단일 땅콩(Arachis spp.)의 아플라톡신 및 스틸베노이드 파이토알렉신의 비파괴 SPE-UPLC 기반 정량화 씨앗

1. 곰팡이 도전을 위한 씨앗 준비 아플라톡시겐 Aspergillus flavus NRRL 3357을 Potato Dextrose Agar (PDA)의 경사면에 30 ° C에서 6 일 동안 시험관에 배양합니다. Tween 20(증류수 1L에 Tween 100μL)을 사용하여 물 10mL로 시험관에서 곰팡이 포자를 채취하고 깔때기에 놓인 유리솜을 통해 여과한 다음 사용 설명서를 참조하여 혈구계로 포자를 계산합니다. 포자 현탁액을 멸균수로 1,000 포자/μL 농도로 희석합니다. 혈구계로 농도를 확인합니다.알림: 도전적인 실험 2시간 전에 포자 현탁액을 준비하십시오. 땅콩 꼬투리를 부드럽게 깨고 껍질을 제거합니다. 씨앗의 부피가 비커 부피의 1/5을 초과하지 않도록 씨앗을 멸균 비커에 넣고 비커 부피의 약 70%에 0.05% 과산화수소 용액을 첨가한 다음 씨앗이 3시간 동안 물을 흡수하도록 합니다. 씨앗에서 과산화수소 용액을 디캔팅하고 3% 에탄올-물 혼합물(v/v)의 약 80배를 비커에 추가하여 씨앗을 덮습니다. 1분 동안 그대로 둔 다음 동일한 양의 멸균 증류수로 씨앗을 2번 헹굽니다. 에탄올로 멸균된 씨앗과 함께 비커에 3% 과산화수소를 5배 부피로 넣고 5분 동안 그대로 둔 다음 액체를 디캔팅하고 동일한 양의 멸균수로 씨앗을 두 번 헹굽니다(그림 2A). 그림 2: 아플라톡신 및 식물성 알렉신 분획의 접종, 배양 및 추출을 위한 땅콩 종자의 준비. (A) 3% 과산화수소로 흡수된 씨앗을 살균하는 단계; (B) 종자에서 고환(피부)을 제거하는 단계; (C) 배아축부를 절단하는 단계; 드릴 비트가 있는 반 자엽의 시추 캐비티; (F) 씨앗의 뚫린 부분을 한천에 놓는 단계; (G) 천공된 캐비티에 곰팡이 포자를 적용하는 단계. (H) 부화 후 씨앗이있는 페트리 접시; (I) 배양된 단일 종자(대조군 샘플의 사진)를 강화된 비드 튜브에 넣는 단계; (J) 측정된 양의 추출 용매를 첨가하는 단계; (K) 비드 파열기에서 샘플을 분쇄하는 단계; (L) 분쇄 슬러리의 원심 분리. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 멸균 종이 타월에 씨앗을 놓고 집게로 씨앗 고환을 제거한 다음 메스로 배아 축을 포함하는 씨앗의 약 1/3을 자릅니다(그림 2B, C). 씨앗의 이 부분을 버리거나 성장 배지가 있는 시험관에서 식물을 키우는 데 사용하십시오(그림 1B,E). 씨앗의 나머지 부분을 두 개의 자엽으로 나누어 페트리 접시에 넣고 씨앗 부분을 축축한 멸균 여과지로 덮고 탈수를 방지하기 위해 뚜껑을 교체하고 즉시 접종 단계를 진행합니다. 도전적인 실험을 수행하기 전에 1.5% 멸균 한천 26mL를 물에 넣어 100 x 15mm 접시에 붓고 밤새 응고되도록 종자 배양 배지로 충분한 수의 페트리 접시를 준비합니다. 남아 있는 각 자엽의 바깥쪽 중앙에 1.5-2mm 직경의 멸균 날카로운 드릴 비트로 씨앗을 수동으로 뚫어 2-2mm 깊이의 구멍을 만듭니다. 캐비티를 만드는 데 ~2-5초가 걸립니다(그림 2D,E). 씨앗의 4-6 개의 “드릴”조각을 한천이있는 페트리 접시에 넣고 1,000 포자 / μL 현탁액 중 2 μL를 10 μL 피펫터로 각 반 자엽 조각의 드릴 구멍에 적용합니다. 포자 현탁액 대신 멸균수를 대조군 종자에 적용합니다(그림 2F,G). 모든 페트리 접시를 뚜껑으로 덮고 빛 없이 30°C에서 72시간 동안 배양합니다. 