ヒト免疫細胞におけるミトコンドリア膜電位の動的変化を評価するための高分解能蛍光スパイロメトリー

ここで提示するデータおよび方法開発のための血液サンプルの収集は、ワシントン大学の内部審査委員会によって承認されました。代表的な結果には、Jackson Laboratoriesから購入した雄のC57BL/6Jマウス(生後5〜7ヶ月)のデータも含まれています。すべての動物用処置は、ワシントン大学動物福祉局によって承認されました。プロトコルの概要を 図 1 に示します。このプロトコールの試薬調製は、 補足ファイル1に記載されています。 図1:プロトコルの概要。 高分解能蛍光肺活量測定を用いたワークフローにより、新鮮ヒト血液サンプルから単離された単球(CD14+)およびT細胞(CD3+)のミトコンドリア膜電位の変化を評価します。略語:TMRM、テトラメチルローダミンメチルエステル;SUIT、基板-アンカプラー-阻害剤滴定;ADP、アデノシン二リン酸;ディグ、ジギトニン;マル、リンゴ;ピル、ピルビン酸;グルート、グルタミン酸;D1-10、10回連続ADP滴定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 1.全血からのバフィーコートの分離 注:細胞単離はKramer et al.27から改変されています。 RPMI、密度勾配、および遠心分離機が室温に達するまで待ちます。開始する前に、バイオセーフティキャビネットと材料を滅菌してください。 静脈血を3本の10mL K2EDTAチューブに集めます。チューブを少なくとも3回反転させます。 チューブを500 x g 10分間(22°C、9加速[acc]、2減速[dec])で遠心分離します。 各チューブから1 mLの血漿を取り出し、将来の分析のために-80°Cで保存します。 血漿と赤血球層の半分を各チューブから単一の50 mL円錐管に移します。.RPMIを40mLマークまで追加します。少なくとも3回反転します。 10 mLの血漿溶液を、3 mLの密度勾配を含む4本の15 mL円錐管にゆっくりと層状にします。. 700 x g で30分間遠心分離します(22°C、5 acc、2 dec)。 赤血球を乱すことなく、すべての血漿と末梢単核細胞(PBMC)を含むバフィーコートを収集します。 500 x g で10分間(22°C、5 acc、5 dec)遠心分離し、上清を吸引します。 PBMCペレットを10 mLのRPMIに再懸濁し、500 x g で10分間(22°C、5 acc、5 dec)遠心分離して、PBMCペレットを1x-2x洗浄します。 2. CD14+細胞とCD3+細胞の磁気分離 磁性セルセパレーターの磁場にカラムを置きます( 材料の表を参照)。RP-5 3 mLでカラムを洗浄します。 PBMCペレットを80 μLのRP-5および20 μLの抗CD14マイクロビーズに再懸濁します( 材料の表を参照)。4°Cで15分間インキュベートします。 細胞を1 mLのRP-5で再懸濁し、懸濁液をカラムにロードします。「Flow-through 1」とラベル付けされた15 mLの円錐形チューブに流れる非標識細胞を回収します。すべての細胞懸濁液がカラムを通過するまで待ってから、3 mLのRP-5 3xで洗浄を続け、すべてのフロースルーを収集します。 カラムを磁場から慎重に取り外し、新しい 15 mL コニカルチューブに置きます。RP-5 mL を 5 mL 加え、すぐにプランジャーを使用してカラム内容物を「CD14+」とラベル付けされたコレクションチューブにパージします。 「Flow-through 1」を500 x gで10分間(22°C、5 acc、5 dec)遠心分離し、上清を吸引します。 フロースルー1の細胞を使用して、抗CD3マイクロビーズ(材料表を参照)を使用して手順2.2〜2.5を繰り返し、T細胞を単離します。 T細胞(CD3+)および単球(CD14+)を含むチューブを300 x g で5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットをRP-5 1 mLに再懸濁します。 血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞濃度を測定します。注:細胞のカウントは、1:10または1:20の細胞希釈液10μLを血球計算盤に加えることによって行うことができます。1つは、血球計算盤36を用いて細胞を数えるために以前に発表されたプロトコルを参照してもよい。 250万個の単球または500万個のT細胞を新しい遠心チューブにピペットで挿入します。