet/outlet
	VWR	97063-370

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Gauthier, L., Wagner, B. D., Boyetchko, S., Kirby, C. W. Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography. J. Vis. Exp. (209), e66967, doi:10.3791/66967 (2024).

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