Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography

Leah Gauthier; Brian D. Wagner; Sue Boyetchko; Christopher  W. Kirby

doi:10.3791/66967

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

Bioassay-geleide identificatie van natuurlijke producten voor biologische bestrijding door dunnelaagchromatografie-directe bioautografie

Published: July 26, 2024

doi:

10.3791/66967

Leah Gauthier^1,2, Brian D. Wagner², Sue Boyetchko³, Christopher W. Kirby^1,2

¹Charlottetown Research and Development Centre,Agriculture and Agri-Food Canada, ²Department of Chemistry,University of Prince Edward Island, ³Saskatoon Research and Development Centre,Agriculture and Agri-Food Canada

Summary

We beschrijven het gebruik van dunne-laagchromatografie, directe bioautografie-assay en vloeistofchromatografie-massaspectrometrie om microbiële natuurlijke producten te identificeren die antagonisme vertonen tegen schimmelpathogenen, met behulp van de ziekteverwekker Sclerotinia sclerotiorum en biopesticide Bacil-isolaten als modelsysteem.

Abstract

Dunnelaagchromatografie-directe bioautografie (TLC-DB) is een gevestigde bioassay die wordt gebruikt om natuurlijke producten (NP’s) te scheiden en te identificeren die antagonistisch zijn tegen een doelpathogeen . Het is een snelle, goedkope en eenvoudige optie voor de bioassay-geleide isolatie en identificatie van NP’s die afhangt van scheiding door TLC in combinatie met de directe toepassing van een doelpathogeen om bioactiviteit te onderzoeken. Het wordt meestal gebruikt voor de analyse van bioactieve plantenextracten, waarbij remmende activiteit tegen bacteriën, schimmels en enzymen wordt gedetecteerd. Dat gezegd hebbende, heeft het een groot potentieel bij het ontdekken van bacteriële NP’s, met name voor het evalueren van bacteriële NP’s tegen relevante landbouwpathogenen, wat waardevol is voor het ontdekken en ontwikkelen van nieuwe biopesticiden voor de landbouwindustrie. Bovendien is het een afstembaar protocol dat kan worden toegepast op andere doelpathogenen of bronnen van NP’s in onderzoeksprogramma’s met betrekking tot de ontdekking en identificatie van bioactieve stoffen. Hierin beschrijven we een modelsysteem voor het ontdekken en identificeren van biopesticide NP’s met behulp van TLC-DB met Bacillus spp. en de landbouwpathogeen Sclerotinia sclerotiorum.

Introduction

Schimmelpathogenen in de landbouw veroorzaken wereldwijd aanzienlijke verliezen in gewaskwaliteit en opbrengsten, wat bijdraagt aan de economische en leveringsuitdagingen van een stabiel wereldwijd voedselproductiesysteem ^1,2. Schade door ziekteverwekkers kan worden voorkomen door cultivars te kweken die resistent zijn tegen infectie en door gebruik te maken van geïntegreerde gewasbeheersystemen, waaronder vruchtwisseling en landbeheerpraktijken om de proliferatie van ziekteverwekkers te onderdrukken ^3,4. Hoewel deze methoden de schade aan gewassen verminderen, worden chemische bestrijdingsmiddelen over het algemeen samen gebruikt om schimmelvoortplantingsstructuren in het veld actief te doden en schade en opbrengstvermindering verder te voorkomen. Hoewel effectief, heeft het gebruik van chemische bestrijdingsmiddelen veel nadelen, waaronder schade aan omliggende ecosystemen, een afname van de bodemvruchtbaarheid, bijbehorende gezondheidsrisico’s voor de mens en de ontwikkeling van resistentie tegen ziekteverwekkers, waardoor elk jaar hogere doses pesticiden nodig zijn ^5,6,7.

Producten voor de bestrijding van plagen en ziekteverwekkers op basis van microben worden al lang beschouwd als potentiële alternatieven of een aanvulling op synthetische pesticiden. Sinds het begin van de 1900e eeuw wordt Bacillus thuringiensis op grote schaal gebruikt om landbouwplagen en ziekteverwekkers te bestrijden als zaadbehandeling, als bladspray en in directe bodembehandeling⁸. Dergelijke producten worden biopesticiden genoemd en worden gekenmerkt als natuurlijk voorkomende micro-organismen of biochemicaliën die de kracht van een doelplaag of ziekteverwekker kunnen doden, onderdrukken of verminderen. Biopesticiden kunnen de groei van een ziekteverwekker via verschillende mechanismen beheersen, maar meestal doen ze dit door de afscheiding van secundaire metabolieten⁹. Secundaire metabolieten, vaak natuurlijke producten genoemd, zijn niet betrokken bij het primaire metabolisme, maar worden geproduceerd als een evolutionair voordeel om andere micro-organismen te overtreffen¹⁰.

