Доступ к ранней дифференцировке вирус-специфических фолликулярных хелперных CD4+ Т-клеток у острых LCMV-инфицированных мышей
Summary
В текущем исследовании представлены протоколы для оценки ранней судьбы вирус-специфических клеток TFH и манипулирования экспрессией генов в этих клетках.
Abstract
Фолликулярные хелперные Т-клетки (TFH) воспринимаются как независимая линия CD4+ Т-клеток, которая помогает родственным В-клеткам вырабатывать высокоаффинные антитела, тем самым устанавливая долгосрочный гуморальный иммунитет. Во время острой вирусной инфекции приверженность к судьбе вирус-специфических Т-клетокСГ определяется на ранней фазе инфекции, и исследования раннедифференцированных клетокТ-СГ имеют решающее значение для понимания Т-клеточного гуморального иммунитета и оптимизации дизайна вакцины. В исследовании, используя мышиную модель инфекции, вызванной вирусом острого лимфоцитарного хориоменингита (LCMV), и мышь TCR-трансгенную SMARTA (SM) с CD4+ Т-клетками, специфически распознающими эпитоп гликопротеина LCMV I-ABGP 66-77, мы описали процедуры доступа к ранней судьбе вирус-специфических клеток TFH на основе окрашивания проточной цитометрией. Кроме того, использование ретровирусной трансдукции SM CD4+ Т-клеток также позволяет использовать методы манипулирования экспрессией генов в раннедифференцированных вирус-специфических клетках TFH. Следовательно, эти методы помогут в исследованиях, изучающих механизм(ы), лежащие в основе раннего связывания вирус-специфическихТ-FH-клеток.
Introduction
Сталкиваясь с различными патогенами или угрозами, наивные CD4+ Т-клетки адаптируют свои иммунные реакции путем дифференцировки в различные субпопуляции Т-хелперных Т(Т-H) клеток со специализированными функциями1. При острой вирусной инфекции большая часть наивных CD4+ Т-клеток дифференцируется в фолликулярные хелперные Т-клетки (TFH), которые оказывают помощь В-клеткам 2,3. В отличие от других субпопуляций CD4+ TH-клеток (например, клеток TH1, TH2, TH9 и TH17), клетки TFH экспрессируют значительный уровень CXCR5, который является хемокиновым рецептором для В-клеток, хоутингующих хемокин CXCL13, что позволяет клеткам TFH мигрировать в фолликулы В-клеток. В фолликулах В-клетокТ-клетки FH помогают родственным В-клеткам инициировать и поддерживать реакции зародышевого центра, тем самым обеспечивая быструю выработку высокоаффинных антител и долговременную гуморальную память 2,3.
При острой вирусной инфекции ранняя фиксация в судьбе вирусспецифических Т-клетокСГ происходит в течение 72 ч 4,5 и контролируется транскрипционным репрессором В-клеточной лимфомой-6 (Bcl-6)5,6,7,8, который действует как «главный регулятор», определяющий решения о судьбеТ-СГ. Дефицит Bcl-6 сильно притупляет дифференцировку клеток TFH, в то время как эктопическая экспрессия Bcl-6 существенно способствует приверженности судьбе клеток TFH. В дополнение к Bcl-6, несколько молекул участвуют в инструктаже ранней фиксации судьбы клеток TFH. Факторы транскрипции TCF-1 и LEF-1 инициируют дифференцировку клеток TFH путем индукции Bcl-6 9,10,11. Ингибирование Blimp1 как Bcl-6, так и TCF-1 требуется для ранней фиксации судьбы клетокT FH 11,12. STAT1 и STAT3 также необходимы для ранней дифференцировки клеток TFH 13. Кроме того, эпигенетические модификации гистонметилтрансферазой EZH214,15 и m6A метилтрансферазой METTL316 помогают стабилизировать транскрипционные программы клетокT-FH (особенно Bcl6 и Tcf7) и, таким образом, обеспечить раннюю приверженность судьбе клетокT-FH. Несмотря на то, что были достигнуты успехи, в том числе в отношении вышеупомянутых молекул и других, обобщенных в другом месте3, в понимании транскрипционной и эпигенетической регуляции ранней судьбы клетокТ-СГ, ранее неизвестные молекулы еще предстоит изучить.
В мышиной модели инфекции вируса острого лимфоцитарного хориоменингита (LCMV) адоптивно перенесенные TCR-трансгенные SMARTA (SM) CD4+ Т-клетки, которые специфически распознают эпитоп гликопротеина LCMV I-AbGP66-77, подвергаются дифференцировке клеток TFH или TH1во время вирусной инфекции. Эта модель бифуркационной дифференцировки TFH/TH1 способствует продвижению модели SM/острой инфекции LCMV в изучении биологии вирус-специфических клеток TFH. Действительно, модель СМ/острой инфекции LCMV широко использовалась в области исследований клетокТ-СГ и сыграла решающую роль в знаковых открытиях в биологии клетокТ-СГ. Это включает в себя идентификацию вышеупомянутого Bcl-6 в качестве определяющего линию фактора транскрипции клеток TFH 5,6, а также других важных транскрипционных факторов (например, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 и Itch19), регулирующих дифференцировку клетокT FH, посттранскрипционную регуляцию ( например, METTL316 и miR-17~9220) дифференцировки клеток TFH, памяти и пластичности клеток TFH 21,22, а также рациональных стратегий вакцинации, нацеленных на клетки TFH (например, селен23).
