פלואורספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת שינויים דינמיים בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בתאי מערכת החיסון האנושית
Summary
השיטות לחקר ביו-אנרגטיקה מיטוכונדריאלית תחת ריכוזי מצע רלוונטיים פיזיולוגית בתאי מערכת החיסון מוגבלות. אנו מספקים פרוטוקול מפורט המשתמש בפלואורספירומטריה ברזולוציה גבוהה כדי להעריך שינויים בתגובה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית לדרישת אנרגיה בתאי T אנושיים, מונוציטים ותאים חד-גרעיניים היקפיים.
Abstract
תאים חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מציגים שינויים חזקים ביכולת הנשימה המיטוכונדריאלית בתגובה לבריאות ולמחלות. בעוד שינויים אלה לא תמיד משקפים את מה שקורה ברקמות אחרות, כגון שרירי השלד, תאים אלה הם מקור נגיש ובעל ערך של מיטוכונדריה קיימא מנבדקים אנושיים. PBMCs חשופים לאותות מערכתיים המשפיעים על מצבם הביו-אנרגטי. לכן, הרחבת הכלים שלנו לחקר חילוף החומרים במיטוכונדריה באוכלוסייה זו תבהיר מנגנונים הקשורים להתקדמות המחלה. בדיקות תפקודיות של מיטוכונדריה מוגבלות לעתים קרובות לשימוש בתפוקות נשימה בעקבות ריכוזי מצע, מעכב ובלתי מצמד מרביים כדי לקבוע את הטווח המלא של קיבולת הנשימה, שייתכן שלא ניתן להשיג in vivo. ההמרה של אדנוזין דיפוספט (ADP) לאדנוזין טריפוספט (ATP) על ידי ATP-סינתאז גורמת לירידה בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (mMP) ולעלייה בצריכת החמצן. כדי לספק ניתוח משולב יותר של דינמיקה מיטוכונדריאלית, מאמר זה מתאר את השימוש בפלואורספירומטריה ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את התגובה הבו-זמנית של צריכת חמצן ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (mMP) לריכוזים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית של ADP. טכניקה זו משתמשת במתילאסטר טטרמתילרודאמין (TMRM) כדי למדוד קיטוב mMP בתגובה לטיטרציות ADP לאחר היפרפולריזציה מקסימלית עם מצעים מורכבים I ו- II. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לכמת כיצד שינויים במצב הבריאותי, כגון הזדקנות ומחלות מטבוליות, משפיעים על הרגישות של התגובה המיטוכונדריאלית לדרישת האנרגיה ב- PBMCs, תאי T ומונוציטים מנבדקים אנושיים.
Introduction
יכולתו של התא לתפקד ולשרוד בתקופה של לחץ פיזיולוגי תלויה במידה רבה ביכולתו לעמוד בדרישה האנרגטית לשחזור הומאוסטזיס 1,2. הביקוש לאנרגיה עולה בתגובה למגוון גירויים. לדוגמה, כיווץ מוגבר של שרירים במהלך פעילות גופנית מגביר את ניצול ATP וגלוקוז על ידי שרירי השלד, ועלייה בסינתזת חלבונים בעקבות זיהום מגבירה את ניצול ATP על ידי תאי מערכת החיסון לייצור ציטוקינים והתפשטות 3,4,5,6. זינוק בביקוש לאנרגיה מעורר סדרה של תהליכים ביו-אנרגטיים כדי לשחזר את יחס ה-ATP/ADP. כאשר