Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (<i>Arachis</i> spp.) Seeds

Victor S Sobolev; Renee S Arias; Alicia N Massa; Travis E Walk; Valerie A Orner; Marshall C Lamb

doi:10.3791/66574

JoVE Journal > Biochemistry

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Biochemistry

כימות מבוסס SPEP-UPLC לא הרסני של אפלטוקסינים ופיטואלכסינים סטילבנואידים בבוטנים בודדים (Arachis spp.) זרעים

Published: April 19, 2024

doi:

10.3791/66574

Victor S Sobolev¹, Renee S Arias¹, Alicia N Massa¹, Travis E Walk¹, Valerie A Orner¹, Marshall C Lamb¹

¹National Peanut Research Laboratory, Agricultural Research Service,U.S. Department of Agriculture

Summary

אנו מדגימים שיטת תפוקה בינונית לכימות של אפלטוקסינים ופיטואלכסינים סטילבנואידים בזרעי בוטנים בודדים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים מעולים. שיטה זו פותחה במיוחד לניתוח של מיני ארכיס בר המאותגרים על ידי מיני אספרגילוס אפלטוקסיגניים.

Abstract

אפלטוקסינים הם מטבוליטים משניים מסרטנים מאוד של כמה מינים פטרייתיים, במיוחד Aspergillus flavus. אפלטוקסינים מזהמים לעתים קרובות סחורות חקלאיות בעלות חשיבות כלכלית, כולל בוטנים, ומהווים סיכון גבוה לבריאות האדם ובעלי החיים. בשל הבסיס הגנטי הצר, זני בוטנים מפגינים עמידות מוגבלת לפתוגנים פטרייתיים. לכן, מינים רבים של בוטנים פראיים עם סובלנות אספרגילוס קיבלו התייחסות משמעותית על ידי מדענים כמקורות עמידות למחלות.

חקר חיידקי צמחים לעמידות לאפלטוקסינים קשה מכיוון שהצטברות אפלטוקסין אינה עוקבת אחר התפלגות נורמלית, המכתיבה את הצורך בניתוח של אלפי זרעי בוטנים בודדים. זרעי בוטנים מיובשים במידה מספקת (Arachis spp.), כאשר הם נגועים בזני אספרגילוס , מסוגלים לייצר סטילבנים פעילים ביולוגית (סטילבנואידים) הנחשבים לפיטואלקסינים הגנתיים. סטילבנים בוטנים מעכבים התפתחות פטרייתית וייצור אפלטוקסין. לכן, חיוני לנתח את אותם זרעים עבור סטילבנואידים בוטנים כדי להסביר את אופי ההתנגדות / רגישות זרעים לפלישת אספרגילוס . אף אחת מהשיטות שפורסמו אינה מציעה ניתוח של זרעים בודדים עבור אפלטוקסינים ו / או פיטואלקסין סטילבן.

ניסינו למלא את הביקוש לשיטה כזו, ידידותית לסביבה, משתמשת בחומרים מתכלים זולים, רגישה וסלקטיבית. בנוסף, השיטה אינה הרסנית מכיוון שהיא משתמשת רק במחצית הזרע ומשאירה את החצי השני המכיל את הציר העוברי שלם. טכניקה כזו מאפשרת נביטה וצמיחה של צמח הבוטנים לבגרות מלאה מאותו זרע המשמש לניתוח אפלטוקסין וסטילבנואידים. החלק המשולב של שיטה זו, האתגר הידני של הזרעים עם אספרגילוס, הוא צעד מגביל הדורש יותר זמן ועבודה בהשוואה לשלבים אחרים בשיטה. השיטה שימשה לחקר חיידקי ארכיס פראיים כדי לזהות מינים עמידים לאספרגילוס ולקבוע ולאפיין מקורות חדשים של עמידות גנטית לפתוגן פטרייתי זה.

Introduction

בוטנים (Arachis hypogaea L.) הוא אחד מגידולי המזון העיקריים בעולם. הוא מעובד ביותר מ -100 מדינות עם הייצור הכולל עולה על 45 מיליון טון¹. סחורות חקלאיות, כגון בוטנים, תירס וזרעי כותנה פולשות לעתים קרובות על ידי מינים של אספרגילוס, פטריות שנולדו באדמה ומייצרות אפלטוקסינים². סחורות אלה רגישות במיוחד לזיהום אפלטוקסין לפני הקציר כאשר תנאי הסביבה מאופיינים בטמפרטורות גבוהות ובצורת. אפלטוקסינים הם בין המסרטנים החזקים ביותר הידועים³. הם מזהמים רבע מהסחורות החקלאיות בעולם⁴ וגורמים לכמחצית מאוכלוסיית העולם להיחשף באופן כרוני לאפלטוקסינים⁵. בשל הקרצינוגניות הגבוהה והרעילות שלהם, נוכחות אפלטוקסין במזון מוסדרת בגבולות הנמוכים ביותר המקובלים כמעט ברוב מדינות העולם⁶.

האיחוד האירופי (EU) חוקק רמה מקסימלית של 2 ננוגרם/גרם עבור אפלטוקסין B₁ ו-4 ננוגרם/גרם עבור סך כל האפלטוקסינים (B₁, B₂, G₁ ו-G₂) במוצרים למאכל אדם⁷. מגבלות נמוכות כאלה מפעילות לחץ משמעותי על החקלאות ועל תעשיית המזון המעבדת סחורות מזוהמות באפלטוקסינים. ניטור אפלטוקסין ועיבוד מחדש של בוטנים מזוהמים עשויים להיחשב כאסטרטגיה פסיבית ויקרה למניעת כניסה של אפלטוקסינים לשרשרת המזון. זו הסיבה שכל המגזרים העיקריים של תעשיית הבוטנים חווים הפסדי רווח עצומים עקב זיהום אפלטוקסין של זני בוטנים הנוכחיים שלעתים קרובות מפגינים עמידות מוגבלת למחלות פטרייתיות. גישה פרוספקטיבית לפתרון בעיית אפלטוקסין היא להשיג זני בוטנים עמידים לפטריות באמצעות אינטרוגרסיה גנטית, כלומר, העברת מידע גנטי ממיני בוטנים עמידים לזנים מובחרים. בשנים האחרונות ^8,9, מיני בוטנים פראיים קיבלו התייחסות משמעותית כמקורות לעמידות למחלות גנטיות מכיוון שהבסיס הגנטי הצר של בוטנים מתורבתים אינו יכול עוד לספק את רמת תכונות העמידות הנדרשת לצמח הבוטנים^10,11. הפנמה מוצלחת של מיני בוטנים פראיים דורשת ניתוח של אלפי זרעים בודדים קטנים ונדירים (איור 1A) ¹².