2. 아플라톡신 및 식물성 알렉신 분석을위한 배양 종자 조각의 샘플링 및 준비 집게로 한천에서 씨앗 조각을 제거하고 각각을 13개의 지르코늄 세라믹 비드(직경 2.8mm 12개 및 직경 6.5mm 1개)가 있는 라벨이 부착된 7mL 비드 바이알에 넣어 72시간 내에 종자 조각을 수집합니다(그림 2H,I).참고: 이 시점에서 즉시 처리하지 않으면 바이알을 -80°C 냉동고에 넣고 추가 처리 전에 최대 2개월 동안 보관할 수 있습니다. Phytoalexins와 아플라톡신은 동일한 종자 추출물에서 결정됩니다. 추출을 위해 시각적 종자 크기(소형, 중형 또는 대형)에 따라 정밀하게 측정된 메탄올-물 혼합물(90:10, v/v) 2 또는 4mL를 비드 바이알에 추가하고 45초 동안 5.5m/sec로 분쇄합니다. 분쇄된 씨앗이 있는 바이알을 원심분리기에 넣고 1,860× g 의 원심분리기에 3분 동안 넣습니다(그림 2J – L).참고: 레스베라트롤, 아라키딘-1, 아라키딘-2, 아라키딘-3, 3′-이소펜타디에닐-3,5,4′-트리하이드록시스틸벤(IPD) 및 SB-1과 같은 중요한17,22 스틸베노이드 유도체가 측정됩니다(모두 트랜스 구성). 아플라톡신 분석의 경우 도전적인 실험을 실행하기 전에 다음과 같이 충분한 수의 클린업 컬럼을 준비합니다. 90o 각도로 절단된 유리 막대를 사용하여 일치하는 폴리에틸렌 다공성(20μL) 프릿을 1.5mL 폴리프로필렌 기둥에 넣습니다. 마그네슘 실리카겔 50mg(100-200 메쉬)을 맞춤형 스쿱으로 컬럼에 넣고 유리 막대로 밀어 동일한 프릿으로 컬럼을 캡을 씌웁니다(그림 3A – E).참고: 이 양의 마그네슘 실리카겔은 75μL의 부피를 차지하며 흡착층의 높이는 3mm입니다. 그림 3: 클린업 컬럼 및 필터 준비. (A,B) 다공성 프릿을 배럴에 넣는 단계; (C, D) 마그네슘 실리카겔로 배럴을 채우는 것; (E) 흡착제를 포장하고 상부 다공성 프릿을 배럴에 삽입하는 단계. (F) 파스퇴르 피펫 위에 직경 11.5mm 유리 섬유 원을 놓습니다. (지,H) 플라스틱 또는 나무 막대로 원의 중심을 파스퇴르 피펫 배럴의 바닥까지 밀어 넣고 유리 섬유를 단단히 압축합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 이 시점에서 그림 3F – H와 같이 일치하는 수의 맞춤형 필터를 준비합니다. 아플라톡신 분석의 경우 상층액의 최대 0.5mL 분취액(2.2단계에서 설명한 대로 얻음)을 정밀하게 측정하고 이를 맞춤형 포장 미니컬럼으로 옮기고 추출물이 중력에 의해 4mL 유리 바이알로 배출되도록 합니다. 1.0mL의 메탄올-물(90:10, v/v) 혼합물을 컬럼으로 옮겨 중력에 의해 불순물을 씻어내고 동일한 4mL 바이알에 넣습니다(그림 4A). 그림 4: 종자 추출물의 정제 및 UPLC 분석을 위한 준비. (A) 채워진 컬럼이 있는 랙. (B) 세척 컬럼에서 용출된 정제된 추출물과 함께 6개의 4mL 바이알에서N2 가스로 증발하는 용매. (C) 4mL 바이알에 주입 용매(MeOH-H2O 9:1, v/v)를 첨가하기 전과 후에 얼음과 함께 거품 용기(1 및 2)에 바이알과 필터를 영하의 온도로 가져옵니다. (D) 4mL 바이알에서 400μL 자동시료주입기 바이알로 냉각된 추출물을 여과합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 결합된 엘루에이트는 버립니다. 1.2mL 아세톤-아세토니트릴-물-88% 포름산(65:31:3.5:0.5, v/v) 혼합물이 있는 깨끗한 4mL 유리 바이알에 중력에 의해 아플라톡신 분획을 용리합니다(그림 4A). 