ATP נצרך, רמות ADP עולות ומעוררות F1F0 ATP-סינתאז (קומפלקס V), אשר דורש כוח פרוטומניע כדי להניע את הסיבוב המכני שלו ואת ההמרה הקטליטית של ADP ל- ATP בתוך המיטוכונדריה7. הכוח הפרוטומניע הוא שיפוע אלקטרוכימי שנוצר על ידי שאיבת פרוטונים במהלך העברת אלקטרונים ממצעים לחמצן דרך מערכת הובלת האלקטרונים (ETS) בתוך הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית. ההבדל שנוצר כתוצאה מכך בריכוז הפרוטונים (דלתא pH) ובפוטנציאל החשמלי (פוטנציאל הממברנה) יוצר את הכוח הפרוטומניע המניע סינתזת ATP וצריכת חמצן בתגובה לביקוש לאנרגיה, הפחתת יחס ATP/ADP או העלאת רמות ADP. הזיקה של מיטוכונדריה ל- ADP יכולה להיקבע על ידי חישוב של Km או EC50 של נשימה מעוררת ADP של מיטוכונדריה מבודדים או תאים חדירתיים 8,9. שיטה זו הראתה כי סיבי שריר חדירתיים מבני אדם מבוגרים דורשים ריכוז גבוה יותר של ADP כדי לעורר 50% מיכולת הזרחן החמצוני המקסימלית שלהם מאשר אלה של נבדקים צעירים9. באופן דומה, הזדקנות שרירי השלד של עכבר דורשת יותר ADP כדי להפחית את הייצור של מיני חמצן תגובתי מיטוכונדריאלי (ROS)10,11. בנוסף, רגישות ADP מופחתת בסיבי שריר חדירתיים של עכברים עם השמנת יתר הנגרמת על ידי דיאטה ביחס לבקרות והיא מוגברת בנוכחות אינסולין ולאחר צריכת חנקות12,13. לפיכך, היכולת של מיטוכונדריה להגיב לדרישת אנרגיה משתנה בתנאים פיזיולוגיים שונים, אך זה לא נחקר בעבר בהקשר של תאי מערכת החיסון.
תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) משמשים בדרך כלל לחקר ביו-אנרגטיקה תאית בבני אדם 14,15,16,17,18,19,20. זה נובע בעיקר מכך שניתן להשיג תאים בקלות מדגימות דם לא מוסדרות במחקרים קליניים, תגובת התאים להפרעות מטבוליות, והשיטות שפותחו על ידי קבוצות שונות לחקור את חילוף החומרים במיטוכונדריה באמצעות מעכבים ומפרקים כדי לקבוע את היכולת המקסימלית והמינימלית של נשימה מיטוכונדריאלית21,22. שיטות אלה הובילו להערכה של תפקידי הביו-אנרגטיקה בהזדקנות, מחלות מטבוליות ותפקוד מערכת החיסון 14,20,23,24. קיבולת הנשימה המיטוכונדריאלית מופחתת לעתים קרובות בשרירי השלד וב- PBMCs בתנאים של אי ספיקת לב18,25. PBMC bioenergetics מתואמים גם עם גורמי סיכון cardiometabolic במבוגרים בריאים17 והם מגיבים לטיפולים כגון nicotinamide riboside18. PBMCs כוללים נויטרופילים, לימפוציטים (תאי B ותאי T), מונוציטים, תאי הרג טבעיים ותאים דנדריטיים, שכולם תורמים לקיבולת המיטוכונדריה של PBMC 26,27,28. נוסף על כך, ביו-אנרגטיקה תאית ממלאת תפקיד מכריע בהפעלה, שגשוג והתחדשות של תאי מערכת החיסון23. עם זאת, מגבלה של שיטות אלה היא כי התאים אינם מתפקדים תחת טווח פיזיולוגי של מצעים. לכן נדרשות שיטות נוספות כדי לחקור את תפקוד המיטוכונדריה בריכוזי המצע הרלוונטיים יותר למה שתאים חווים in vivo.
פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (mMP) הוא המרכיב העיקרי של כוח פרוטומניע והוא חיוני למגוון תהליכים מיטוכונדריאליים מעבר לייצור ATP, כגון ויסות שטף הנשימה, ייצור מיני חמצן תגובתי, ייבוא חלבונים ויונים, אוטופגיה ואפופטוזיס. ניתן להעריך mMP באמצעות בדיקות אלקטרוכימיות או צבעים פלואורסצנטיים הרגישים לשינויים בקיטוב הממברנות כמו JC-1, Rhod123, DiOC6, טטרמתיל רודאמין (TMRE) או מתיל אסטר (TMRM), וספרנין. שני האחרונים הם צבעים קטיוניים ליפופיליים ששימשו בהצלחה בפלואורספירומטריה ברזולוציה גבוהה של הומוגנאטים ברקמות, מיטוכונדריה מבודדת ורקמות חדירות 11,29,30,31,32,33. בטכניקה זו, TMRM משמש במצב מרווה, שבו תאים נחשפים לריכוז גבוה של TMRM המצטבר במטריצה המיטוכונדריאלית כאשר הוא מקוטב (mMP גבוה וכוח פרוטומניע), וכתוצאה מכך מרווה את הפלואורסצנטיות של TMRM ציטוסולי. כאשר מיטוכונדריה מבצעים דה-פולריזציה בתגובה ל-ADP או ל-uncouplers, הצבע משתחרר מהמטריצה, מה שמגדיל את האות הפלואורסצנטי TMRM34,35. מטרת שיטה זו היא למדוד בו זמנית שינויים בנשימה המיטוכונדריאלית וב-mMP בתגובה לטיטרציות ADP ב-PBMCs שמקורם בבני אדם, מונוציטים במחזור הדם ותאי T, וניתן ליישם אותה גם על תאי T ספלניים של עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה משתמש בפלואורספירומטריה ברזולוציה גבוהה כדי למדוד את רגישות התגובה המיטוכונדריאלית לדרישת אנרגיה על-ידי מדידת הפיזור של mMP בתגובה לרמות הולכות וגדלות של ADP ב-PBMCs, מונוציטים ותאי T. זה נעשה על ידי הוספת מצעים מורכבים I ו- II כדי למקסם את פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית וטיטרציה ADP כדי לעורר בהדרגה ATP-סינתאז להשתמש בשיפוע הפרוטון ליצירת ATP.
שלבים קריטיים בפרוטוקול כוללים הגדרת הרווח והעוצמה של הפלואורופור ל-1000 ווידוא רכישת אות פלואורסצנטי TMRM במהלך הטיטרציה של TMRM. מכיוון שהפלואורסצנטיות של TMRM יורדת לאחר כל טיטרציה (מגבלה של שיטה זו), הכרחי להריץ ניסויי רקע באמצעות דגימות ריקות. מצאנו גם של-DMSO יש השפעה מעכבת על הנשימה המיטוכונדריאלית ועל פוטנציאל הממברנה, ולכן אנו ממליצים לדלל את תמיסת העבודה של TMRM ב-Mir05 (איור משלים 1).
כמה שינויים שניתן להשתמש בהם בעת ניסיון פרוטוקול זה הם התאמת ריכוזי התאים ושימוש בתא סטנדרטי של 2 מ”ל. עם זאת, תא 0.5 מ”ל מועדף עבור תאי T ומונוציטים בגלל ריכוז גבוה של תאים הדרושים לתגובה אופטימלית בפוטנציאל הממברנה ובשטף החמצן. ריכוז נמוך יותר של תאים עשוי להיות אופטימלי כאשר בוחנים תאים עם קיבולת נשימה גדולה יותר, כמו מקרופאגים.
מגבלות נוספות של השיטה המוצגות כאן כוללות את הדרישה ללפחות 5 מיליון תאי T ו-2.5 מיליון מונוציטים. לעתים קרובות אנו יכולים להשיג מספיק תאים מ ~ 20 מ”ל של דם ממשתתפים בריאים, אבל מספרים אלה יכולים להשתנות לפי מצב בריאותי, גיל, ומין26. בנוסף, כמו ברוב השיטות להערכת קיבולת המיטוכונדריה, התאים צריכים להיות מבודדים טריים. עם זאת, שיטה זו יכולה להיות נסה בתאים cryopreserved בעתיד. בהשוואה לתשואה מדם אנושי, תפוקת תאי T מטחול של עכברים בריאים גבוהה מספיק כדי לבצע בדיקה זו.