איור 1: תרשים זרימה של ניתוח זרעים בודדים. (A) גודל השוואתי של זני בוטנים שונים מסוג שוק לעומת Arachis spp. (1) וירג’יניה; (2) רץ; (3) ספרדית; (4) Arachis spp. (B) Wild Arachis spp. (צלחת A, זרע 4) חתוך לשלושה חלקים, (5) חצי זרע עם ציר עוברי; חלק זה של הזרע משמש לגידול צמח (E). (C) חלקים (6) ו-(7) נקדחים עם מקדח ו-(D) מחוסנים בנבגי פטריות. לאחר דגירה במשך 72 שעות ב 30 ° C, אחד מחלקי הזרע, (6) או (7) משמש לניתוח aflatoxin ו phytoalexin, ואחר משמש עבור ריצוף RNA/transcriptome. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

עמידות בוטנים לפתוגנים פטרייתיים קשורה קשר הדוק עם phytoalexins 13,14,15,16,17. פיטואלכסינים בוטנים מיוצגים על ידי סטילבנואידים מיקרוביאליים המסונתזים ביולוגית ומצטברים ברקמות הצמח לאחר חשיפה לגירויים אקסוגניים, במיוחד לפלישה פטרייתית 16,17,18. הצטברות מהירה של ריכוזים מספיקים של פיטואלקסינים באתר הפלישה הפטרייתית מעכבת את צמיחת הפטריות והיא קריטית להגנת הצומח ^19,20,21. הפתוגן מפסיק לגדול כאשר פיטואלכסינים מצטברים לריכוזים מעכבים^16,22. תפקידם של סטילבנואידים כתרכובות הגנה נגד פטריות אפלטוקסיגניות בבוטנים הוערך לפני יותר מ-30 שנה בניסויי שדה¹³. ניסויים אלה תמכו בבירור בהשערה כי סטילבנואידים בוטנים הם גורם התנגדות מכריע בזיהום אפלטוקסין לפני הקציר. ראיות כאלה מבוססות על העובדות שסטילבנים מיוצרים באופן טבעי בבוטנים שניזוקו בשדה; סטילבנים מפגינים פעילות ביולוגית ניכרת נגד פטריות אפלטוקסיגניות; וזיהום אפלטוקסין בזרעים זוהה רק כאשר בוטנים איבדו את היכולת לסינתזה של פיטואלכסין עקב התייבשות זרעים כתוצאה מיובש. סדרה נוספת של ניסויי שדה אישרו את הקשר בין ייצור פיטואלקסין ועמידות גנוטיפ בוטנים למחלות בוטנים חשובות מבחינה חקלאית¹⁷.

הבנה טובה יותר של המנגנון הטבעי המבוסס על פיטואלכסין של עמידות בוטנים לפלישה פטרייתית היא אסטרטגיה מבטיחה לשליטה בזיהום אפלטוקסין^15,17.לכן, בנוסף לניתוחי אפלטוקסין, חשוב לנתח כמותית את אותם זרעים עבור phytoalexins. למרות שמנגנון עמידות זה אינו נחקר ומובן במלואו, הוא חיוני לגידול ושינוי גנטי של צמחי בוטנים עבור זנים חדשים עמידים לפטריות²³. למרות קיומם של הליכים אנליטיים שונים לקביעת אפלטוקסין בסחורות שונות, עדיין יש צורך בשיטות פשוטות למחקר ספציפי, במיוחד כאשר שיטות מסורתיות אינן מספקות דרישות אנליטיות וחסכוניות. שיטות הניקוי המודרניות ביותר המשמשות את תעשיית הבוטנים, החקלאות והמעבדות הפרטיות הן מכשירים מבוססי נוגדנים²⁴ ו-^{immunoassay 25,26,27}. הם סלקטיביים ורגישים, אך יקרים משמעותית ממיני-טורים עמוסים בחומרים סופחים נפוצים. בנוסף, אף אחת מהשיטות הללו לא תוכננה לניתוח של דגימות מעטות במשקל מיליגרם. בהתבסס על המחקר הקודם שלנו על השימוש האנליטי בג’ל מגנזיום סיליקה (Florisil)²⁸, שינינו הליך זה כך שיתאים לצרכים של תוכניות טרום רבייה ורבייה מתמשכות ופוטנציאליות.

מטרת עבודה זו הייתה לפתח שיטה לא הרסנית, בעלת תפוקה בינונית וידידותית לסביבה לקביעה כמותית של אפלטוקסינים ופיטוקסינים בזרעי בוטנים בודדים. שיטה כזו פותחה. היתרונות שלה על פני שיטות שפורסמו הם רגישות גבוהה יותר, היכולת לנתח aflatoxins ו phytoalexins בתמצית זרע יחיד, חוסר הצורך לשקול דגימות, ועלות נמוכה יותר הודות כמויות קטנות יותר של מתכלים. תרשים הזרימה של השיטה המשולבת מוצג באיור 1. הניתוחים הגנטיים והשלבים האחרים מוזכרים בטקסט זה ומודגמים באיור כדי להראות את חשיבות השיטה המוצעת וכיצד היא משולבת בהליך כולו.