В настоящем исследовании описаны воспроизводимые методы получения доступа к ранней судьбе вирус-специфическихТ-СГ-клеток , включая (1) создание острой модели мыши-химеры, инфицированной LCMV, пригодной для доступа к раннедифференцированнымТ-СГ-клеткам , (2) проведение проточной цитометрии окрашивания молекул, связанных с ранними дифференцированнымиТ-СГ, и (3) выполнение манипуляций с генами на основе ретровирусного вектора в SM CD4+ Т-клетки. Эти методы будут полезны для исследований, изучающих раннюю судьбу вирус-специфическихТ-клеток FH .
Protocol
Representative Results
Discussion
Исследования в областиТ-клеток СГ получили широкое распространение с момента открытия специализированной функцииТ-клеток СГ в оказании помощи В-клеткам. Накапливающиеся исследования показали, что дифференцировка клеток TFH является многоступенчатым и многофакторны…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Национального фонда естественных наук Китая (No 32300785 до X.C.), Китайской национальной программы постдокторантуры для инновационных талантов (No 100). BX20230449 в X.C.) и Национальный крупный проект в области науки и техники (No 2021YFC2300602 в Лос-Анджелес).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA | Beyotime | P0099-500mL | |
| 70 μm cell strainer | Merck | CLS431751 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1) | Biolegend | 127812 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20) | Biolegend | 110724 | 1:200 dilution |
| APC anti-mouse CD25 (clone PC61) | Biolegend | 101910 | 1:200 dilution |
| B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BeaverBeads Streptavidin | Beaver | 22321-10 | |
| Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) | Biolegend | 123106 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418) | Biolegend | 117304 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136) | Biolegend | 108704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119) | Biolegend | 116204 | 1:200 dilution |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma | A7906 | |
| Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10) | Biolegend | 644816 | 1:100 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12) | Biolegend | 135220 | 1:200 dilution |
| C57BL/6J (B6) mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CXCR5-GFP knock-in reporter mouse | In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5. | ||
| DMEM 10% medium | DMEM medium containing 10% FBS | ||
| DMEM medium | Gibco | 11885092 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| FACSFortesa | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum, FBS | Sigma | F8318 | |
| FlowJo (version 10.4.0) | BD Biosciences | ||
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer. |
| Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated | Vector laboratories | BA-9400-1.5 | 1:200 dilution |
| Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | ||
| Isolation buffer | FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV) | Chinese Peptide Company | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | 1:200 dilution |
| MigR1 | addgene | #27490 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985070 | |
| pCL-Eco | addgene | #12371 | |
| PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3) | Biolegend | 104508 | 1:200 dilution |
| PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91) | BD Biosciences | 561522 | 1:50 dilution |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010072 | |
| Polybrene | Solarbio | H8761 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8) | BD Biosciences | 551961 | 1:50 dilution |
| Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5) | Biolegend | 100538 | 1:200 dilution |
| recombinant murine IL-2 | Gibco | 212-12-1MG | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Beyotime | C3702-500mL | |
| RPMI 1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI 2% | RPMI 1640 medium containing 2% FBS | ||
| SMARTA (SM) TCR transgenic mouse | SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450). | ||
| Staining buffer | PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3 | ||
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | 1:200 dilution |
| TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Cell signaling technology | 6444S | 1:400 dilution |
| TFH cell staining buffer | FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum | ||
| TransIT-293 reagent | Mirus Bio | MIRUMIR2700 |
References
- O’shea, J. J., Paul, W. E. Mechanisms underlying lineage commitment and plasticity of helper CD4+ T cells. Science. 327 (5969), 1098-1102 (2010).
- Crotty, S. T follicular helper cell biology: A decade of discovery and diseases. Immunity. 50 (5), 1132-1148 (2019).
- Vinuesa, C. G., Linterman, M. A., Yu, D., Maclennan, I. C. Follicular helper t cells. Annu Rev Immunol. 34, 335-368 (2016).
- Choi, Y. S., et al. ICOS receptor instructs T follicular helper cell versus effector cell differentiation via induction of the transcriptional repressor bcl6. Immunity. 34 (6), 932-946 (2011).
- Choi, Y. S., et al. Bcl6 expressing follicular helper CD4 T cells are fate committed early and have the capacity to form memory. J Immunol. 190 (8), 4014-4026 (2013).
- Johnston, R. J., et al. Bcl6 and BLIMP-1 are reciprocal and antagonistic regulators of T follicular helper cell differentiation. Science. 325 (5943), 1006-1010 (2009).
- Nurieva, R. I., et al. Bcl6 mediates the development of T follicular helper cells. Science. 325 (5943), 1001-1005 (2009).