תאי T במחזור, במיוחד תאי זיכרון בעלי תוחלת חיים ארוכה (TM) ותאי בקרה (Treg), מסתמכים על זרחן חמצוני לאנרגיה37. בעוד שצריכת האנרגיה והחמצן שלהם נמוכה (למשל, בהשוואה לזו של שריר במנוחה), הישרדותם חיונית לתגובה חיסונית יעילה להדבקה חוזרת ולסרטן 38,39,40. הפחתה בזרחן החמצוני של תאי T גורמת לפגיעה ביכולת ההתרבות ומקדמת תשישות תאי T והזדקנות 5,41. בנוסף, היפרפולריזציה מיטוכונדריאלית מקדמת ייצור מתמשך של ציטוקינים (IL-4 ו- IL-21) על ידי תאי T CD4 במהלך הפעלה42. בעת זיהום, דרישת האנרגיה להפעלה ושגשוג של תאי מערכת החיסון יכולה להיות גבוהה עד 25%-30% מקצב חילוף החומרים הבסיסי43. לכן, תאי מערכת החיסון מתפקדים בטווח רחב וקיצוני של דרישות אנרגיה, ופרוטוקול זה יכול לבדוק תגובות מיטוכונדריאליות בטווח זה.
דלקת כרונית היא מאפיין נפוץ של השמנת יתר, סוכרת והזדקנות. לרמות לא מווסתות של הורמונים, שומנים וגלוקוז במחזור הדם יש השפעות מערכתיות, ולכן הן יכולות להשפיע על האופן שבו המיטוכונדריה מגיבים לאתגר אנרגטי. במאמר זה הצגנו שיטה להערכת רגישות ל-ADP מיטוכונדריאלי ב-PBMCs במחזור. מחקרים נוספים נדרשים כדי לקבוע כיצד רגישות ADP עשויה להיות מווסתת במחלות מטבוליות וכיצד היא משפיעה על מצב הבריאות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למתנדבים האדיבים שתרמו דם לפרויקט זה. אנו גם מביעים את הערכתנו הכנה לד”ר אלן שור ולצוותה על שסיפקו לנו דגימות נוספות ממחקרם. ברצוננו גם להודות לאנדרו קירש על סקירת כתב היד ועריכתו לקריאות. עבודה זו נתמכה על ידי מקורות המימון הבאים: P01AG001751, R01AG078279, P30AR074990, P30DK035816, P30DK017047, R01DK089036, K01HL154761, T32AG066574.
Materials
| Adenosine Diphosphate | Sigma-Aldrich | A5285 | Fluorespirometry |
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | Fluorespirometry |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A6003 | Mir05 buffer |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A6003 | Cell isolation |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma-Aldrich | C2920 | Fluorespirometry |
| Cell strainers | Fisher Scientific | 22-363-548 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
| CD14 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Cell isolation |
| CD3 Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-101 | Cell isolation |
| DatLab | Oroboros | Version 8 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141 | Fluorespirometry |
| D-Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Mir05 buffer |
| Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E4378 | Mir05 buffer |
| Filter Set AmR | Oroboros | 44321-01 | |
| HBSS (10x) | Gibco | 12060-040 | |
| HEPES sodium salt | Sigma-Aldrich | H7523 | Mir05 buffer |
| Histopaque 1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Cell isolation |
| K2EDTA blood collection tubes | BD Vacutainer | 366643 | Cell isolation |
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | Mir05 buffer |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1626 | Fluorespirometry |
| L-Malic Acid | Sigma-Aldrich | M1000 | Fluorespirometry |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Cell isolation |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M9272 | Mir05 buffer |
| Multi-MACS stand and MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-301 | Cell isolation |
| O2k-Fluo Smart-Module | Oroboros | 12100-03 | |
| O2k-FluoRespirometer series J | Oroboros | 10201-03 | |
| O2k-sV-Module (0.5 chamber) | Oroboros | 11200-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | 04876 | Fluorespirometry |
| Pan T Cell Isolation Kit II, mouse | Miltenyi | 130095130 | Isolation of T-cells from mouse spleen protocol |
| Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | Mir05 buffer |
| Potassium Hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | 221473 | Mir05 buffer |
| Prism | GraphPad | Version 10 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Fluorespirometry |
| RPMI Buffer | Corning | 17-105-CV | Cell isolation |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Fluorespirometry |
| Succinate disodium salt | Sigma-Aldrich | S2378 | Fluorespirometry |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | Mir05 buffer |
| Tetramethyrhodamine methyl ester perchlorite | Sigma-Aldrich | T5428 | Fluorespirometry |
References
- Eisner, V., Picard, M., Hajnóczky, G. Mitochondrial dynamics in adaptive and maladaptive cellular stress responses. Nat Cell Biol. 20 (7), 755-765 (2018).