Biopesticiden bieden veel voordelen ten opzichte van hun synthetische tegenhangers. Ze vormen een laag toxiciteitsrisico voor het milieu, de fauna en de mens in vergelijking met synthetische ongediertebestrijdingsproducten ^9,10. Aangezien de meeste biopesticiden al millennia van nature in het milieu voorkomen, bestaan er biologische afbraakroutes voor microbiële metabolieten in het milieu, waardoor de mogelijkheid van bodem- of ecosysteemverontreiniging wordt beperkt en de verblijftijden worden verkort die ertoe bijdragen dat synthetische pesticiden zo milieuvernietigend zijn¹¹. Bovendien vertonen veel biopesticiden die worden gebruikt voor het verminderen van pathogene infecties ook plantgroeibevorderende eigenschappen, die de biologische beschikbaarheid van voedingsstoffen kunnen verhogen en systemische resistentie van planten kunnen induceren¹².

Meestal worden biopesticiden toegepast in de vorm van microbieel inoculum en worden NP’s in situ uitgescheiden door levende micro-organismen ^12,13. In zo’n geval is het identificeren van de bron van de activiteit van een biopesticide van grote waarde. Dit geeft inzicht in het werkingsmechanisme van het biopesticide, helpt bij het opbouwen van een zaak voor de bescherming van een micro-organisme met een octrooi en kan een aanzienlijke wetenschappelijke impact hebben als hun structuren nieuw zijn. Het belangrijkste is echter dat de identificatie van de bioactieve bron de formuleringsmogelijkheden voor een stroomafwaarts biopesticideproduct informeert. Als het NP zelf actief is, kan men het micro-organisme gebruiken als biomolecuulfabriek voor grootschalige productie van biopesticiden. Bovendien hebben veel NP’s die zijn onderzocht voor biologische bestrijding ook potentiële toepassingen in de menselijke geneeskunde, waardoor ze economisch nog waardevoller zijn⁸.

Dunnelaagchromatografie-directe bioautografie (TLC-DB) assays zijn een goedkope en ongecompliceerde methode voor de bioactiviteit-geleide isolatie en identificatie van biopesticide metabolieten. Hoewel de techniek vaak wordt gebruikt voor het scheiden van bioactiviteitstesten van fytochemicaliën van ruwe plantenextracten, heeft het ook een groot potentieel voor de analyse van microbiële extracten¹⁴. TLC zorgt voor een snelle en goedkope scheiding van NP’s in een ruw microbieel extract, en na coating met een mediapathogene suspensie worden zones die actieve metabolieten bevatten gemakkelijk gevisualiseerd. Die zones kunnen van de plaat worden geschraapt en geëxtraheerd voor chemische analyse door middel van ultra-high-performance vloeistofchromatografie in combinatie met massaspectrometrie (UPLC-MS) om bekende metabolieten te identificeren. Metabolieten die niet overeenkomen met eerder gerapporteerde verbindingen kunnen in grotere hoeveelheden worden geïsoleerd via vloeistofchromatografie om structuurophelderingsstudies te ondergaan met behulp van technieken zoals nucleaire magnetische resonantiespectroscopie en röntgenkristallografie¹⁵.

Dit artikel beschrijft een modelsysteem voor het ontdekken en identificeren van NP’s van biopesticiden met behulp van TLC-DB met Bacillus spp. en de landbouwpathogeen Sclerotinia sclerotiorum. Figuur 1 geeft een schematisch overzicht van de TLC-DB procedure.

