Toegang tot vroege differentiatie van virusspecifieke folliculaire helper CD4+ T-cel in acute LCMV-geïnfecteerde muizen
Summary
De huidige studie toont protocollen voor het beoordelen van de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen en het manipuleren van genexpressie in deze cellen.
Abstract
Folliculaire Helper T (TFH)-cellen worden gezien als een onafhankelijke CD4+ T-cellijn die verwante B-cellen helpt bij het produceren van antilichamen met hoge affiniteit, waardoor langdurige humorale immuniteit tot stand wordt gebracht. Tijdens acute virale infectie wordt de lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen bepaald in de vroege infectiefase, en onderzoeken naar de vroeg gedifferentieerde TFH-cellen zijn cruciaal om T-celafhankelijke humorale immuniteit te begrijpen en het vaccinontwerp te optimaliseren. In de studie, met behulp van een muismodel van acute lymfatische choriomeningitis virus (LCMV) infectie en de TCR-transgene SMARTA (SM) muis met CD4+ T-cellen die specifiek LCMV-glycoproteïne-epitoop I-AbGP66-77 herkennen, hebben we procedures beschreven om toegang te krijgen tot de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen op basis van flowcytometriekleuringen. Bovendien worden, door gebruik te maken van retrovirale transductie van SM CD4+ T-cellen, ook methoden geboden om genexpressie in vroeg gedifferentieerde virusspecifieke TFH-cellen te manipuleren. Daarom zullen deze methoden helpen bij studies die de mechanismen onderzoeken die ten grondslag liggen aan de vroege binding van virusspecifieke TFH-cellen .
Introduction
Naïeve CD4+ T-cellen komen verschillende ziekteverwekkers of bedreigingen tegen en passen hun immuunresponsen aan door te differentiëren in verschillende helper T (TH) celsubsets met gespecialiseerde functies1. In het scenario van acute virale infectie differentieert een groot deel van de naïeve CD4+ T-cellen tot folliculaire helper T (TFH) -cellen die hulp bieden aan B-cellen 2,3. In tegenstelling tot andere CD4+ TH-celsubsets (bijv. TH1, TH2, TH9 en TH17-cellen), brengen TFH-cellen een aanzienlijk niveau van CXCR5 tot expressie, de chemokinereceptor voor de B-cel homing chemokine CXCL13, waardoor TFH-cellen kunnen migreren naar B-celfollikels. In de B-celfollikels helpen TFH-cellen verwante B-cellen bij het initiëren en onderhouden van kiemcentrumreacties, waardoor een snelle productie van antilichamen met hoge affiniteit en humoraal geheugen op lange termijn mogelijk wordt 2,3.
Bij acute virale infectie vindt de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen plaats binnen 72 uur 4,5 en wordt gecontroleerd door de transcriptionele repressor B-cellymfoom-6 (Bcl-6)5,6,7,8, die fungeert als de “hoofdregulator” die de lotsbeslissingen van TFH-cellen regelt. Deficiëntie van Bcl-6 verzwakt de differentiatie van TFH-cellen ernstig, terwijl ectopische expressie van Bcl-6 de lotsverbintenis van TFH-cellen aanzienlijk bevordert. Naast Bcl-6 zijn meerdere moleculen betrokken bij het instrueren van vroege lotsverbintenis van TFH-cellen. Transcriptiefactoren TCF-1 en LEF-1 initiëren TFH-celdifferentiatie via de inductie van Bcl-6 9,10,11. De remming van Blimp1, door zowel Bcl-6 als TCF-1, is vereist voor een vroege lotsverbintenis van TFH-cellen 11,12. STAT1 en STAT3 zijn ook nodig voor vroege TFH-celdifferentiatie 13. Bovendien helpen epigenetische modificaties door histonmethyltransferase EZH214,15 en m6A-methyltransferase METTL316 om transcriptieprogramma’s van TFH-cellen (vooral Bcl6 en Tcf7) te stabiliseren en zo de vroege lotsverbintenis van TFH-cellen te stimuleren. Hoewel er vooruitgang is geboekt, waaronder de bovengenoemde moleculen en andere, die elders zijn samengevat3, in het begrijpen van de transcriptionele en epigenetische regulaties van vroege lotsverbintenis van TFH-cellen, moeten voorheen onbekende moleculen nog worden geleerd.
