Accesso alla differenziazione precoce della cellula T CD4+ helper follicolare virus-specifica nei topi acuti con infezione da LCMV
Summary
L’attuale studio mostra protocolli per valutare l’impegno precoce del destino delle cellule TFH specifiche del virus e manipolare l’espressione genica in queste cellule.
Abstract
Le cellule T helper follicolari (TFH) sono percepite come una linea di cellule T CD4+ indipendente che aiuta le cellule B affini a produrre anticorpi ad alta affinità, stabilendo così un’immunità umorale a lungo termine. Durante l’infezione virale acuta, l’impegno del destino delle cellule TFH specifiche del virus è determinato nella fase iniziale dell’infezione e le indagini sulle cellule TFH differenziate precocemente sono cruciali per comprendere l’immunità umorale dipendente dalle cellule T e ottimizzare la progettazione del vaccino. Nello studio, utilizzando un modello murino di infezione da virus della coriomeningite linfocitica acuta (LCMV) e il topo TCR-transgenico SMARTA (SM) con cellule T CD4+ che riconoscono specificamente l’epitopo della glicoproteina LCMV I-AbGP66-77, abbiamo descritto le procedure per accedere all’impegno precoce del destino delle cellule TFH specifiche del virus sulla base di colorazioni con citometria a flusso. Inoltre, sfruttando la trasduzione retrovirale delle cellule T CD4+ SM, vengono forniti anche metodi per manipolare l’espressione genica nelle celluleT FH virus-specifiche differenziate precocemente. Pertanto, questi metodi aiuteranno negli studi che esplorano i meccanismi alla base dell’impegno precoce delle cellule TFH specifiche del virus.
Introduction
Incontrando diversi agenti patogeni o minacce, le cellule T CD4+ naive adattano le loro risposte immunitarie differenziandosi in vari sottogruppi di cellule T helper (TH) con funzioni specializzate1. Nello scenario di infezione virale acuta, gran parte delle cellule T CD4+ naive si differenziano in cellule T helper follicolari (TFH) che forniscono aiuto alle cellule B 2,3. Distinte da altri sottogruppi di cellule TH CD4+ (ad esempio, cellule TH1, TH2, TH9 e TH17), le cellule TFH esprimono un livello sostanziale di CXCR5, che è il recettore delle chemochine per la chemochina CXCL13 che indirizza le cellule B, consentendo alle cellule TFH di migrare nei follicoli delle cellule B. Nei follicoli delle cellule B, le cellule TFH aiutano le cellule B affini nell’avvio e nel mantenimento delle reazioni del centro germinale, consentendo così una rapida produzione di anticorpi ad alta affinità e una memoria umorale a lungo termine 2,3.
In caso di infezione virale acuta, l’impegno precoce del destino delle cellule TFH virus-specifiche avviene entro 72 ore 4,5 ed è controllato dal repressore trascrizionale del linfoma-6 a cellule B (Bcl-6)5,6,7,8, che agisce come “regolatore principale” che governa le decisioni sul destino delle cellule T FH. Il deficit di Bcl-6 attenua gravemente la differenziazione delle cellule TFH, mentre l’espressione ectopica di Bcl-6 promuove sostanzialmente l’impegno del destino delle cellule TFH. Oltre a Bcl-6, diverse molecole sono coinvolte nell’istruire l’impegno precoce del destino delle cellule TFH. I fattori di trascrizione TCF-1 e LEF-1 avviano la differenziazione delle cellule TFH attraverso l’induzione di Bcl-6 9,10,11. L’inibizione di Blimp1, sia da parte di Bcl-6 che di TCF-1, è necessaria per l’impegno precoce del destino delle cellule TFH 11,12. STAT1 e STAT3 sono necessari anche per la differenziazione precoce delle cellule TFH 13. Inoltre, le modificazioni epigenetiche da parte dell’istone metiltransferasi EZH214,15 e della m6A metiltransferasi METTL316 aiutano a stabilizzare i programmi trascrizionali delle cellule TFH (in particolare Bcl6 e Tcf7) e quindi a innescare l’impegno precoce del destino delle cellule TFH. Mentre i progressi, comprese le molecole sopra menzionate e altre, riassunte altrove3, sono stati fatti nella comprensione delle regolazioni trascrizionali ed epigenetiche dell’impegno precoce del destino delle cellule TFH, molecole precedentemente sconosciute rimangono da imparare.