Figuur 1: Schematisch overzicht van stap 4-7 van de procedure van TLC-DB. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

De details van de reagentia en de apparatuur die in dit onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel. 1. Selectie van de microbiële biologische bestrijdingskandidaten Selecteer met behulp van competitieplaatassays microbiële isolaten die antagonisme vertonen tegen de ziekteverwekker van belang.OPMERKING: Negen Bacillus-isolaten die antagonisme vertoonden tegen S. sclerotiorum werden geselecteerd, waaronder Bacillus atrophaeus-, mojavensis- en subtilis-soorten , om dit protocol aan te tonen. 2. Voorbereiding van de media Bereid aardappeldextrose-agar (PDA) door 39 g medium per liter water op te lossen. Bereid Pseudomonas F-agar voor door 45 g media per liter water toe te voegen. Bereid aardappeldextrosebouillon (PDB) met 1% agar door 24 g medium en 0,24 g agar per liter water toe te voegen. Bereid gist-glucose-mangaan (YGM) bouillon voor. Maak een bufferoplossing bestaande uit 2,5 g KH2PO4 en 2,5 g K2HPO4 in 100 ml water en een zoutoplossing bestaande uit 0,58 g MnSO4. H20, 0,5 g NaCl en 0,05 g FeSO 4,7H20 in 100 ml water.Voeg vervolgens 1 g gistextract, 1,25 g dextrose, 400 ml water, 5 ml bufferoplossing, 5 ml zoutoplossing en 90 ml water toe om ervoor te zorgen dat de metaalzouten niet in oplossing neerslaan. Autoclaaf steriliseer de media, giet de agar in petriplaten van 100 x 15 mm en laat alles afkoelen tot kamertemperatuur voor gebruik. 3. Bereiding van ziekteverwekkers Kweek vijf platen Sclerotinia sclerotiorum op PDA (bereid in stap 2.1) en incubeer gedurende 3 dagen bij 25 °C. 4. Bereiding van natuurlijk productextract Kweek elk bacterie-isolaat op Pseudomonas F Agar (bereid in stap 2.2) en kweek totdat individuele kolonies worden waargenomen. Subcultuur enkele bacteriekolonies in 25 ml YGM-media in centrifuge- of kweekbuizen en incubeer met schudden gedurende 3 dagen. Breng 5 ml aliquots van elk extract over in 1 L YGM en incubeer nog 3 dagen onder dezelfde omstandigheden. Centrifugeer elke cultuur bij 3000 x g gedurende 15 minuten bij 25 °C om de cellen te pelleteren. Decanteren en wassen van het supernatans drie keer met ethylacetaat om metabolieten uit het kweekmedium te extraheren. Combineer en droog de ethylacetaatlaag van elk met behulp van roterende verdamping. Los het extract opnieuw op in minimale methanol, breng het over in een kleine scintillatieflacon en droog het opnieuw door roterende verdamping.OPMERKING: Als het extract opdroogt tot een olieachtig of harsachtig materiaal, lyofiliseer het materiaal dan om een droog poeder te verkrijgen dat nauwkeurig kan worden gewogen. 5. Voorbereiding van de TLC-plaat Bereid de TLC-plaat van 20 cm x 20 cm voor door een lijn te trekken op 2 cm van de onderkant en 2 cm van de bovenkant van de plaat. Plaats op de onderste lijn negen stippen met een onderlinge afstand van 2 cm. Plaats boven de bovenste lijn vier stippen op 4 cm van elkaar. Los 5 mg van elk extract op in 15 μl methanol en breng 5 μl van elk extract aan op de negen stippen op de onderste lijn met behulp van een pipet. Laat elke extractieplek drogen op de TLC-plaat en breng nog eens 5 μL aliquot aan op dezelfde plek. Herhaal dit totdat al het materiaal op de TLC-plaat is geladen. Ontwikkel de TLC-plaat in een ontwikkeltank met behulp van een 1:2-oplossing van dichloormethaan en methanol totdat het oplosmiddel de lijn bereikt die 2 cm van de bovenkant van de plaat is gemarkeerd (ongeveer 45 min). Eenmaal ontwikkeld, verwijdert u de TLC-plaat en past u een reeks positieve controles toe op de vier stippen die boven de oplosmiddellijn zijn gemarkeerd. Er worden vier concentraties van dezelfde controle gebruikt. Voor S. scl. zijn 0,5 μg/ml, 5 μg/ml, 50 μg/ml en 500 μg/ml hygromycine B positieve controles. Voordat al het oplosmiddel van de plaat verdampt, plaatst u deze in een met ethanol gesteriliseerde TLC-plaatdoos. 