2000 x gで30秒間遠心分離し、上清を吸引し、細胞をMiR05に再懸濁して、総容量20 μL、最終濃度1億2,500万単球または2億5,000万T細胞/mLにします。注:最終濃度は、20μLの容量で250万個の単球または500万個のT細胞を注入するために選択されました。脾臓から単離されたマウスT細胞もこの方法を使用してテストされています。手順は 、補足ファイル 1 にあります。 3. 高分解能蛍光肺活量測定 – 酸素およびTMRM蛍光キャリブレーション 注:この方法は、Pharaohらによって透過性繊維で行われた以前の研究から適応されました.11。クエンチモードには、抑制性のない高濃度のTMRMが使用され、マトリックス中のmMP濃度とTMRM濃度の関係が逆転します。したがって、mMPの減少は、マトリックスからのTMRM色素の放出および蛍光32の増加をもたらす。 製造元の指示に従って、O2K呼吸計に0.5mLチャンバーを取り付けます( 材料の表を参照)。機器の電源を入れ、データ収集のためにメーカーが提供するソフトウェアに接続します。 温度を37°Cに調整し、攪拌速度を750rpmに調整します。 チャンバーを蒸留水で3回洗浄します。水を 0.54 mL の Mir05 と交換し、ストッパーを完全に閉じて、統合吸引システム (ISS) で余分なバッファーを取り除きます。ストッパースペーサーを使用して、室内の酸素がチャンバーの酸素と平衡するようにストッパーを上げます。 酸素フラックスが安定したら、製造元の指示に従って空気酸素校正(R1)を実行します。注意: 酸素フラックスが安定するまでに>30分かかる場合があります。酸素センサーは、ジチオナイト滴定を使用した別々の実験から、50〜200μMのゼロ点酸素フラックス(R0)とバックグラウンド酸素フラックスを測定する必要があります。具体的な方法については、メーカーのマニュアルに記載されています。 ストッパーを閉じてチャンバーを密閉します。注:透過処理繊維を使用した実験とは異なり、チャンバーはPBMCの高酸素化を必要としません。酸素レベルは50〜250μMに維持する必要があります。酸素濃度が閾値を下回った場合、チャンバーの酸素が室内の空気中の酸素と平衡化できるように、チャンバーを部分的に開くことができます。 TMRMキャリブレーションAmRフィルターセット付きの緑色LED蛍光センサー(例:525 nm)を使用します(材料の表を参照)。蛍光光度計のゲインを1000に、強度を1000に設定します。フルオセンサーの電源を入れ、ベースラインの記録を開始します。 2.5 μL の 0.05 mM TMRM を注入し、次の 2.5 μL 注入前にシグナルが安定するのを待ちます (~2 分)、チャンバ内の合計 TMRM 濃度が 1 μM TMRM になるように合計 4 回の注入が行われます。すべての注射にはハミルトンシリンジを使用してください。. 5点キャリブレーションでは、0、0.25、0.5、0.75、および1.0 μMのTMRMを表す各注入の蛍光シグナル(電圧)を選択して、フルセンサーをキャリブレーションします。 4. Substrate-Uncoupler-Inhibitor滴定(SUIT)プロトコール 注:TMRMシグナルは注入のみに応答して変化するため、20μLの細胞懸濁液の代わりに20μLのMir05をチャンバーに注入するブランク実験を実行します(代表的な結果で説明されています)。ブランク実験とサンプル実験の両方で、次の注入前に酸素フラックス信号が安定する(約2〜3分)のことを待ちます。以下の滴定プロトコルと予想される観察結果を 表1に示します。 酸素フラックスが安定したら、酸素フラックスとTMRMシグナルの両方を「プレセル」として選択し、ラベル付けします。 500万個のT細胞または250万個の単球を含む細胞懸濁液を~20μLに注入し、約10分間測定します。酸素フラックスとTMRM信号の両方を選択し、”Cell”とラベル付けします。 1 mg/mL ジギトニン 2 μL を注入して細胞を透過化します (最終濃度: 4 μg/mL)。20分待ちます。酸素フラックスとTMRM信号の両方を選択し、”Dig”とラベル付けします。注:ジギトニン濃度は、別々の実験で最適化することをお勧めします。 2.5 μLの1 Mコハク酸(最終濃度:5 mM)を加えます。酸素フラックスとTMRM信号の両方を選択して「SUCC」とラベル付けします。 酸素フラックスが安定したら、100 mMリンゴ酸(最終濃度:1.0 mM)を5 μL、1 Mグルタミン酸(最終濃度:10 mM)を5 μL、500 mMピルビン酸(最終濃度:5 mM)を5 μL添加します。