또는 2.0mL의 아세토 니트릴 – 물 -88 % 포름산 (96 : 3.5 : 0.5, v / v) 혼합물로 컬럼에서 아플라톡신을 용출하고 최대 2 μL의 용리액의 부분 표본을 초고성능 액체 크로마토 그래피 (UPLC) 시스템에 직접 주입합니다 (N2 로 용매를 증발시키지 않음).참고 :이 경우 아플라톡신에 대한 정량 한계가 최대 10 배 낮을 것으로 예상됩니다. 대부분의 경우에서 도전적인 종자의 아플라톡신 농도가 종종 높기 때문에 감도의 이러한 하락이 허용됩니다. 45°C에서 가열된 블록에서N2 의 흐름으로 바이알로부터 용매를 제거한다. 바이알의 뚜껑을 닫고 다음 단계에서 추가되는 용매의 증발을 최소화하기 위해 30-45초 동안 분쇄된 얼음이 담긴 용기에 넣습니다. 맞춤형 필터를 일회용 시험관에 넣고 튜브를 다른 용기의 얼음에 삽입하여 여과 시 용매의 증발을 최소화합니다(그림 4B, C). 용매를 증발시킨 후 건조 잔류물을 정밀하게 측정된 0.25-1.0mL의 메탄올-물 혼합물(90:10, v/v)에 용해시키고 1-2초 동안 소용돌이에 넣습니다. 정제된 추출물이 담긴 바이알을 UPLC 자동시료주입기에 넣고 0.1 – 3.0 μL를 UPLC 시스템에 주입합니다(그림 5A,B).알림: 와류 후 용액에 일부 부유 입자가 있는 것으로 의심되는 경우 냉각된 필터를 통해 용액을 여과합니다(그림 4D). 그림 5: 정제된 추출물의 UPLC 분석 과정 및 결과. (A) 정제된 시료 추출물이 있는 랙을 UPLC 자동 시료 주입기에 넣습니다. (B) 기기 분석 수행, 데이터 수집 및 결과 해석. (C) 4 가지 주요 아플라톡신의 UPLC; 관심있는 주요 피크, 아플라톡신 B1 및 B2 는 각각 0.04 및 0.004 ng를 나타냅니다. (D) 아플라톡신 B1 및 B2의 UPLC; 피크 2는 2pg 수준(8μL 플로우 셀 포함)에서 아플라톡신 B1 을 나타냅니다. (E) 야생 아라키스 종의 현지 땅콩 밭에서 수확한 종자의 정제된 추출물의 UPLC. (F) 염기성 산화알루미늄 미니컬럼으로 정제한 도전적인 땅콩 종자 추출물의 UPLC. (G) Florisil 컬럼으로 정제된 도전받은 땅콩 종자 추출물의 UPLC; 블루 크로마토그램은 1mL의 메탄올-물(90:10 V/V) 혼합물로 컬럼에서 세척된 불순물을 표시합니다. 검은 색 크로마토 그램은 아플라톡신 M1 및 B1의 피크를 보여줍니다. 아플라톡신 B1 의 수준은 48 ng / g입니다. (H) 도전적인 종자에서 땅콩 스틸베노이드의 전형적인 크로마토그램; 약어: IPD = 3′-이소펜타디에닐-3,5,4′-트리하이드록시스틸벤. 참고: 종자 추출물의 모든 스틸베노이드는 트랜스 구성입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.  파이토알렉신 분석을 위해 각 비드 바이알에서 200μL의 상층액을 위의 파스퇴르 피펫 필터로 옮깁니다. 압축 질소 탱크의 N2 가스를 사용하여 400 μL UPLC 자동 시료 주입기 바이알로 여과를 촉진하고 PTFE 격막이 있는 일치하는 캡으로 바이알을 캡합니다(그림 4D). 3. 아플라톡신 분석 종자 추출물에서 아플라톡신의 분리를 위해, 자동 시료 주입기, 4 차 펌프, 형광 검출기, UPLC BEH C18 3.0 mm x 100 mm, 일치하는 precolumn이있는 1.7 μm 컬럼 및 원래 길이의 25 %로 절단 된 표준 니트 PTFE 코일 0.25 내경이있는 포스트 컬럼 광화학 반응기 (PHRED)가 장착 된 UPLC 시스템을 사용하십시오.