6. Directe bioautografietest Autoclaaf de materialen die voor de test worden gebruikt (glazen onderdelen van de chromatografiespuit, metalen spatel, vier vellen keukenpapier, cellulose- of filterpapier, water en media) in een groot bekerglas bedekt met aluminiumfolie.OPMERKING: Papiermaterialen (keukenpapier, cellulosepapier) moeten in aluminiumfolie worden gewikkeld om te voorkomen dat ze nat worden in de autoclaaf. Sluit een luchtbron, manometer en chromatografiespuit aan met behulp van met ethanol gesteriliseerde PTFE-slangen. Sluit een HEPA-filter aan tussen de chromatografiespuit en de manometer. Verzamel de myceliummat van de vijf pathogene platen met behulp van de steriele metalen spatel in een centrifugebuis van 50 ml met behulp van een steriele spatel.OPMERKING: Gebruik indien nodig een kleine hoeveelheid vloeibare bouillon om het mycelium los te maken en breng over met een steriele pipet. Voeg 25 ml PDB gemodificeerd met agar en steriele glasparels toe aan de centrifugebuis van 50 ml en draai gedurende 5 minuten om de myceliummat te breken. Breng de myceliumsuspensie over in een chromatografiespuit met behulp van een steriele spuit met een naaldpunt om ervoor te zorgen dat grote stukken mycelia de chromatografiespuit niet verstoppen. Plaats de eerder ontwikkelde TLC-platen op steriele papieren handdoeken in een laminaire flowkap om handcontact met de plaat te verminderen tijdens het aanbrengen van de mediasuspensie. Verhoog de luchtdruk tot ongeveer 4 bar en breng drie lagen van de suspensie aan op de TLC-plaat, zodat de plaat tussen de toepassingen door volledig kan drogen.OPMERKING: Drie lagen bleken de optimale hoeveelheid te zijn. Minder dan dit, en de ziekteverwekker heeft niet genoeg media om op te groeien. Bovendien is het medium te dik, waardoor ziekteverwekkers mogelijk niet in contact kunnen komen met actieve metabolieten. Voeg 500 ml steriel water toe aan een gesteriliseerde plastic plaatdoos en plaats aan elke kant gesteriliseerde gevouwen cellulosevellen of filterpapier om vocht vast te houden. Plaats de ingevulde testplaat op vier lege petrischaaltjes in de doos. Incubeer de test gedurende 3 dagen tot 1 week of totdat een gelijkmatige laag mycelia gelijkmatig over de TLC-plaat groeit, behalve rond de positieve controles en de remmingszone (ZOI’s). 7. Analyse van massaspectrometrie met vloeistofchromatografie Afbeelding van de voltooide test met behulp van fotografie. Bereken de retentiefactor voor elke remmingszone door de afstand van de onderste lijn tot de ZOI te delen door de afstand van de onderste regel tot de bovenste lijn. Schraap het silica van de remmingszones en plaats het in microcentrifugebuisjes. Voeg 500 μL methanol toe aan elke buis en draaikolk om de metabolieten uit het silica te extraheren. Centrifugeer bij 8.500 x g bij 20 °C gedurende 10 minuten en breng het supernatans over in een kleine injectieflacon. Verdampen tot droogheid door roterende verdamping of onder een stikstofstroom. Resuspendeer het extract in 50 μl methanol in een LC-injectieflacon. Analyseer de metabolieten in de remzone door LC-MS en vergelijk ze met de metabolieten in het ruwe extract om te bepalen welke metabolieten in het ruwe extract verantwoordelijk zijn voor de remming van de ziekteverwekker16. Aan de hand van het geslacht en de soort van het bronmicro-organisme en de massa’s die in de ZOI zijn geïdentificeerd, doorzoekt u de literatuur en relevante databases zoals Antibase en de Dictionary of Natural Products om de metabolieten te identificeren.