In het muismodel van acute lymfatische choriomeningitis virus (LCMV) -infectie, ondergaan adoptief overgedragen congene TCR-transgene SMARTA (SM) CD4+ T-cellen, die specifiek het LCMV-glycoproteïne-epitoop I-AbGP66-77 herkennen, ofwel TFH– of TH1-celdifferentiatie tijdens virale infectie. Dit TFH/TH 1bifurcatiedifferentiatiepatroon ondersteunt de vooruitgang van het SM/acute LCMV-infectiemodel bij het bestuderen van de biologie van virusspecifieke TFH-cellen. Het SM/acute LCMV-infectiemodel is inderdaad op grote schaal gebruikt in het onderzoeksveld van TFH-cellen en heeft een cruciale rol gespeeld bij baanbrekende ontdekkingen in de biologie van TFH-cellen. Dit omvat de identificatie van het eerder genoemde Bcl-6 als de afstammingsbepalende transcriptiefactor van TFH-cellen 5,6, evenals andere belangrijke transcriptionele factoren (bijv. Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 en Itch19) die de differentiatie van TFH-cellen, posttranscriptionele regelgeving ( bijv. METTL316 en miR-17~9220) van T FH-celdifferentiatie, TFH-celgeheugen en plasticiteit21,22, en rationele vaccinatiestrategieën gericht op TFH-cellen (bijv. selenium23).
De huidige studie beschrijft reproduceerbare methoden om toegang te krijgen tot de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen , waaronder (1) het opzetten van een acuut LCMV-geïnfecteerd SM-chimaera-muismodel dat geschikt is voor toegang tot vroeg gedifferentieerde TFH-cellen , (2) het uitvoeren van flowcytometriekleuringen van moleculen die verband houden met vroeg gedifferentieerde TFH-cellen , en (3) het uitvoeren van retrovirale vectorgebaseerde genmanipulatie in SM CD4+ T-cellen. Deze methoden zullen nuttig zijn voor studies die de vroege lotsverbintenis van virusspecifieke TFH-cellen onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het onderzoek op het gebied van TFH-cellen is benadrukt sinds de ontdekking van de gespecialiseerde functie van TFH-cellen bij het helpen van B-cellen. Cumulatieve studies gaven aan dat TFH-celdifferentiatie een meerfasig en multifactorieel proces is30, waarbij de lotsverbintenis van TFH-cellen in het vroege stadium5 wordt bepaald. Daarom is een beter begrip van de mechanismen die ten grondslag liggen aan vroeg gedifferentieerde T…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 32300785 tot X.C.), het China National Postdoctoral Program for Innovative Talents (nr. BX20230449 aan X.C.), en het National Science and Technology Major Project (nr. 2021YFC2300602 aan L.Y.).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA | Beyotime | P0099-500mL | |
| 70 μm cell strainer | Merck | CLS431751 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1) | Biolegend | 127812 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20) | Biolegend | 110724 | 1:200 dilution |
| APC anti-mouse CD25 (clone PC61) | Biolegend | 101910 | 1:200 dilution |
| B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BeaverBeads Streptavidin | Beaver | 22321-10 | |
| Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) | Biolegend | 123106 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418) | Biolegend | 117304 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136) | Biolegend | 108704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119) | Biolegend | 116204 | 1:200 dilution |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma | A7906 | |
| Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10) | Biolegend | 644816 | 1:100 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12) | Biolegend | 135220 | 1:200 dilution |
| C57BL/6J (B6) mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CXCR5-GFP knock-in reporter mouse | In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5. | ||
| DMEM 10% medium | DMEM medium containing 10% FBS | ||
| DMEM medium | Gibco | 11885092 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| FACSFortesa | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum, FBS | Sigma | F8318 | |
| FlowJo (version 10.4.0) | BD Biosciences | ||
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer. |
| Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated | Vector laboratories | BA-9400-1.5 | 1:200 dilution |
| Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | ||
| Isolation buffer | FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV) | Chinese Peptide Company | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | 1:200 dilution |
| MigR1 | addgene | #27490 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985070 | |
| pCL-Eco | addgene | #12371 | |
| PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3) | Biolegend | 104508 | 1:200 dilution |
| PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91) | BD Biosciences | 561522 | 1:50 dilution |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010072 | |
| Polybrene | Solarbio | H8761 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8) | BD Biosciences | 551961 | 1:50 dilution |
| Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5) | Biolegend | 100538 | 1:200 dilution |
| recombinant murine IL-2 | Gibco | 212-12-1MG | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Beyotime | C3702-500mL | |
| RPMI 1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI 2% | RPMI 1640 medium containing 2% FBS | ||
| SMARTA (SM) TCR transgenic mouse | SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450). | ||
| Staining buffer | PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3 | ||
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | 1:200 dilution |
| TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Cell signaling technology | 6444S | 1:400 dilution |
| TFH cell staining buffer | FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum | ||
| TransIT-293 reagent | Mirus Bio | MIRUMIR2700 |
References
- O’shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
- Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
- Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
- Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
- Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
- Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
- Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
- Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
- Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452 (2018).
- Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333 (2021).
- Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
- Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
- Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
- Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
- Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
- Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
- Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
- Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
- Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961 (2021).
- Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196 (2020).
- Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
- Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931 (2021).
- He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
- Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762 (2022).
- Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).