酸素フラックスとTMRM信号の両方を選択し、”MPG”とラベル付けします。 酸素フラックスが安定したら、ADPを滴定します。各滴定のレートを選択し、滴定の数に応じて1から10まで順番に「D」とラベル付けします。 表2の滴定スキームを使用します。 酸素フラックスが安定したら、蛍光シグナルが最大に達するまで、0.25 mMシアン化カルボニルp-(トリフルオロメトキシ)フェニルヒドラゾン(FCCP)の一連の1 μL滴定を実行します。酸素フラックスと最小膜電位を表すTMRM信号の両方を選択してラベル付けし、「FCCP」とラベル付けします。注:ミトコンドリア膜電位を枯渇させるには、通常、0.5〜1.0μMのFCCP濃度が必要です。注意: FCCP は有毒です。適切な取り扱いについては、安全データシート(SDS)を参照してください。 オプション:酸素フラックスが安定したら、0.25mMロテノンを1μL注入して複合体Iを阻害し、複合体IIを介して呼吸能力を決定します。注:膜電位の変化は、アンカプラーで滴定した後は意味がなくなります。注意: ロテノンは有毒です。適切な取り扱いについては、SDSを参照してください。 酸素フラックスが安定したら、1.25 mM(最終濃度:2.5 μM)のアンチマイシンAを1 μL注入して、ミトコンドリア呼吸を抑制します。注意:アンチマイシンAは有毒です。適切な取り扱いについては、SDSを参照してください。 5. ミトコンドリア膜電位の計算と解析 ブランク実験を使用して、ブランクサンプル(「プレサンプル」)の注入前および各注入について、較正されたTMRM値(マイクロモルTMRM)を記録します。 図 2 を参照してください。 ブランク実験ごとに、「サンプル前」のTMRM濃度を1.0に設定してバックグラウンド比を計算します。その後の TMRM の比例減少を計算します。すべてのブランク実験から平均バックグラウンド比を計算します。注:含めるブランク実験の数は、装置の精度によって異なる場合があります。 表3 の計算例を5つの異なるブランク実験から示し、平均バックグラウンド比の標準偏差が各滴定で0〜0.016に低下しました。 バックグラウンド計算: サンプル実験の「プレサンプル」TMRM に各注入の平均バックグラウンド比を掛けて、各サンプル実験のバックグラウンドを計算します。 表 3 の計算例を参照してください。 バックグラウンド補正:サンプルの測定されたTMRM値に実験のバックグラウンドを差し引きます。 表 4 の計算例を参照してください。 FCCP 補正:各注入から FCCP バックグラウンド補正された mMP を差し引きます。 表 4 の計算例を参照してください。 ADP感度曲線:ADP滴定中に収集されたmMP値を使用して、メンブレン電位の最高値と最低値をそれぞれ100%と0%に設定することにより、ADPによるmMPの減少を正規化します。優先統計ソフトウェアを使用してデータを非線形フィット回帰モデルに当てはめ、mMP 上の ADP の半値阻害濃度 (IC50) を計算します。注:曲線は、[阻害剤]対正規化応答-プリズムの可変傾きに適合します。 図2:TMRM蛍光からのミトコンドリア膜電位(mMP)とADP感度の計算。 T細胞の1つのサンプル(n = 1)の高分解能蛍光肺量測定によるTMRM蛍光の測定からミトコンドリア膜電位(mMP)とADP感度を計算する手順。ステップ1:TMRM蛍光は、生物学的サンプルで行われたようにブランクサンプルで測定されます。ステップ2:各ブランク実験のサンプル前の信号に対する各滴定によるTMRM信号の比率を決定します。すべてのブランク実験の各滴定の平均を計算します。ステップ3:「プレサンプル」蛍光に各滴定の平均バックグラウンド比を掛けて、各サンプル実験のバックグラウンドを計算します。ステップ4:滴定ごとにバックグラウンドTMRM蛍光とサンプルTMRM蛍光の差を計算して、データをmMPまたはミトコンドリアTMRM取り込みとして表します。ステップ 5: FCCP との完全なアンカップリングが 0 mMP を反映するように mMP を修正します。ステップ6:非線形回帰を実行して、ADP濃度の増加に伴うmMPの変化をグラフ化します。測定は、健康なボランティアからの500万個のT細胞を含む0.5mLチャンバーで行われました。平均データは SEM ±平均として表され、1 回のレプリケートの 1 つのデータ ポイントはエラー バーなしで表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。