Protocol

1. הכנת זרעים לאתגר פטרייתי לדגור את Aspergillus flavus NRRL 3357 aflatoxigenic על שיפוע של תפוח אדמה דקסטרוז אגר (PDA) במבחנה במשך 6 ימים ב 30 ° C. קצרו נבגי פטריות מהמבחנה עם 10 מ”ל מים עם טווין 20 (100 מיקרוליטר טווין ב 1 ליטר מים סטריליים מזוקקים), סננו דרך צמר זכוכית שהונח במשפך וספרו את הנבגים עם המוציטומטר המתייחס למדריך למשתמש. יש לדלל את תרחיף הנבגים במים סטריליים לריכוז של 1,000 נבגים/μL. אשר את הריכוז עם המוציטומטר.הערה: הכינו את מתלה הנבגים לא לפני שעתיים לפני הניסויים המאתגרים. לפצח בעדינות את תרמילי בוטנים ולהסיר את הקליפות. מניחים את הזרעים בכד סטרילי כך שנפח הזרעים לא יעלה על 1/5 מנפח הכד, מוסיפים 0.05% תמיסת מי חמצן לכ-70% מנפח הכד, ומאפשרים לזרעים לספוג מים במשך 3 שעות. רוקנו את תמיסת מי החמצן מהזרעים והוסיפו בערך פי 3 מהכמות של תערובת אתנול-מים (V/V) של 80% כדי לכסות את הזרעים. אפשר לעמוד במשך דקה אחת ולאחר מכן לשטוף את הזרעים 2x עם כמויות שוות של מים מזוקקים סטריליים. הוסיפו לכוס נפח של 3% מי חמצן פי 5 עם הזרעים המעוקרים באתנול ואפשרו להם לעמוד במשך 5 דקות, ואז רוקנו את הנוזל ושטפו את הזרעים פעמיים עם כמויות שוות של מים סטריליים (איור 2A). איור 2: הכנת זרעי בוטנים לחיסון, דגירה ומיצוי של שברי אפלטוקסין ופיטואלכסין. (A) עיקור זרעים טבולים במי חמצן 3%; (ב) הסרת טסטה (עור) מזרעים; (ג) חיתוך חלק הציר העוברי; (D,E) חלל קידוח בחצי קוטילדון עם מקדח; (ו) הנחת חלקי זרעים קדוחים על אגר; (G) מריחת נבגי פטריות לתוך החלל הקדוח. (H) צלחת פטרי עם זרעים לאחר הדגירה; (I) הנחת זרעים בודדים מודגרים (צילום דגימות ביקורת) לתוך צינורות חרוזים מחוזקים; (י) הוספת נפח מדוד של מיצוי ממס; (יא) כתישת דגימות בקרע חרוזים; (L) צנטריפוגה של תרחיף כתוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הניחו את הזרעים על מגבת נייר סטרילית, הסירו את טסטה הזרעים בעזרת מלקחיים, וחתכו כ-1/3 מהזרע המכיל את הציר העוברי בעזרת אזמל (איור 2B,C). השליכו את החלק הזה של הזרע או השתמשו בו כדי לגדל צמח במבחנה עם מדיום צמיחה (איור 1B,E). מפצלים את החלק הנותר של הזרע לשני קוטילדונים, מניחים אותם בצלחת פטרי, מכסים את חלקי הזרעים בנייר סינון סטרילי לח, מחליפים את המכסה כדי למנוע התייבשות וממשיכים מיד לשלב החיסון. לפני ביצוע הניסויים המאתגרים, הכינו כמות מספקת של צלחות פטרי עם מדיום דגירה של זרעים על ידי שפיכת 26 מ”ל של אגר סטרילי 1.5% במים לתוך הכלים בגודל 100X15 מ”מ ואפשרו להם להתמצק למשך הלילה. באמצע הצד החיצוני של כל קוטילדון שנותר, צור חלל בעומק 1.5-2 מ”מ על ידי קידוח ידני של הזרע עם מקדח סטרילי חד בקוטר 1.6-2.34 מ”מ. נדרשות ~2-5 שניות כדי ליצור חלל (איור 2D,E). מניחים 4 עד 6 חתיכות “קדוחות” של הזרעים לתוך צלחת פטרי עם אגר ולהחיל 2 μL מתוך 1,000 נבגים / μL תרחיף לתוך החלל הקדוח של כל חתיכת חצי cotyledon עם צינור 10 μL. במקום תרחיף הנבגים, מרחו מים סטריליים על זרעי הבקרה (איור 2F,G). מכסים את כל צלחות הפטרי במכסים ודגרים בטמפרטורה של 30°C ללא אור למשך 72 שעות. 2. דגימה והכנה של חתיכות זרעים מודגרים עבור ניתוח aflatoxin ו phytoalexin אספו חתיכות זרעים במהירות של 72 שעות על-ידי הסרתן מהאגר בעזרת מלקחיים והנחתן בבקבוקוני חרוזים מסומנים של 7 מ”ל עם 13 חרוזי קרמיקה זירקוניום (12 בקוטר 2.8 מ”מ ו-1 בקוטר 6.5 מ”מ) (איור 2H,I).הערה: בשלב זה, אם לא מעבדים אותם מיד, ניתן להכניס את הבקבוקונים למקפיא בטמפרטורה של -80°C ולשמור אותם עד חודשיים לפני עיבוד נוסף. Phytoalexins ו aflatoxins נקבעים באותה תמצית זרעים. למיצוי, בהתאם לגודל הזרעים החזותי (קטן, בינוני או גדול), הוסיפו 2 או 4 מ”ל של תערובת מתנול-מים שנמדדה במדויק (90:10, v/v) לבקבוקוני החרוזים וכתשו במהירות של 5.5 מ’ לשנייה למשך 45 שניות. הכניסו את הבקבוקונים עם הזרעים המרוסקים לצנטריפוגה ולצנטריפוגה במשקל של 1,860 × למשך 3 דקות (איור 2J – L).הערה:17,22 הנגזרות הסטילבנואידיות החשובות הבאות נקבעות (כולן בתצורת טרנס): רסברטרול, ארכידין-1, ארכידין-2, ארכידין-3, 3′-איזופנטדיאניל-3,5,4′-טריהידרוקסיסטילבן (IPD) ו-SB-1. עבור ניתוחי אפלטוקסין, לפני ביצוע הניסויים המאתגרים, הכינו מספר מספיק של עמודות ניקוי כדלקמן. מניחים פוליאתילן נקבובי תואם (20 μL) frit לתוך עמוד פוליפרופילן 1.5 מ”ל בעזרת מוט זכוכית לחתוך בזווית 90o . הכניסו 50 מ”ג של ג’ל מגנזיום סיליקה (100-200 רשת) לתוך העמוד בעזרת כף מדידה בהתאמה אישית, וכסו את העמוד עם חלק זהה על-ידי דחיפתו כלפי מטה בעזרת מוט זכוכית (איור 3A – E).הערה: כמות זו של ג’ל סיליקה מגנזיום תופסת נפח 75 μL, ואת גובה שכבת adsorbent הוא 3 מ”מ. איור 3: הכנת עמודות ניקוי ומסננים. (A,B) הנחת פריטה נקבובית לתוך חבית; (C,D) מילוי חבית בג’ל מגנזיום סיליקה; (E) אריזת חומר הספיגה והכנסת פריטה נקבובית עליונה לחבית. (ו) הנחת עיגול סיבי זכוכית בקוטר 11.5 מ”מ על גבי פיפטה של פסטר. (ז,ח) דוחפים את מרכז העיגול עם מוט פלסטיק או עץ לתחתית חבית פיפטת פסטר ודוחסים היטב את סיבי הזכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. בשלב זה, הכינו מספר תואם של מסננים בהתאמה אישית כפי שמוצג באיור 3F – H. עבור ניתוח אפלטוקסין, למדוד במדויק עד 0.5 מ”ל aliquot של supernatant (המתקבל כמתואר בשלב 2.2), להעביר אותו לתוך minicolumn ארוז בהתאמה אישית, ולאפשר תמצית להתנקז על ידי כוח הכבידה לתוך בקבוקון זכוכית 4 מ”ל. העבירו 1.0 מ”ל של תערובת מתנול-מים (90:10, v/v) לעמוד כדי לשטוף זיהומים באמצעות כוח הכבידה לתוך אותו בקבוקון של 4 מ”ל (איור 4A). איור 4: טיהור תמציות זרעים והכנה לניתוחי UPLC. (A) ארון תקשורת עם עמודים ארוזים. (B) אידוי ממס עם גז N2 משישה בקבוקונים של 4 מ”ל עם תמצית מטוהרת שנלקחה מעמודי ניקוי. (C) הבאת בקבוקונים ומסננים לטמפרטורה מתחת לאפס במיכלי קצף (1 ו-2) עם קרח לפני ואחרי הוספת ממס ההזרקה (MeOH-H2O 9:1, v/v) לבקבוקונים של 4 מ”ל. (D) סינון תמצית מקוררת מבקבוקון של 4 מ”ל לתוך בקבוקון דוגם אוטומטי של 400 μL. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. השליכו את האלוטות המשולבות. האטו את מקטע האפלטוקסין על ידי כוח הכבידה מהעמוד לתוך בקבוקון זכוכית נקי של 4 מ”ל עם תערובת של 1.2 מ”ל אצטון-אצטוניטריל-מים-88% חומצה פורמית (65:31:3.5:0.5, v/v) (איור 4A). לחלופין, יש למרוח אפלטוקסינים מהעמוד עם תערובת של 2.0 מ”ל אצטוניטריל-מים-88% חומצה פורמית (96:3.5:0.5, v/v), ולהזריק אליציטוט של האלואט, עד 2 μL, ישירות למערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים במיוחד (UPLC) (ללא אידוי הממס עם N2).הערה: במקרה זה, צפה למגבלת כמות נמוכה עד פי 10 עבור אפלטוקסינים; ברוב המקרים ירידה כזו של רגישות מקובלת שכן ריכוזי אפלטוקסין בזרעים מאותגרים הם לעתים קרובות גבוהים. הסר את הממס מהבקבוקונים בזרם של N2 בבלוק מחומם ב 45 מעלות צלזיוס. מכסים את הבקבוקון ומניחים אותו במיכל עם קרח כתוש למשך 30-45 שניות כדי למזער אידוי של הממס שנוסף בשלב הבא. הכניסו מסננים בהתאמה אישית למבחנות חד-פעמיות והכניסו את המבחנות לקרח במיכל אחר כדי למזער התאדות של ממס בעת סינון (איור 4B,C). לאחר אידוי הממס, יש להמיס את השאריות היבשות ב-0.25-1.0 מ”ל של תערובת מתנול-מים (90:10, v/v) ומערבולת במשך 1-2 שניות. הכניסו בקבוקונים עם תמציות מטוהרות לתוך הדוגם האוטומטי של UPLC והזריקו 0.1 עד 3.0 μL למערכת UPLC (איור 5A,B).הערה: אם התמיסה לאחר מערבולות חשודה שיש בה חלקיקים מרחפים מסוימים, סנן את התמיסה דרך המסנן המקורר (איור 4D). איור 5: התהליך והתוצאות של ניתוחי UPLC של תמציות מטוהרות. (A) הצבת ארון תקשורת עם תמציות דגימה מטוהרות בדוגמית אוטומטית של UPLC. (ב) ביצוע הניתוחים האינסטרומנטליים, קבלת נתונים ופירוש התוצאות. (C) UPLC של ארבעה אפלטוקסינים עיקריים; פסגות העניין העיקריות, אפלטוקסינים B1 ו-B2 מייצגים 0.04 ו-0.004 ננוגרם, בהתאמה. (D) UPLC של אפלטוקסינים B1 ו-B2; שיא 2 מייצג אפלטוקסין B1 ברמה של 2 pg (עם תא זרימה של 8 μL). (E) UPLC של תמצית מטוהרת של זרע שנקצר משדה בוטנים מקומי עם זן ארכיס פראי. (F) UPLC של תמצית של זרע בוטנים מאותגר מטוהר עם מיני-עמוד תחמוצת אלומיניום בסיסי. (G) UPLC של תמצית זרעי בוטנים מאותגרים מטוהרים עם עמוד פלוריסיל; כרומטוגרמה כחולה מציגה זיהומים שנשטפים מהטור עם 1 מ”ל של תערובת מתנול-מים (90: 10 V/V); כרומטוגרמה שחורה מראה פסגות של אפלטוקסינים M1 ו- B1. רמת אפלטוקסין B1 היא 48 ננוגרם/גרם. (H) כרומטוגרמה טיפוסית של סטילבנואידים בוטנים מזרע מאותגר; קיצור: IPD = 3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbene. הערה: כל הסטילבנואידים בתמציות זרעים הם בתצורת טרנס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. עבור ניתוח phytoalexin, מכל בקבוקון חרוזים, להעביר 200 μL של supernatant לתוך מסנן פיפטה פסטר לעיל. השתמשו בגז N2 ממיכל חנקן דחוס כדי לזרז את הסינון לתוך בקבוקון דוגם אוטומטי UPLC של 400 μL וסגרו את הבקבוקון עם מכסה תואם עם מחיצת PTFE (איור 4D). 3. ניתוח אפלטוקסין להפרדות של אפלטוקסינים בתמציות זרעים, השתמש במערכת UPLC המצוידת בדוגם אוטומטי, משאבה רבעונית, גלאי פלואורסצנטי, UPLC BEH C18 3.0 מ”מ x 100 מ”מ, עמוד 1.7 מיקרומטר עם קדם-עמודה תואמת, וכור פוטוכימי פוסט-טור (PHRED) עם סליל PTFE סרוג סטנדרטי בקוטר פנימי של 0.25 שנחתך ל-25% מאורכו המקורי.הערה: מכשיר UPLC והציוד המשויך המשמש את המחברים מפורטים בטבלת החומרים. השתמשו במים (A), מתנול (B) ואצטוניטריל (C) בשיפוע הבא: התנאים הראשוניים, 62.7% A, 24% B, 13.3% C, השתנו באופן ליניארי ל-30% A, 45% B, 25% C ב-3.75 דקות, השתנו ל-0% A, 64.4% B, 35.6% C ב-3.751 דקות, החזיקו איזוקרטי במשך 3.249 דקות, ואז השתנו לתנאים התחלתיים תוך 0.01 דקות והחזיקו איזוקרטי במשך 2.499 דקות לפני הזריקה הבאה. הגדר את קצב הזרימה ל- 0.45 מ”ל לדקה ואת זמן הפעולה ל- 9.5 דקות. שמור על העמוד בטמפרטורה של 40°C במחמם עמודת המערכת. השתמש ב- 362 ננומטר ו- 440 ננומטר כאורכי גל העירור והפליטה, בהתאמה, עבור אפלטוקסינים B1, B2, G1, G2 ו- M1 . המבנים של אפלטוקסינים עיקריים מוצגים באיור 6A.הערה: בתנאי הניסוי, רק אפלטוקסינים B1 ו- B2 צפויים להיות מיוצרים על ידי A. flavus NRRL 3357; אם זן A. parasiticus משמש לאתגר זרעים, צפוי ייצור של אפלטוקסינים B1, B2, G1 ו- G2 . קבע ריכוזים של אפלטוקסינים תוך התייחסות לאזורי שיא של תקנים אותנטיים תואמים (עקומת כיול) כמתואר במדריך למשתמש של התוכנה.הערה: מאחר שהליך UPLC מציג רעש בסיסי בהגדרות הרגישות הגבוהה עבור הגלאי הפלואורסצנטי, מגבלת זיהוי (LOD) ומגבלת כימות (LOQ) עבור אפלטוקסינים מוערכים באמצעות יחס אות לרעש המקובל של 3:1 עבור LOD ו- 10:1 עבור LOQ. במערך הניסוי השגרתי לניתוח זרעי בוטנים, המתואר בסעיפים 2 ו-3, גבולות הכימות עבור אפלטוקסינים G1 ו-B1 צפויים להיות קטנים או שווים ל-0.8 ו-0.08 ננוגרם/גרם עבור אפלטוקסינים G2 ו-B2, בהתאמה. 4. ניתוח פיטואלכסין סטילבנואיד להפרדת סטילבנואידים, יש להשתמש במים (A), מתנול (B) ו-88% חומצה פורמית (C) בשיפוע הבא: תנאים התחלתיים, 53% A, 42% B, 5% C, השתנו באופן ליניארי ל-35% A, 60% B, 5% C ב-2.0 דקות, הוחזקו איזוקרטיים במשך 4 דקות, השתנו ל-0% A, 95% B, 5% C ב-0.5 דקות, הוחזקו איזוקרטיים במשך 2.5 דקות, לאחר מכן השתנה לתנאים התחלתיים תוך 0.1 דקות והחזיק איזוקרטי במשך 2.9 דקות לפני הזריקה הבאה. הגדר את קצב הזרימה ל- 0.5 מ”ל לדקה ואת זמן הפעולה ל- 12.0 דקות. לקבוע ריכוזים של סטילבנואידים על ידי התייחסות לאזורי שיא של תקנים אותנטיים תואמים (עקומת כיול) ו/או למקדמים שפורסמו של הכחדות מולאריות כמתואר במדריך למשתמש של התוכנה. המבנים של פיטואלכסינים עיקריים שמקורם בסטילבן מוצגים באיור 6B.הערה: הפרדת פיטואלקסינים מושגת באמצעות אותה מערכת אך ללא גלאי פלואורסצנטי וכור PHRED. במקום זאת, גלאי מערך דיודות משמש לזיהוי וכימות של סטילבנואידים בוטנים. למגבלת הכימות (LOQ) עבור הפיטוקסינים העיקריים של סטילבנואיד אין משמעות מעשית מכיוון שריכוזי סטילבנואידים עולים על ריכוזי אפלטוקסינים באותה תמצית בכמה סדרי גודל; לאחר 3 ימים של דגירה, סטילבנואידים מכומתים באופן אמין.