- Sokolova, I. Bioenergetics in environmental adaptation and stress tolerance of aquatic ectotherms: linking physiology and ecology in a multi-stressor landscape. J Exp Biol. 224, 236802 (2021).
- Buttgereit, F., Brand, M. D. A hierarchy of ATP-consuming processes in mammalian cells). Biochem J. 312, 163-167 (1995).
- Schmid, D., Burmester, G. R., Tripmacher, R., Kuhnke, A., Buttgereit, F. Bioenergetics of human peripheral blood mononuclear cell metabolism in quiescent, activated, and glucocorticoid-treated states. Biosci Rep. 20 (4), 289-302 (2000).
- Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21 (9), 1022-1033 (2020).
- Nelson, S. R., Li, A., Beck-Previs, S., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M. Imaging ATP consumption in resting skeletal muscle: One molecule at a time. Biophys J. 119 (6), 1050-1055 (2020).
- Meyrat, A., von Ballmoos, C. ATP synthesis at physiological nucleotide concentrations. Sci Rep. 9 (1), 3070 (2019).
- Gouspillou, G., et al. Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria. PLoS One. 6 (6), e20709 (2011).
- Holloway, G. P., et al. Age-associated impairments in mitochondrial ADP sensitivity contribute to redox stress in senescent human skeletal muscle. Cell Rep. 22 (11), 2837-2848 (2018).
- Pharaoh, G., Brown, J., Ranjit, R., Ungvari, Z., Van Remmen, H. Reduced adenosine diphosphate sensitivity in skeletal muscle mitochondria increases reactive oxygen species production in mouse models of aging and oxidative stress but not denervation. JCSM Rapid Commun. 4 (1), 75-89 (2021).
- Pharaoh, G., et al. The mitochondrially targeted peptide elamipretide (SS-31) improves ADP sensitivity in aged mitochondria by increasing uptake through the adenine nucleotide translocator (ANT). Geroscience. 45 (6), 3529-3548 (2023).
- Brunetta, H. S., Petrick, H. L., Vachon, B., Nunes, E. A., Holloway, G. P. Insulin rapidly increases skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity in the absence of a high lipid environment. Biochem J. 478 (13), 2539-2553 (2021).
- Brunetta, H. S., et al. Nitrate consumption preserves HFD-induced skeletal muscle mitochondrial ADP sensitivity and lysine acetylation: A potential role for SIRT1. Redox Biol. 52, 102307 (2022).
- Tyrrell, D. J., et al. Blood-cell bioenergetics are associated with physical function and inflammation in overweight/obese older adults. Exp Gerontol. 70, 84-91 (2015).
- Liepinsh, E., et al. Low-intensity exercise stimulates bioenergetics and increases fat oxidation in mitochondria of blood mononuclear cells from sedentary adults. Physiol Rep. 8 (12), e14489 (2020).
- Hedges, C. P., et al. Peripheral blood mononuclear cells do not reflect skeletal muscle mitochondrial function or adaptation to high-intensity interval training in healthy young men. J Appl Physiol. 126 (2), 454-461 (2019).
- DeConne, T. M., Muñoz, E. R., Sanjana, F., Hobson, J. C., Martens, C. R. Cardiometabolic risk factors are associated with immune cell mitochondrial respiration in humans. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 319 (2), H481-H487 (2020).
- Zhou, B., et al. Boosting NAD level suppresses inflammatory activation of PBMCs in heart failure. J Clin Invest. 130 (11), 6054-6063 (2020).
- Altintas, M. M., DiBartolo, S., Tadros, L., Samelko, B., Wasse, H. Metabolic changes in peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with end stage renal disease. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 629239 (2021).