Nel modello murino di infezione da virus della coriomeningite linfocitica acuta (LCMV), le cellule T CD4+ TCR-transgeniche SMARTA (SM) CD4+ congeniche trasferite in modo adottivo, che riconoscono specificamente l’epitopo della glicoproteina LCMVI-A bGP66-77, subiscono la differenziazione delle cellule TFH o TH1 durante l’infezione virale. Questo modello di differenziazione della biforcazione TFH/TH1 supporta l’avanzamento del modello di infezione SM/LCMV acuta nello studio della biologia delle cellule TFH virus-specifiche. Infatti, il modello di infezione SM/LCMV acuta è stato ampiamente utilizzato nel campo della ricerca sulle cellule TFH e ha svolto un ruolo cruciale nelle scoperte fondamentali nella biologia delle cellule TFH. Ciò include l’identificazione del già citato Bcl-6 come fattore di trascrizione che definisce il lignaggio delle cellule TFH 5,6, nonché altri importanti fattori trascrizionali (ad esempio, Blimp-16, TCF-1/LEF 9,10,11, STAT1/STAT313, STAT517, KLF218 e Itch19) che guidano la differenziazione delle cellule T FH, le regolazioni post-trascrizionali ( ad esempio, METTL316 e miR-17~9220) della differenziazione delle cellule TFH, della memoria e della plasticità delle cellule TFH 21,22 e delle strategie di vaccinazione razionali mirate alle cellule TFH (ad esempio, il selenio23).
Il presente studio descrive metodi riproducibili per accedere all’impegno del destino precoce delle cellule TFH specifiche del virus, tra cui (1) la creazione di un modello murino di chimera SM acuta infettato da LCMV adatto per l’accesso alle cellule TFH differenziate precocemente, (2) l’esecuzione di colorazioni con citometria a flusso di molecole correlate alle celluleT FH differenziate precocemente e (3) l’esecuzione di manipolazioni geniche basate su vettori retrovirali in SM CD4+ Cellule T. Questi metodi saranno utili per gli studi che indagano l’impegno precoce del destino delle cellule TFH virus-specifiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
La ricerca nel campo delle cellule TFH è stata evidenziata sin dalla scoperta della funzione specializzata delle cellule TFH nell’aiutare le cellule B. Studi accumulati hanno indicato che la differenziazione delle cellule TFH è un processo multistadio e multifattoriale30, in cui l’impegno del destino delle cellule TFH è determinato nella fase iniziale5. Pertanto, una migliore comprensione dei meccanismi alla base delle cellule …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (dal n. 32300785 al X.C.), del China National Postdoctoral Program for Innovative Talents (n. BX20230449 a X.C.) e il National Science and Technology Major Project (n. 2021YFC2300602 a L.Y.).