Representative Results

השיטה שפותחה לכימות אפלטוקסין בזרעים היא הליבה של כל הליך ההערכה של מיני בוטנים בר לעמידות להצטברות אפלטוקסין. מיני-עמודים ומסננים ארוזים בהתאמה אישית מספקים חיסכון משמעותי ומפשטים את ההליך הכולל בשל היעדר כמויות גדולות של ממסים, מסננים מסחריים יקרים ומיותרים של 0.22 או 0.45 מיקרומטר, והתקני שאיבה. השיטה לניתוח אפלטוקסין מספקת התאוששות, דיוק ודיוק גבוהים בטווח הנבדק של 1.0-50.0 ננוגרם/גרם של אפלטוקסינים מזרעים טחונים כפי שניתן לראות בטבלה 1. דגימות מזוהמות מאוד דוללו לערך הנבדק הלינארי. איור 5C מראה הפרדה בסיסית של ארבעה אפלטוקסינים עיקריים, B1, B2, G1 ו-G2 בתוך זמן פליטה של 5 דקות, וזה מקובל מאחר שהאתגר הפטרייתי של זרעי בוטנים הוא השלב המגביל של ההליך ולא ניתוחי UPLC. השיטה המוצעת רגישה מספיק עם מגבלת כימות של 2 pg עבור אפלטוקסין B1 (איור 5D). הטוהר הגבוה של התמציות מאפשר כימות חד-משמעי של אפלטוקסינים כפי שניתן לראות ב-UPLC (איור 5E) של תמצית מטוהרת של זרעים שנקטפו משדה עם מין ארכיס פראי. שיטה29 שפורסמה קודם לכן אינה מסוגלת להשיג טוהר משביע רצון עבור זרעי בוטנים מאותגרי פטריות (איור 5F) בהשוואה לשיטה המוצעת (איור 5G). מאיור 5F ברור שלא ניתן לזהות ולכמת באופן מהימן אפלטוקסינים B2, G1 ו-G2 בשל נוכחותם של ריכוזים גבוהים של זיהומים מפריעים, שרבים מהם, המדוללים לאחר אפלטוקסינים, הם פיטואלקסינים סטילבנואידים ומטבוליטים פטרייתיים. לעומת זאת, איור 5G מדגים את היעילות הגבוהה של עמודת ג’ל מגנזיום סיליקה בהסרת זיהומים ממקטע אפלטוקסין. כרומטוגרמה כחולה מציגה זיהומים מפריעים שנשטפים מהעמוד עם 1 מ”ל של תערובת מתנול-מים (90:10); כרומטוגרמה שחורה מראה פסגות לא מוסתרות של אפלטוקסינים M1 ו- B1. כרומטוגרמה זו מייצגת תמצית של זרע בר מאותגר. רמת אפלטוקסין B1 היא 48 ננוגרם/גרם. כימות של פיטואלקסינים בוטנים הוא תוספת חשובה לאנליזות של אפלטוקסינים באותו זרע, אשר עשוי להיות זרע טבעי משדה או זרע מאותגר פטריות. איור 5H מראה כרומטוגרמה טיפוסית של סטילבנואידים הגנתי בוטנים מזרע מאותגר. הפרדת התרכובות מושגת באמצעות אותה עמודה אנליטית המשמשת לניתוחי אפלטוקסין. העמודה והתנאים הכרומטוגרפיים שנבחרו מספקים הפרדה משביעת רצון של הפסגות ומאפשרים כימות אמין של הסטילבנואידים. הערכת הקשר בין אפלטוקסין-פיטואלכסין בזרעים מאותגרים נמצאת מחוץ לתחום מצגת זו והשיטה מוצעת כאן ככלי מחקר פוטנציאלי, הנמצא בשימוש במעבדת המחברים מזה מספר שנים והוכח כשימושי. <!– Figure 1: Single-seed analysis flowchart. (A) Comparative size of different market-type peanut cultivars vs. wild Arachis spp. (1) Virginia; (2) runner; (3) Spanish; (4) wild Arachis spp. (B) Wild Arachis spp. seed 4 cut into three sections, (5) half seed with embryonic axis; this portion of the seed is used to grow a plant (E). (C) Parts (6) and (7) are drilled with a drill bit and (D) inoculated with fungal spores. After incubation for 72h at 30 oC, one of the seed parts, (6) or (7) is used for aflatoxin and phytoalexin analyses, and another is used for RNA/transcriptome sequencing. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 2: Preparation of peanut seeds for inoculation, incubation, and extraction of aflatoxin and phytoalexin fractions. (A) Sterilizing imbibed seeds with 3% hydrogen peroxide; (B) removing skins from seeds; (C) cutting off the embryonic axis part; (D,E) drilling cavity in a half cotyledon with a drill bit; (F) placing drilled parts of seeds on agar; (G) applying fungal spored into drilled cavity. (H) Petri dish with seeds after incubation; (I) placing incubated single seeds (photo of control samples) into beading vials; (J) adding measured volume of extracting solvent; (K) pulverizing samples in a bead raptor; ( L) centrifugation of pulverized slurry. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 3: Preparation of cleanup columns and filters. (A,B) Placing a porous frit into barrel; ( C,D) filling barrel with magnesium silica gel; (E) packing the adsorbent and inserting a top porous frit into barrel. (F) Placing an 11.5 mm dia. glass fiber circle on top of a Pasteur pipette. (G,H) Pushing the center of the circle with a plastic or wooden rod down to the bottom of the Pasteur pipette barrel and firmly compacting the glass fiber. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 4:Purification of seed extracts and preparation for the UPLC analyses. (A)Rack with packed columns. (B) Evaporating solvent with N2 gas from six 4 mL vials with purified extract eluted from cleanup columns. (C) Bringing vials and filters to a subzero temperature in foam containers (1 and 2) with ice before and after addition of the injection solvent (MeOH-H2O 9:1, v/v) to the 4-mL vials. (D) Filtering cooled extract from a 4-mL vial into a 400 µL autosampler vial. Please click here to view a larger version of this figure. Figure 5: The process and results of UPLC analyses of purified extracts. (A) Placing a rack with purified sample extracts into UPLC autosampler. (B) Performing the instrumental analyses, obtaining data, and interpreting results. (C) UPLC of four major aflatoxins; the major peaks of interest, aflatoxins B1 and B2 represent 0.04 and 0.004 ng, respectively. (D) UPLC of aflatoxins B1 and B2; peak 2 represents aflatoxin B1 at a 2 pg level (with an 8 µL flow sell). (E) UPLCof purified extract of a seed harvested from a local peanut field with a wild Arachis species. (F) UPLC ofthe extract of a challenged peanut seed purified with a basic aluminum oxide minicolumn. (G)UPLC of the extract of challenged peanut seed purified with a Florisil column; blue chromatogram presents impurities that are washed from the column with 1 mL of methanol-water (90:10 v/v) mixture; black chromatogram shows peaks of aflatoxins M1 and B1. The level of aflatoxin B1 is 48 ng/g. (H) Atypical chromatogram of peanut stilbenoids from a challenged seed; abbreviation: IPD = 3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbene. Note: All stilbenoids in seed extracts are in trans-configuration. Please click here to view a larger version of this figure. –> איור 6: מבנים של אפלטוקסינים עיקריים ופיטוקסינים בוטנים שמקורם בסטילבן. (A) מבנים של אפלטוקסינים עיקריים: 1, B1; 2, ב2; 3, ז1; 4, ז2. (B) מבנים של פיטואלכסין בוטנים עיקריים שמקורם בסטילבן: 6, רסברטרול; 7, ארכידין-1; 8, ארכידין-2; 9, ארכידין-3; 10, IPD (3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbene); 11, SB-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. רמת ספייקא(נג/ז) אפלטוקסינים ב1 ב2 ז1 ז2 50 85.87 (0.97) 82.33 (0.67) 86.63 (2.89) 84.01 (0.86) 5 91.43 (2.76) 87.32 (0.47) 88.08 (2.08) 87.73 (0.77) 1 81.21 (3.16) 85.33 (1.98) 81.76 (4.66) 88.46 (3.24) טבלה 1: שחזור אפלטוקסינים מזרעי בוטנים באמצעות עמודת פלורסיל ו-1.2 מ”ל של תערובת האבוטוקסין שבר אלוטיון. [ממוצע (SD), %; n = 5]. דגימות טחונות נטולות אפלטוקסין (50 גרם) של זן בוטנים 06 גרם של ג’ורג’יה הוקפצו באופן שווה בעזרת מזרק מיקרו עם תמיסת מלאי אפלטוקסין ברמה של 50, 5 או 1 ננוגרם/גרם, והושארו בטמפרטורת החדר למשך 16 שעות. רמות ספייק ניתנות עבור אפלטוקסינים B1 ו- G1; עבור aflatoxins B2 ו- G2 יש להשתמש במקדם הכפל של 0.33.