참고: 저자가 사용하는 UPLC 기기 및 관련 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다. 물 (A), 메탄올 (B) 및 아세토 니트릴 (C)을 다음 그래디언트에서 사용하십시오 : 초기 조건, 62.7 % A, 24 % B, 13.3 % C, 3.75 분 내에 30 % A, 45 % B, 25 % C로 선형 변경, 3.751 분 동안 0 % A, 64.4 % B, 35.6 % C로 변경, 3.249 분 동안 등용매를 유지 한 다음 0.01 분 내에 초기 조건으로 변경하고 다음 주입 전에 2.499 분 동안 등용매를 유지했습니다. 유속을 0.45mL/분으로 설정하고 실행 시간을 9.5분으로 설정합니다. 시스템 컬럼 히터에서 컬럼을 40°C로 유지합니다. 362 nm와 440 nm를 여기 및 방출 파장으로 각각 아플라톡신 B1, B2, G1, G2 및 M1 정량화에 사용하십시오. 주요 아플라톡신의 구조는 그림 6A에 나와 있습니다.참고 : 실험 조건에서, 아플라톡신 B1 및 B2 만 A. flavus NRRL 3357에 의해 생성 될 것으로 예상됩니다. A. parasiticus 균주가 종자 도전에 사용되는 경우, 아플라톡신 B1, B2, G1 및 G2 의 생산이 예상됩니다. 소프트웨어 사용자 설명서에 설명 된대로 해당 정품 표준 (교정 곡선)의 피크 영역을 참조하여 아플라톡신의 농도를 결정하십시오.참고 : UPLC 절차는 형광 검출기의 고감도 설정에서 기준선 노이즈를 나타내기 때문에 아플라톡신에 대한 검출 한계 (LOD) 및 정량 한계 (LOQ)는 LOD의 경우 3 : 1, LOQ의 경우 10 : 1의 널리 사용되는 신호 대 잡음 비율을 사용하여 평가됩니다. 섹션 2 및 3에 설명 된 땅콩 종자 분석을위한 일상적인 실험 설정에서 아플라톡신 G1 및 B1 에 대한 정량 한계는 아플라톡신 G2 및 B2 에 대해 각각 0.8 및 0.08 ng / g보다 작거나 같을 것으로 예상됩니다. 4. 스틸베노이드 파이토알렉신 분석 스틸베노이드를 분리하기 위해 물(A), 메탄올(B) 및 88% 포름산(C)을 다음 그래디언트에서 사용하십시오: 초기 조건, 53% A, 42% B, 5% C, 2.0분 내에 35% A, 60% B, 5% C로 선형 변경, 4분 동안 등용매 유지, 0.5분 동안 0% A, 95% B, 5% C로 변경, 2.5분 동안 등용매 유지, 그런 다음 0.1 분 내에 초기 조건으로 변경하고 다음 주입 전에 2.9 분 동안 등용매를 유지했습니다. 유속을 0.5mL/분으로 설정하고 실행 시간을 12.0분으로 설정합니다. 소프트웨어 사용자 설명서에 설명된 대로 해당 실제 표준물질(보정 곡선)의 피크 면적 및/또는 게시된 몰 소멸 계수를 참조하여 스틸베노이드의 농도를 결정합니다. 주요 스틸벤 유래 피토알렉신의 구조는 그림 6B에 나와 있습니다.참고: 파이토알렉신의 분리는 동일한 시스템을 사용하여 이루어지지만 형광 검출기와 PHRED 반응기 없이 이루어집니다. 대신, 다이오드 어레이 검출기는 땅콩 스틸베노이드의 검출 및 정량화에 사용됩니다. 주요 스틸베노이드 파이토알렉신에 대한 정량 한계(LOQ)는 스틸베노이드 농도가 동일한 추출물에서 아플라톡신의 농도를 몇 자릿수만큼 초과하기 때문에 실질적인 의미가 없습니다. 배양 3일 후, 스틸베노이드는 신뢰성 있게 정량화됩니다.