- Yu, D., et al. The transcriptional repressor bcl-6 directs T follicular helper cell lineage commitment. Immunity. 31 (3), 457-468 (2009).
- Choi, Y. S., et al. LEF1 and TCF1 orchestrate T(FH) differentiation by regulating differentiation circuits upstream of the transcriptional repressor bcl6. Nat Immunol. 16 (9), 980-990 (2015).
- Wu, T., et al. TCF1 is required for the t follicular helper cell response to viral infection. Cell Rep. 12 (12), 2099-2110 (2015).
- Xu, L., et al. The transcription factor TCF-1 initiates the differentiation of T(FH) cells during acute viral infection. Nat Immunol. 16 (9), 991-999 (2015).
- Oestreich, K. J., Mohn, S. E., Weinmann, A. S. Molecular mechanisms that control the expression and activity of bcl-6 in th1 cells to regulate flexibility with a TFH-like gene profile. Nat Immunol. 13 (4), 405-411 (2012).
- Choi, Y. S., Eto, D., Yang, J. A., Lao, C., Crotty, S. Cutting edge: STAT1 is required for IL-6-mediated bcl6 induction for early follicular helper cell differentiation. J Immunol. 190 (7), 3049-3053 (2013).
- Chen, X., et al. The histone methyltransferase ezh2 primes the early differentiation of follicular helper T cells during acute viral infection. Cell Mol Immunol. 17 (3), 247-260 (2020).
- Li, F., et al. Ezh2 programs T(FH) differentiation by integrating phosphorylation-dependent activation of bcl6 and polycomb-dependent repression of p19ARF. Nat Commun. 9 (1), 5452 (2018).
- Yao, Y., et al. METTL3-dependent m(6)A modification programs T follicular helper cell differentiation. Nat Commun. 12 (1), 1333 (2021).
- Johnston, R. J., Choi, Y. S., Diamond, J., Yang, J. A., Crotty, S. STAT5 is a potent negative regulator of TFH cell differentiation. J Exp Med. 209 (2), 243-250 (2012).
- Lee, J. Y., et al. The transcription factor KLF2 restrains CD4+ T follicular helper cell differentiation. Immunity. 42 (2), 252-264 (2015).
- Xiao, N., et al. The e3 ubiquitin ligase itch is required for the differentiation of follicular helper t cells. Nat Immunol. 15 (7), 657-666 (2014).
- Baumjohann, D., et al. The microRNA cluster mir-17~92 promotes TFH cell differentiation and represses subset-inappropriate gene expression. Nat Immunol. 14 (8), 840-848 (2013).
- Wang, Y., et al. The kinase complex mTORC2 promotes the longevity of virus-specific memory CD4(+) T cells by preventing ferroptosis. Nat Immunol. 23 (2), 303-317 (2022).
- Hale, J. S., et al. Distinct memory CD4+ T cells with commitment to T follicular helper- and T helper 1-cell lineages are generated after acute viral infection. Immunity. 38 (4), 805-817 (2013).
- Yao, Y., et al. Selenium-GPX4 axis protects follicular helper t cells from ferroptosis. Nat Immunol. 22 (9), 1127-1139 (2021).
- Oxenius, A., Bachmann, M. F., Zinkernagel, R. M., Hengartner, H. Virus-specific MHC-class II-restricted TCR-transgenic mice: Effects on humoral and cellular immune responses after viral infection. Eur J Immunol. 28 (1), 390-400 (1998).
- Grosjean, C., et al. Isolation and enrichment of mouse splenic t cells for ex vivo and in vivo T cell receptor stimulation assays. STAR Protoc. 2 (4), 100961 (2021).
- Dowling, P., et al. Protocol for the bottom-up proteomic analysis of mouse spleen. STAR Protoc. 1 (3), 100196 (2020).
- Choi, Y. S., Crotty, S. Retroviral vector expression in TCR transgenic CD4+ T cells. Methods Mol Biol. 1291, 49-61 (2015).
- Wu, D., et al. A method for expansion and retroviral transduction of mouse regulatory T cells. J Immunol Methods. 488, 112931 (2021).
- He, R., et al. Follicular CXCR5- expressing CD8(+) T cells curtail chronic viral infection. Nature. 537 (7620), 412-428 (2016).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annu Rev Immunol. 29, 621-663 (2011).
- Breitfeld, D., et al. Follicular B helper T cells express CXC chemokine receptor 5, localize to B cell follicles, and support immunoglobulin production. J Exp Med. 192 (11), 1545-1552 (2000).
- Xu, L., et al. The kinase mTORC1 promotes the generation and suppressive function of follicular regulatory t cells. Immunity. 47 (3), 538-551 (2017).
- Chen, X., et al. The phosphatase pten links platelets with immune regulatory functions of mouse T follicular helper cells. Nat Commun. 13 (1), 2762 (2022).
- Chen, J. S., et al. Flow cytometric identification of T(fh)13 cells in mouse and human. J Allergy Clin Immunol. 147 (2), 470-483 (2021).