Discussion

בהתבסס על ניסיוננו הקודם²⁸, פיתחנו הליך כימי פשוט, זול, ידידותי לסביבה, המתאים לחקר אוספי חיידקי ארכיס בר כדי לזהות מינים עמידים לאספרגילוס ולקבוע ולאפיין מקורות חדשים של עמידות גנטית לפטרייה אופורטוניסטית זו. שיטה זו מבוססת על טיהור תמצית זרעים בטכניקת מיצוי פאזה מוצקה (SPE) וכימות אפלטוקסין על ידי כרומטוגרפיה נוזלית אולטרה ביצועים (UPLC) ומאופיינת בהתאוששות, דיוק ודיוק גבוהים מספיק. שיטת “פלוריסיל” המוצעת היא שינוי של הליך ניקוי המיני-עמוד היחיד המבוסס על התכונה הייחודית של פלוריזיל (ג’ל מגנזיום סיליקה) לשמירה חזקה וסלקטיבית על אפלטוקסינים²⁸. כמו בשיטה המקורית, דגימות זרעים חולצו עם תערובת MeOH-H₂O אך ביחס שונה של 90:10 (v/v) בהשוואה ל-80:20 (v/v) שפורסם. שינוי זה הגדיל את קצב הזרימה של ממסים דרך עמודת הניקוי עד פי 2.5 עם אותו קצב התאוששות אפלטוקסין. תערובת מתנול-מים זו ביחס 90:10 (v/v) סיפקה כמעט 100% התאוששות של תקני אפלטוקסינים B₁, B₂, G₁ ו-G₂שנוספו למיצוי ממס ברמות ספייק שוות ערך לריכוזי אפלטוקסין של 5-50 ננוגרם ב-1 גרם של מצע, וכן סיפקה התאוששות גבוהה מספיק מדגימות זרעי בוטנים שקוצצו (טבלה 1).

הוכח כי ניתן לדלל אפלטוקסינים מספיגת פלוריזיל רק עם כמויות גדולות של אצטון³⁰, אצטון-מתנול ^31,32, ותערובות אצטון-מים 33,34,35,36. במהלך המחקר הנוכחי, גילינו כי אצטוניטריל חומצי מתנהג באופן דומה לאצטון ביכולתו לנטרל אפלטוקסינים מפלוריסיל. למיטב ידיעתנו, תכונה זו של אצטוניטריל לא דווחה בספרות. גילוי תכונה זו מאפשר הזרקת תמצית מטוהרת ישירות למערכת UPLC תוך השמטת שלב אידוי הממס, אשר מקצר באופן משמעותי את זמן ההכנה. גם כאשר אצטוניטריל עורבב עם אצטון (אצטון-אצטוניטריל-מים-88% חומצה פורמית (65:31:3.5:0.5, v/v)), הוא סיפק הסרה חלקה, מלאה ומהירה של מים מהממסים המטוהרים והפחית באופן משמעותי את זמן אידוי הממס. נוכחותו של אצטוניטריל אפשרה שימוש בתערובת ממס יחידה, מתנול-מים (90:10, v/v) כדי להסיר ביעילות זיהומים מעמוד פלורסיל בהשוואה לשיטה שפורסמה, שבה נדרשו שני ממיסי כביסה נוספים, מתנול ותערובת כלורופורם-מתנול. ²⁸

בממוצע, ההתאוששות הסטנדרטית של אפלטוקסין B₁ הייתה ~98% בעת שימוש ב -1.2 מ”ל עבור אלוציה של אפלטוקסינים. כמות של 50 מ”ג פלוריזיל נבחרה כך 1.2 מ”ל של ממס elution מילא את המיניטור לחלק העליון של החבית, באותו זמן, סיפק התאוששות משביעת רצון (טבלה 1). גישה זו מזרזת את הליך הניקוי מכיוון שיש למלא את חבית העמודות פעם אחת בלבד. בשלבים המוקדמים של פרויקט זה, לא היה ברור אם מקטע פלורסיל מסחרי בעל גודל חלקיקים גדול יחסית, 100-200 רשת, יתאים לעמוד קטן המכיל שכבה של 3 מ”מ בלבד של חומר סופג. לכן, חקרנו שברים שונים של Florisil שהתקבלו ממוצר מסחרי של 100-200 רשת באמצעות מסננות בדיקה סטנדרטיות בארה”ב 120-140, 140-170, 170-200, 200-270, 270-400 ו->400 רשת. כל השברים הללו סיפקו תוצאות ניתנות לשחזור, כמעט תואמות עם התאוששות משביעת רצון. למרות ששברים קטנים יותר בגודל חלקיקים הדגימו פסי אפלטוקסין צרים יותר בטור תחת אור UV, שברים אלה לא היו עדיפים בשום היבט על המוצר המסחרי 100-200 Mesh. בנוסף, שבר הרשת של 100-200 הדגים את זמני ההדחה הקצרים ביותר (8-12 דקות) עבור ההליך כולו.

העברת ממס UPLC הדרגתי אפשרה הפרדה משביעת רצון של אפלטוקסינים, כמו גם הסרה מלאה של זיהומים לא קוטביים מהעמודה (איור 5G). גישה זו הובילה לתפעול עמודות ללא רבב ולתוצאות ניתנות לשחזור של ניתוחים של מאות דגימות. זהותם של אפלטוקסינים שנלקחו מעמוד פלורסיל אושרה כפי שתואר קודם לכן. ²⁸ עמודת UPLC אנליטית בקוטר 3 מ”מ ששימשה כאן הדגימה סלקטיביות גבוהה יותר והפרדה אמינה יותר של אפלטוקסינים B₁, B₂, G₁ ו-G₂ בריכוזים גבוהים יותר בהשוואה לעמודת הקוטר 2.1 מ”מ של אותה כימיה. יתר על כן, תוחלת החיים של עמוד 3 מ”מ (מעל 1,200 זריקות) הייתה גבוהה משמעותית מזו של עמוד 2.1 מ”מ (עד 800 זריקות). למרות שעמוד 3 מ”מ דרש קצב גבוה יותר של השלב הנייד (40% יותר), חיסרון זה עלה על היתרונות הנ”ל של העמודה.

המיני-עמוד פלורסיל היה יעיל לטיהור תמציות של זרעי בוטנים מזוהמים מאוד במטבוליטים של אספרגילוס (איור 5G); זרעים כאלה הכילו גם רמות גבוהות של פיטולקסין סטילבנואידים שיוצרו על ידי זרעים בתגובה לפלישה הפטרייתית. כל הזיהומים הללו עשויים לעלות על ריכוז אפלטוקסין בזרעים עד פי 10^{פי 6} ²², מה שהופך זרעים אלה לאובייקטים מאתגרים לניתוח אפלטוקסין. איור 5G מראה את היעדר שיאים מפריעים בכרומטוגרמה בזמני שימור אפלטוקסין, מה שהפך את הזיהוי והכימות של אפלטוקסין ללא פשרות בכל הרמות שנבדקו (טבלה 1). כפי שניתן לראות בטבלה 1, הדיוק והדיוק של השיטה היו גבוהים מספיק בטווח הנבדק של 1.0-50.0 ננוגרם/גרם, שהוא גם הטווח הקריטי ביותר לזיהוי אפלטוקסין. ההתאוששות ברמות שונות עבור גנוטיפים שונים של בוטנים פראיים הייתה אחידה וסטיות התקן עבור חמישה מיצויים שונים היו נמוכות במהותן.