Materials
| 0.25% Trypsin-EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 4% Paraformaldehyde Fix Solution, 4% PFA | Beyotime | P0099-500mL | |
| 70 μm cell strainer | Merck | CLS431751 | |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse TCR Vα2 (clone B20.1) | Biolegend | 127812 | 1:200 dilution |
| Alexa Fluor 700 anti-mouse CD45.1 (clone A20) | Biolegend | 110724 | 1:200 dilution |
| APC anti-mouse CD25 (clone PC61) | Biolegend | 101910 | 1:200 dilution |
| B6 CD45.1 (B6.SJL-Ptprca Pepcb/BoyJ) mouse | The Jackson Laboratory | 002014 | |
| BeaverBeads Streptavidin | Beaver | 22321-10 | |
| Biotin anti-mouse F4/80 Antibody (clone BM8) | Biolegend | 123106 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse CD11c (clone N418) | Biolegend | 117304 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD19 (clone 6D5) | Biolegend | 115504 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-Mouse CD8a (clone 53-6.7) | Biolegend | 100704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse NK-1.1 (clone PK136) | Biolegend | 108704 | 1:200 dilution |
| Biotin Rat anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (clone TER-119) | Biolegend | 116204 | 1:200 dilution |
| bovine serum albumin, BSA | Sigma | A7906 | |
| Brilliant Violet 421 anti-T-bet (clone 4B10) | Biolegend | 644816 | 1:100 dilution |
| Brilliant Violet 605 anti-mouse CD279 (PD-1) (clone 29F.1A12) | Biolegend | 135220 | 1:200 dilution |
| C57BL/6J (B6) mouse | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| CXCR5-GFP knock-in reporter mouse | In house; the CXCR5-GFP knock-in mouse line was generated by the insertion of an IRES-GFP construct after the open reading frame of Cxcr5. | ||
| DMEM 10% medium | DMEM medium containing 10% FBS | ||
| DMEM medium | Gibco | 11885092 | |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| FACSFortesa | BD Biosciences | ||
| Fetal bovine serum, FBS | Sigma | F8318 | |
| FlowJo (version 10.4.0) | BD Biosciences | ||
| Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set | Invitrogen | 00-5523-00 | The kit contains three reagents: a. Fixation/Permeabilization Concentrate (4X); b. Fixation / Permeabilization Diluent; c. Permeabilization Buffer. |
| Goat Anti-Rat IgG Antibody (H+L), Biotinylated | Vector laboratories | BA-9400-1.5 | 1:200 dilution |
| Invitrogen EVOS FL Auto Cell Imaging System | ThermoFisher Scientific | ||
| Isolation buffer | FACS buffer containing 0.5% BSA and 2mM EDTA | ||
| LCMV GP61-77 peptide (GLKGPDIYKGVYQFKSV) | Chinese Peptide Company | ||
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit, for 633 or 635 nm excitation | Life Technologies | L10199 | 1:200 dilution |
| MigR1 | addgene | #27490 | |
| NaN3 | Sigma | S2002 | |
| Opti-MEM medium | Gibco | 31985070 | |
| pCL-Eco | addgene | #12371 | |
| PE anti-mouse CD69 (clone H1.2F3) | Biolegend | 104508 | 1:200 dilution |
| PE Mouse anti-Bcl-6 (clone K112-91) | BD Biosciences | 561522 | 1:50 dilution |
| Phosphate buffered saline, PBS | Gibco | 10010072 | |
| Polybrene | Solarbio | H8761 | |
| Purified Rat Anti-Mouse CXCR5 (clone 2G8) | BD Biosciences | 551961 | 1:50 dilution |
| Rat monoclonal PerCP anti-mouse CD4 (clone RM4-5) | Biolegend | 100538 | 1:200 dilution |
| recombinant murine IL-2 | Gibco | 212-12-1MG | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | Beyotime | C3702-500mL | |
| RPMI 1640 medium | Sigma | R8758 | |
| RPMI 2% | RPMI 1640 medium containing 2% FBS | ||
| SMARTA (SM) TCR transgenic mouse | SM TCR transgenic line in our lab is a gift from Dr. Rafi Ahmed (Emory University). Additionally, this mouse line can also be obtained from The Jackson Laboratory (stain#: 030450). | ||
| Staining buffer | PBS containing 2% FBS and 0.01% NaN3 | ||
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | 1:200 dilution |
| TCF1/TCF7 (C63D9) Rabbit mAb (Alexa Fluor 488 Conjugate) | Cell signaling technology | 6444S | 1:400 dilution |
| TFH cell staining buffer | FACS buffer containing 1% BSA and 2% mouse serum | ||
| TransIT-293 reagent | Mirus Bio | MIRUMIR2700 |
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