- Pence, B. D., Yarbro, J. R. Aging impairs mitochondrial respiratory capacity in classical monocytes). Exp Gerontol. 108, 112-117 (2018).
- vander Windt, G. J. W., Chang, C. H., Pearce, E. L. Measuring bioenergetics in T Cells using a Seahorse extracellular flux analyzer. Curr Protoc Immunol. 113, 11-14 (2016).
- Chacko, B. K., et al. Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood. Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).
- Buck, M. D., et al. Mitochondrial dynamics controls T Cell fate through metabolic programming. Cell. 166 (1), 63-76 (2016).
- Quinn, K. M., et al. Metabolic characteristics of CD8. Nat Commun. 11 (1), 2857 (2020).
- Scandalis, L., et al. Skeletal muscle mitochondrial respiration and exercise intolerance in patients with heart failure with preserved ejection fraction. JAMA Cardiol. 8 (6), 575-584 (2023).
- Rausser, S., et al. Mitochondrial phenotypes in purified human immune cell subtypes and cell mixtures. Elife. 10, e70899 (2021).
- Kramer, P. A., et al. Bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets. J Vis Exp. (85), e51301 (2014).
- Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: implications for their use as bioenergetic biomarkers. Redox Biol. 2, 206-210 (2014).
- Teodoro, J. S., Machado, I. F., Castela, A. C., Rolo, A. P., Palmeira, C. M. The evaluation of mitochondrial membrane potential using fluorescent dyes or a membrane-permeable cation (TPP+) electrode in isolated mitochondria and intact cells. Methods Mol Biol. 2184, 197-213 (2020).
- Hassan, H., Zakaria, F., Makpol, S., Karim, N. A. A link between mitochondrial dysregulation and idiopathic autism spectrum disorder (ASD): Alterations in mitochondrial respiratory capacity and membrane potential. Curr Issues Mol Biol. 43 (3), 2238-2252 (2021).
- Williams, A. S., et al. Disruption of Acetyl-Lysine turnover in muscle mitochondria promotes insulin resistance and redox stress without overt respiratory dysfunction. Cell Metab. 31 (1), 131-147 (2020).
- Krumschnabel, G., Eigentler, A., Fasching, M., Gnaiger, E. Use of safranin for the assessment of mitochondrial membrane potential by high-resolution respirometry and fluorometry. Methods Enzymol. 542, 163-181 (2014).
- Chowdhury, S. R., Djordjevic, J., Albensi, B. C., Fernyhough, P. Simultaneous evaluation of substrate-dependent oxygen consumption rates and mitochondrial membrane potential by TMRM and safranin in cortical mitochondria. Biosci Rep. 36 (1), 00286 (2015).
- Vianello, C., et al. High-throughput microscopy analysis of mitochondrial membrane potential in 2D and 3D models. Cells. 12 (7), (2023).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).
- JoVE, Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , (2023).
- Geltink, R. I. K., Kyle, R. L., Pearce, E. L. Unraveling the complex interplay between T cell metabolism and function. Annu Rev Immunol. 36, 461-488 (2018).
- Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. J Clin Invest. 123 (10), 4479-4488 (2013).
- Gerriets, V. A., et al. Foxp3 and Toll-like receptor signaling balance T. Nat Immunol. 17 (12), 1459-1466 (2016).
- MacIver, N. J., Michalek, R. D., Rathmell, J. C. Metabolic regulation of T lymphocytes. Annu Rev Immunol. 31, 259-283 (2013).
- Desdín-Micó, G., et al. T cells with dysfunctional mitochondria induce multimorbidity and premature senescence. Science. 368 (6497), 1371-1376 (2020).
- Yang, R., et al. Mitochondrial Ca2+ and membrane potential, an alternative pathway for Interleukin 6 to regulate CD4 cell effector function. Elife. 4, 06376 (2015).
- Straub, R. H., Cutolo, M., Buttgereit, F., Pongratz, G. Energy regulation and neuroendocrine-immune control in chronic inflammatory diseases. J Intern Med. 267 (6), 543-560 (2010).