השיטה נבדקה גם על בוטנים, כותנה, תירס וזרעי אורז מזוהמים באופן טבעי מאפס לרמות גבוהות במיוחד – מעל 10,000 ננוגרם/גרם של אפלטוקסינים בסך הכל. ההתאוששות של אפלטוקסינים B₁, B₂, G₁ ו-G₂ מתירס, זרעי כותנה ואורז ברמה של 5 ננוגרם/גרם נעה בין 76.1% ל-93.7%, 77.1% ל-86.6% ו-90.5% ל-96.2%, בהתאמה. ההתאוששות הגבוהה ביותר של אפלטוקסינים מאורז לוותה ב”טוהר” של הלואנט, כלומר, כמעט היעדר זיהומים. יתר על כן, אורז ייצג את החפץ היחיד הקטן ביותר שנבדק, בממוצע, 19 מ”ג / זרע.

זמן ההכנה הכולל של זרע בוטנים בודד (כולל הפגזה, שקילה, מיצוי, צנטריפוגה וטיהור) באמצעות עמוד פלורסיל לא עלה על 20 דקות. עלות המיני-עמוד של פלוריזיל נמוכה פי >10 מזו של עמודי ניקוי מסחריים. חיסכון נוסף נובע משימוש בכמויות נמוכות יותר של חומרי ספיגה, ממסים וגז חנקן בהשוואה לנוהל²⁸ שפורסם. המיני-עמוד אינו דורש מכשירי שאיבה או ואקום כדי לפעול, ויש לו חיי מדף בלתי מוגבלים.

חקר חיידקי צמחים לעמידות לאפלטוקסינים קשה במיוחד מכיוון שהצטברות מיקוטוקסין אינה עוקבת אחר התפלגות נורמלית^37,38; יש צורך במספר רב של ניתוחי אפלטוקסין בזרעים בודדים כדי להתגבר על תופעה זו. בנוסף לתכולת אפלטוקסין, מידע על הרכב פיטואלכסין כמותי הוא בעל ערך רב לאור גוף מידע גדול שניתן לקבל מזרע בודד (איור 1A) ולעקוב אחריו לצמח מסוים (איור 1E). השיטה שימשה בהצלחה לסינון מאות צירים, כולל זני קרקע, קווי רבייה מתקדמים וזני בוטנים מובחרים. השיטה מוצעת לשימוש בתוכניות מחקר קדם-רבייה ורבייה של בוטנים ועשויה לסייע באפיון גנים של בוטנים לעמידות פטרייתית.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו קיבלה את התמיכה הכספית של פרויקט USDA-ARS CRIS 6044-42000-011-00D ופרויקט CRIS 6044-21000-005-000-D. אנו מודים לדן טוד על הכנת מתלה החזקת המיני-עמוד. אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה נועד אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואינו מרמז על המלצה או תמיכה של משרד החקלאות האמריקאי.

Materials

Acetone, Optima	Fisher Scientific	A929-4
Acetonitrile, Optima	Fisher Scientific	A996-4
Acquity BEH C18 2.1 x 5mm Van-Guard pre-column	Waters Corporation	186003975
Acquity BEH C18 3 x 100mm column	Waters Corporation	186004661
Acquity BEH C18 2.1 x 100mm column	Waters Corporation	186002352
Aflatoxins B1, B2, G1, and G2	Sigma-Aldrich	A9441-1VL	Dissolve the contents of the commercial vial in 5 mL of methanol to obtain 5 µg/mL for aflatoxins B1 and G1 and 1.5 µg/mL for B2 and G2
Aflatoxin B1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A6636-1MG
Aflatoxin B2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A9887-1MG
Aflatoxin G1 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0138-1MG
Aflatoxin G2 (1mg)	Sigma-Aldrich	A0263-1MG
Aflatoxin M1 (10 µg)	Sigma-Aldrich	CRM46319
Agar, Granulated (2kg)	Becton Dickinson	BD214510
Alumina oxide basic (60-325 mesh)	Fisher Scientific	A941-500
Basal medium	Murashige and Skoog	M5519
Bead Ruptor 24	Omni International	19-042E
Beaker (1000mL)	Corning (Pyrex)	10001L
Beaker (250mL)	Corning (Pyrex)	1000250
Beaker (400mL)	Corning (Pyrex)	1000400
Beaker (600mL)	Corning (Pyrex)	1000600
Blade, scalpel	Feather	#10
Centrifuge (LSE Compact)	Corning	Model: 6755
Centrifuge, micro	Corning	Model: 6770
Ceramic beads (2.8 mm)	Omni International	19-646
Ceramic beads (6.5 mm)	Omni International	19-682
Chromeleon 7 series Software	Thermo Scientific
Drill bit	Kyocera	07896	1.6 mm
Drill bit	Kyocera	07357	2.0 mm
Drill bit	Kyocera	07985	2.34 mm
Ethanol (200 proof)	Decon Labs	2805M
Evaporator, nitrogen	organimation	11106	6-position
Excel, Microsoft	Microsoft	Office 365
Filter paper (#4)	Cytiva Whatman	1004-090
Filter paper cutter, stainless steel (ID 11.5mm)	Unknown
Filter paper, glass fibre	Cytiva Whatman	934-AH
Flask (2800mL)	Corning (Pyrex)	44202XL
Florisil (100-200 mesh)	Fisher Scientific	F101-500
Forceps	Integra Lifescience (Miltex)	PM-0300
Formic acid (88%, ACS)	Fisher Scientific	A118P-500
Freezer (-80^oC)	Fisher Scientific	TSX70086D
Funnel (15 x 80mm)	DWK Life Sciences (Kimax)	2902060
Gelzan (medium)	Caisson Labs	G024
Glass rod (custom)	Custom made
Glass wool	Corning (Pyrex)	3950
Handle, scalpel	Feather	#7
Hemocytometer	Hausser Scientific	3100
Hydrogen peroxide	Fisher Scientific	H325-4	30%, Certified ACS
Ice bucket, round with lid	Corning	432122
Incubator	Percival	136VL
Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes	Kimtech	34120	8.2" x 4.39"
Kimtech SCIENCE Brand Kimwipes	Kimtech	34256	16.4" x 14.43"
Lab coat	Cenmed	B113660SBXL
Methanol, Optima	Fisher Scientific	A454-4
Mini column rack (custom)	Custom made
Mixer, touch (maxi mix II)	Thermolyne	37600 (model 231)
Nitrile gloves	Microflex	XC310M
Nitrogen gas, compressed (ultra high purity)	Jones Welding
Paper towel	Georgia-Pacific	20023 (D400)
pH meter	Fisher Scientific (Accumet)	13-636-AB15
pH/ATC electrode	Fisher Scientific (Accumet)	13-620-111
PhCR Photochemical Reactor	Waters (Vicam)	600001222
Pipette, pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D	9"
Pipettor (1 mL) (Reference 2)	Eppendorf	4924000088
Pipettor (10 μL) (Reference)	Eppendorf	022470051D
Pipette tips: 10 μL, 200 μL, 1 mL	Eppendorf	F144054M
Pipettor (200 µL)(Ergofit)	Fisher Scientific	12-146-679
Plates, petri (100x15mm)	Fisher Scientific	FB0875713
Potato Dextrose Agar (500g)	Becton Dickinson	BD213400
Reinforced bead tube (2 mL)	Omni International	19-660
Reinforced bead tube (7 mL)	Omni International	19-651
Repipettor, Dispensette III (10mL)	Brandtech	4701141
Resveratrol	Sigma-Aldrich	R5010-100MG
Scoop (custom)	Custom made
screwcap jar (250 mL)	Corning (Pyrex)	1395250
Silica gel, spherical (200-400 mesh)	Supelco	97727-U	100 g
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	S318-500
SPE extract clean 1.5-mL polypropylene column	American Chromotography Supplies	SP-5122382
SPE extract clean PP frits (for 1.5 mL minicolumn)	American Chromotography Supplies	SP-3119414
Spectrophotometer, UV-visible	Fisher Scientific	14-385-351 (Genesys 50)
Test tube	Corning (Pyrex)	982516X	16x125mm
Test tube (Disposable)(16x125mm)	Fisher Scientific	14-961-31
Test tube (Disposable)(150x250mm)	Fisher Scientific	14-961-34
Thermo Vanquish DAD detector (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D11-A-01
Thermo Vanquish Fluourescense detector (UPLC)	Thermo Scientific	VF-D51-A
Thermo Vanquish quaternary pump F (UPLC)	Thermo Scientific	VF-P20-A
Thermo Vanquish Split Sampler FT (UPLC)	Thermo Scientific	VF-A10-A-02
Tween 20 (polysorbate 20) (enzyme grade)	Fisher Scientific	BP337-500
Vial caps (4mL)	Fisher Scientific	C4015-75A
Vial caps (autosampler)	Fisher Scientific	C4010-60A
Vials & caps (16 mL)	Thermo Scientific	B7800-4
Vials, glass (4mL)	Fisher Scientific	C4015-1
Vials, polypropylene (autosampler) (400mL)	Fisher Scientific	C4010-11
Water, Optima	Fisher Scientific	W6-4