Representative Results

Na de scheiding van microbiële extracten door TLC, moeten metabolieten verticaal langs de TLC-plaat worden verspreid. Onder zichtbaar licht kan het moeilijk zijn om metabolieten te zien die niet in het zichtbare lichtbereik worden geabsorbeerd. Beeldvorming onder UV-licht kan dus helpen om de scheiding van metabolieten te bekijken, zoals te zien is in figuur 2A,B. Na de incubatieperiode zou de ziekteverwekker gelijkmatig over de hele plaat moeten lijken te groeien, behalve over de positieve controles en de remmingszones waar actieve metabolieten zich bevinden, afgebeeld in figuur 2C. Figuur 2: Scheiding van microbiële extracten door TLC. (A) Ontwikkelde TLC-plaat met negen Bacillus-extracten afgebeeld onder zichtbaar licht en (B) onder 320 nm UV-licht voorafgaand aan de toepassing van schimmelinoculum. (C) Voltooide bioautografietest met pathogene groei waargenomen over de hele plaat, behalve waar de groei wordt geremd rond de positieve controles, en ZOI van elk extract. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Metabolieten geëxtraheerd uit de remmingszones worden geanalyseerd door LC-MS en vergeleken met het ruwe extract om de NP’s te bepalen die verantwoordelijk zijn voor het antagonisme tegen de ziekteverwekker. Overeenkomende metabolieten moeten dezelfde retentietijd en moleculaire ionensoorten hebben om als een match te worden beschouwd. Zodra de actieve metabolieten zijn geïdentificeerd, kan de bacteriecultuur in bulk worden gekweekt om actieve metabolieten te isoleren die van belang zijn voor structurele chemie of biologisch onderzoek.

Discussion

TLC-DB is een waardevol en gerenommeerd NP-onderzoeksinstrument en een eenvoudig en goedkoop alternatief voor microplaat-bioassay-geleide isolatiemethoden¹⁷. Het vereist minimale tijd en materiaalbronnen in vergelijking met microplaattests, die metabolietscheiding vereisen met behulp van vloeistofchromatografietechnieken. Het is een zeer veelzijdige test die kan worden gebruikt om antibacteriële, schimmelwerende, antiparasitaire en antioxiderende NP’s te detecteren, naast enzymremmers 18,19,20,21,22,23. Hoewel het meest wordt gebruikt voor het detecteren en identificeren van bioactieve fytochemicaliën, kan dezelfde methode worden toegepast voor bacteriële NP’s zoals onderzocht in dit protocol¹⁸. Bovendien kan het protocol worden geoptimaliseerd voor gebruik met een verscheidenheid aan NP-bronnen en doelpathogenen om te helpen bij het ontdekken en beoordelen van nieuwe bioactieve NP’s.

De media die worden gebruikt voor bacteriegroei en het oplosmiddel dat wordt gebruikt voor extractie kunnen een grote invloed hebben op de resultaten van de ontdekking van natuurlijke producten. De media die in dit protocol worden gebruikt, zijn geoptimaliseerd voor bacteriën die cyclische lipopeptiden produceren, waaronder Pseudomonas en Bacillus spp. Maar andere media en voedingsbronnen moeten worden overwogen bij het verkennen van andere geslachten. Men kan ervoor kiezen om TLC-DB te voltooien met behulp van hetzelfde micro-organisme dat in een reeks media is gekweekt om de volledige breedte van de metabolietdiversiteit van één isolaat te evalueren, of om identieke groeiomstandigheden te gebruiken voor een breder scala aan isolaten. De keuze van het extractieoplosmiddel heeft ook invloed op de gedetecteerde natuurlijke producten. Het is algemeen bekend dat de meeste bioactieve NP’s een lage tot matige polariteit hebben, waardoor ethylacetaat een geschikte keuze is vanwege het lage kookpunt, waardoor het gemakkelijk te verwijderen is. Als men echter ook de polaire en niet-polaire fracties wil onderzoeken, kunnen meerdere extracties met andere oplosmiddelen worden uitgevoerd. Als alternatief kan het celvrije extract worden gevriesdroogd en in de test worden gebruikt om alle metabolieten te zien die in de media vrijkomen. Er moet echter vaak meer materiaal op de TLC-plaat worden geladen om rekening te houden met de gedroogde mediacomponenten in het gevriesdroogde materiaal. Evenzo, als deze methode wordt gebruikt met een andere ziekteverwekker, zoals inoculum, moeten de gebruikte media en incubatieomstandigheden worden geoptimaliseerd om de 5 agarplaten mycelium te verkrijgen die worden gebruikt voor de TLC-DB-test.

TLC-DB is voordelig in vergelijking met contact- en immersiebioautografie omdat het de dunste laag agar en inoculum gebruikt, waardoor de afhankelijkheid van de diffusie van metabolieten in de agarlaag wordt geminimaliseerd, waardoor kleinere hoeveelheden natuurlijke producten remming van pathogenen kunnen induceren¹⁷. Eerder gepubliceerde bevindingen met behulp van TLC-bioautografische methoden hebben een sporensuspensie van de ziekteverwekker gebruikt om de test te voltooien¹⁷. Hoewel dit een nauwkeurige controle van de suspensieconcentratie mogelijk maakt, kan het buitengewoon moeilijk en tijdrovend zijn om de sporulatie van bepaalde schimmels op te wekken²⁴. Deze wijziging vereenvoudigt de test aanzienlijk en maakt het mogelijk om de test te voltooien met behulp van schimmelpathogenen die moeilijk te sporuleren zijn en die mogelijk eerder voor deze methode zijn vermeden.