References

Janila, P., et al. Molecular breeding for introgression of fatty acid desaturase mutant alleles (ahFAD2A and ahFAD2B) enhances oil quality in high and low oil containing peanut genotypes. Plant Sci. 242, 203-213 (2016).
Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells. Toxins (Basel). 5 (8), 1447-1461 (2013).
American Association for Cancer Research: AACR. An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20. Cancer Res. 40 (1), 1-12 (1980).
Turner, P. C. The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth. Scientifica. , 21 (2013).
Williams, J. H., et al. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. Am. J. Clin. Nutr. 80 (5), 1106-1122 (2004).
van Egmond, H. P., Jonker, M. A., Abbas, H. K. Worldwide regulations on aflatoxins. Aflatoxinandfood safety. , 77-93 (2005).
European Commission. Commission Regulation (EC) 1525/98. Off. J. Eur. Comm. L. 201, 43-46 (1998).
Bressano, M., et al. Introgression of peanut smut resistance from landraces to elite peanut cultivars (Arachis hypogaea L). PLoS ONE. 14 (2), e0211920 (2019).
de Blas, F. J., et al. Identification of smut resistance in wild Arachis species and its introgression into peanut elite lines. Crop Sci. 59 (4), 1657-1665 (2019).
Mallikarjuna, N., Pande, S., Jadhav, D. R., Sastri, D. C., Rao, J. N. Introgression of disease resistance genes from Arachis kempff-mercadoi into cultivated groundnut. Plant Breeding. 123 (6), 573-576 (2004).
Moretzsohn, M. C., et al. Genetic diversity of peanut (Arachis hypogaea L.) and its wild relatives based on the analysis of hypervariable regions of the genome. BMC Plant Biol. 4, 1-10 (2004).
Arias, R. S., et al. New tools to screen wild peanut species for aflatoxin accumulation and genetic fingerprinting. BMC Plant Biol. 18 (1), 170 (2018).
Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia. 105 (2), 117-128 (1989).
Paxton, J. D., Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. Biosynthesis and accumulation of legume phytoalexins. Mycotoxins and phytoalexins. , 485-499 (1991).
Cole, R. J., Dorner, J. W., Sharma, R. P., Salunkhe, D. K. Peanut phytoalexins. Mycotoxins and phytoalexins. , 501-509 (1991).
Subba Rao, P. V., Strange, R. N., Daniel, M., Purkayastha, R. P. Chemistry, biology, and role of groundnut phytoalexins in resistance to fungal attack. Handbook of phytoalexin metabolism and action. , 199-227 (1995).
Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes. J. Agric. Food. Chem. 55 (6), 2195-2200 (2007).
Paxton, J. Phytoalexins: a working redefinition. J. Phytopathol. 101, 106-109 (1981).
Mansfield, J. W., Bailey, J. A., Mansfield, J. W. The role of phytoalexins in disease resistance. Phytoalexins. , 153-288 (1982).
Strange, R. N., Ayers, P. G. Resistance: the role of the hypersensitive response and phytoalexins. Plant response to foliar pathogens. , 39-56 (1992).
Sobolev, V. S., et al. Biological activity of peanut (Arachis hypogaea) phytoalexins and selected natural and synthetic stilbenoids. J. Agric. Food Chem. 59 (5), 1673-1682 (2011).
Sobolev, V. S. Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus Species. J. Agric. Food Chem. 56 (6), 1949-1954 (2008).
Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain. J. Agric. Food Chem. 57 (1), 62-68 (2009).
Trucksess, M. W., et al. Immunoaffinity column coupled with solution fluorometry or liquid chromatography postcolumn derivatization for determination of aflatoxins in corn, peanuts, and peanut butter: collaborative study. J. AOAC Int. 74 (1), 81-88 (1991).
Dorner, J. W., Blankenship, P. D., Cole, R. J. Performance of two immunochemical assays in the analysis of peanuts for aflatoxin at 37 field laboratories. J. AOAC Int. 76 (3), 637-643 (1993).
Stroka, J., Anklam, E. Immunoaffinity column cleanup with liquid chromatography using post-column bromination for determination of aflatoxins in peanut butter, pistachio paste, fig paste, and paprika powder: collaborative study. J. AOAC Int. 83 (2), 320-340 (2000).
Pal, A., Acharya, D., Saha, D., Roy, D., Dhar, T. K. In situ sample cleanup during immunoassay: a simple method for rapid detection of aflatoxin B1 in food samples. J. Food Prot. 68 (10), 2169-2177 (2005).
Sobolev, V. S. Simple, rapid, and inexpensive cleanup method for quantitation of aflatoxins in important agricultural products by HPLC. J. Agric. Food Chem. 55 (6), 2136-2141 (2007).
Sobolev, V. S., Dorner, J. W. Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography. J. AOAC Int. 85 (3), 642-645 (2002).
Levi, C. P., Borker, E. Survey of green coffee for potential aflatoxin contamination. J. AOAC. 51 (3), 600-602 (1968).
Levi, C. P. Collaborative study on a method for detection of aflatoxins B1 in green coffee beans. J. AOAC. 52 (6), 1300-1303 (1969).
Scott, P. M. Note on analysis of aflatoxins in green coffee. J. AOAC. 51, 609 (1968).
Bicking, M. K. L., Kniseley, R. N., Svec, H. J. Coupled-column system for quantitating low levels of aflatoxins. J. AOAC. 66 (4), 905-908 (1983).
Kamimura, H., et al. Simple, rapid cleanup method for analysis of aflatoxins and comparison with various methods. J. AOAC. 68 (3), 458-461 (1985).
Hoogenboom, L. A., et al. Genotoxicity testing of extracts from aflatoxin-contaminated peanut meal, following chemical decontamination. Food Addit. Contam. 18 (4), 329-341 (2001).
Castro, L., Vargas, E. A. Determining aflatoxins B1, B2, G1 and G2 in maize using Florisil clean up with thin layer chromatography and visual and densitometric Quantitation. Cienc. Tecnol. Ailment. Campinas. 21, 115-122 (2001).
Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem. J. Vis. Exp. (106), e53398 (2015).
Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots. Peanut Sci. 31 (1), 59-63 (2004).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite This Article

Sobolev, V. S., Arias, R. S., Massa, A. N., Walk, T. E., Orner, V. A., Lamb, M. C. Non-destructive SPE-UPLC-based Quantification of Aflatoxins and Stilbenoid Phytoalexins in Single Peanut (Arachis spp.) Seeds. J. Vis. Exp. (206), e66574, doi:10.3791/66574 (2024).

Automatically Generated