De massa bacterieel extract die in de test wordt gebruikt, kan de resultaten beïnvloeden. Als er te weinig extract op de TLC-plaat wordt aangebracht, is het mogelijk dat de minimale remmende concentratie van een actieve stof niet wordt overschreden en bioactiviteit niet wordt gedetecteerd. Als gevolg hiervan is het in sommige gevallen, en zoals te zien is in Figuur 1 en Figuur 2, de moeite waard om de TLC-plaat te overbelasten, waardoor de scheiding in gevaar komt voor het vermogen om gemakkelijk activiteit te detecteren. Evenzo mag de lading ziekteverwekkers die op de plaat wordt gespoten niet te laag zijn, omdat er niet genoeg media worden aangebracht om de groei van ziekteverwekkers te ondersteunen. Deze methode kan gemakkelijk worden afgestemd op een verscheidenheid aan bacteriële extracten en ziekteverwekkers, en de hoeveelheden microbieel extract en inoculum die in het protocol worden beschreven, hebben ervoor gezorgd dat bioactiviteit kan worden gedetecteerd voor meerdere ziekteverwekkers en microbiële extracten. Als er na voltooiing van de test geen remmingszones worden waargenomen, kan dit op een van de volgende wijzen duiden. Ten eerste is het mogelijk dat er geen actieve metabolieten aanwezig zijn in het aangebrachte extract omdat incompatibele media worden gebruikt voor bacteriegroei of omdat de activiteit van de bacteriën niet het gevolg is van de NP-productie. Een schijfdiffusietest met het extract kan worden voltooid om het bestaan van actieve NP’s in het extract te bevestigen of te ontkennen. Als de schijfdiffusietest geen onderdrukking van pathogenen aantoont, kunnen andere media worden getest om te bepalen of andere omstandigheden bioactieve NP’s produceren. Als de schijfdiffusietest aangeeft dat het extract de ziekteverwekker onderdrukt, moet mogelijk een grotere massa van het bacteriële extract op de TLC-plaat worden aangebracht, in welk geval een andere test kan worden geprobeerd.

Het vergelijken van metabolieten in de ZOI met het ruwe extract is essentieel voor het identificeren van actieve NP’s. In de test kunnen metabolieten uit het ruwe extract worden gemetaboliseerd of gemodificeerd door de ziekteverwekker, wat kan worden waargenomen via LC-MS. Dus alleen metabolieten die zowel in het ruwe extract als in de ZOI voorkomen, kunnen worden beschouwd als NP’s die door de bestudeerde bacteriën worden geproduceerd. Als men de uit de ZOI geëxtraheerde metabolieten niet kan correleren met metabolieten in het ruwe extract, kan een TLC-plaat worden gemaakt, zoals beschreven in stap 5. Zonder de bioautografietest te voltooien, extraheert u de metabolieten uit de TLC-plaat op dezelfde retentietijd die is waargenomen in de voltooide test. Dit zou een gemakkelijkere correlatie mogelijk moeten maken tussen de metabolieten in de ZOI’s en ruw extract, waardoor de onderdrukking van pathogenen wordt veroorzaakt.

Een nadeel van TLC-DB is dat de resolutie van TLC aanzienlijk lager is dan die welke wordt bereikt bij het gebruik van traditionele microwell-screeningtechnieken, die vloeistofchromatografie vereisen voor scheiding. Het is dus gebruikelijk dat er meerdere metabolieten bestaan in de remmingszone waar sommige metabolieten mogelijk niet bijdragen aan de bioactiviteit. Dit probleem kan verder worden veroorzaakt door de praktijk van overbelasting van de TLC-plaat om de bioactiviteit duidelijker waar te nemen. Recent werk is gepubliceerd met behulp van high-performance TLC (HP-TLC), die de resolutie aanzienlijk verbetert en de automatisering van TLC-ontwikkeling mogelijk maakt die anders onmogelijk is bij gebruik van conventionele TLC 14,21,22,23. Ook kunnen platen in een tweede dimensie (2D-TLC) worden ontwikkeld om metabolieten met vergelijkbare retentietijden verder te scheiden. Dat gezegd hebbende, moet men evalueren of de hogere tijd- en materiaalkosten een waardevol compromis zijn voor een hogere resolutie die wordt verkregen van HP- en 2D-TLC²⁵.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We zijn Agriculture and Agri-Food Canada dankbaar voor de financiering waarmee dit onderzoek mogelijk is gemaakt (projecten J-001843 en J-002021). Met dank aan Brett van Heyningen voor het filmen van de videocontent voor dit protocol. We willen ook voormalige afstudeerders (Jennifer Vacon en Mark Nabuurs) bedanken voor hun inzichten in de methoden die in dit manuscript worden beschreven.

Materials

0.5-5 mL single channel Pipette	VWR	CA11020-004
10 mL Thin Layer Chromatography Sprayer	VWR	KT422530-0010
100 x 15 mm Petri plates	VWR	89038-970
100-1000 µL pipette tips	VWR	76322-164
100-1000 µL single channel pipette	VWR	76169-240
15 mL sterile centrifuge tubes	VWR	CA21008-918
1 L glass bottle	Millipore Sigma	CLS13951L	Must be autoclave safe
1 mL sterile syringe with needle	Thomas Scientific	8935L75	Detachable needle is recommended
2 mL Microcentrifuge tube	VWR	87003-298
50 mL sterile centrifuge tubes	VWR	CA21008-940
5 mL pipette tips	VWR	CA11020-008
7 mL scintilation vials	VWR	76538-962
95% ethanol	Thermo Fisher Scientific	A412-500
Autoclave	Cole-Parmer	UZ-01850-34	8 L, 115 VAC
Bacteriological agar	VWR	97064-336
bin	Thomas Scientific	1216H91
D-Glucose	VWR	BDH9230-500G
Dichloromethane ≥99.8% ACS	VWR	BDH1113-4LG
Ethyl Acetate ≥99.8% ACS	VWR	BDH1123-4LG
Filter paper	VWR	CA28297-846
Grinding Beads	VWR	12621-148
Hygromycin B	VWR	CA80501-074
Iron Sulfate Heptahydrate	VWR	97061-542
Laminar flow hood	CleanTech	1000-6-A
LC-MS	Waters	LITR10064178	UPLC/MS/MS TQD system
Lyophilizer	Labconco	700201000	Temperature collector -50 °C
Manganese Sulfate Hydrate	VWR	CAAA10807-14
Methanol ≥99.8% ACS	VWR	BDH2018-5GLP
Paper towel	VWR	89402-824
Potato Dextrose Agar	VWR	CA90000-758
Potato Dextrose Broth	VWR	CA90003-494
Potsasium Phosphate Dibasic	VWR	470302-246
Potsasium Phosphate Monobasic	VWR	470302-252
Pressure Gauge 6mm Union Straight 0-10 bar (0-145 psi)	Tameson	F25U6
Pseudomonas F Agar	VWR	90003-352	Also known as Flo Agar
PTFE Tubing	Sigma Aldrich	58697-U	1/16 inch inner diameter
Sodium Chloride	VWR	BDH9286-500G
Spatula	VWR	82027-490
Sterile Inoculation loops with needle	VWR	76534-512
Tinfoil	Thomas Scientific	1086F24	Can be purchased from supermarket
TLC Silica Gel 60 RP-18 F254S 25 Glass Plates 20 X 20 cm	Thomas Scientific	1205Q12
Vacuum Pump	Labconco	1472100	98 L/min
Vortex	VWR	76549-928	Must accomadate 15 mL and 50 mL centrifuge tubes
Whatman in-line HEPA-VENT	Millipore Sigma	WHA67235000	10 filters, 1/4 to 3/8 inch inlet/outlet
	VWR	97063-370

References

Fisher, M. C., et al. Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health. Nature. 484 (7393), 186-194 (2012).
Savary, S., et al. The global burden of pathogens and pests on major food crops. Nat Ecol Evol. 3 (3), 430-439 (2019).
Lin, B. B. Resilience in agriculture through crop diversification: Adaptive management for environmental change. BioSci. 61 (3), 183-193 (2011).
Piquerez, S. J., Harvey, S. E., Beynon, J. L., Ntoukakis, V. Improving crop disease resistance: Lessons from research on arabidopsis and tomato. Front Plant Sci. 5, 671 (2014).
Damalas, C., Koutroubas, S. Current status and recent developments in biopesticide use. Agriculture. 8 (1), 13 (2018).
Syed Ab Rahman, S. F., Singh, E., Pieterse, C. M. J., Schenk, P. M. Emerging microbial biocontrol strategies for plant pathogens. Plant Sci. 267, 102-111 (2018).
Tudi, M., et al. Exposure routes and health risks associated with pesticide application. Toxics. 10 (6), 335 (2022).
Santos, E. N., et al. Bacillus thuringiensis: From biopesticides to anticancer agents. Biochimie. 192, 83-90 (2022).
Kumar, J., Ramlal, A., Mallick, D., Mishra, V. An overview of some biopesticides and their importance in plant protection for commercial acceptance. Plants. 10 (6), 1185 (2021).
Marrone, P. Pesticidal natural products – status and future potential. Pest Manag Sci. 75 (9), 2325-2340 (2019).
Ayilara, M. S., et al. Biopesticides as a promising alternative to synthetic pesticides: A case for microbial pesticides, phytopesticides, and nanobiopesticides. Front. Microbiol. 14, 1040901 (2023).
Abdelaziz, A. M., et al. Biocontrol of soil borne diseases by plant growth promoting rhizobacteria. Trop. Plant Pathol. 48 (2), 105-127 (2023).
Zhao, Z., Liu, D., Ruan, L., Wang, T., Liang, Z. Antifungal mechanism of Bacillus amyloliquefaciens SC-B15 and its application in cereal mildewproof and grape preservation. Food Biosci. 56, 103287 (2023).
Jamshidi-Aidji, M., Dimkic, I., Ristivojevic, P., Stankovic, S., Morlock, G. Effect-directed screening of bacillus lipopeptide extracts via hyphenated high-performance thin-layer chromatography. J Chromatogr A. 1605, 460366 (2019).
Prichystal, J., Schug, K. A., Lemr, K., Novak, J., Havlicek, V. Structural analysis of natural products. Anal Chem. 88 (21), 10338-10346 (2016).
De Souza, C. G., et al. Simultaneous quantification of lipopeptide isoforms by UPLC-MS in the fermentation broth from Bacillus subtilis CNPMS22. Anal Bioanal Chem. 410 (26), 6827-6836 (2018).
Dewanjee, S., Gangopadhyay, M., Bhattacharya, N., Khanra, R., Dua, T. Bioautography and its scope in the field of natural product chemistry. J Pharm Anal. 5 (2), 75-84 (2015).
Choma, I., Jesionek, W. TLC-direct bioautography as a high throughput method for detection of antimicrobials in plants. Chromatography. 2 (2), 225-238 (2015).
Attia, R., et al. Thin-layer chromatography-bioautographic method for the detection of arginase inhibitors. J Sep Sci. 43 (12), 2477-2486 (2020).
Legerska, B., Chmelova, D., Ondrejovic, M. TLC-bioautography as a fast and cheap screening method for the detection of alpha-chymotrypsin inhibitors in crude plant extracts. J Biotechnol. 313, 11-17 (2020).
Agatonovic-Kustrin, S., Doyle, E., Gegechkori, V., Morton, D. W. High-performance thin-layer chromatography linked with (bio)assays and FTIR-ATR spectroscopy as a method for discovery and quantification of bioactive components in native Australian plants. J Pharm Biomed Anal. 184, 113208 (2020).
Hilaire, V., et al. New method for screening anti-leishmania compounds in plants extracts by HPTLC-bioautography. J Chromatogr B. 1188, 123061 (2022).
Stankovic, J., et al. HPTLC-direct bioautography-guided isolation of isogeranic acid as the main antibacterial constituent of Artemisia santonicum essential oil. J Serb Chem Soc. 84 (12), 1355-1365 (2019).
Su, Y., Qi, Y., Cai, L. Induction of sporulation in plant pathogenic fungi. Mycology. 3, 195-200 (2012).
Wedge, E., Nagle, D. A new 2D-TLC bioautography method for the discovery of novel antifungal agents to control plant pathogens. J Nat Prod. 63, 1050-1054 (2000).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Gauthier, L., Wagner, B. D., Boyetchko, S., Kirby, C. W. Bioassay-Guided Identification of Natural Products for Biocontrol by Thin Layer Chromatography-Direct Bioautography. J. Vis. Exp. (209), e66967, doi:10.3791/66967 (2024).

Automatically Generated