כימות מבוסס SPEP-UPLC לא הרסני של אפלטוקסינים ופיטואלכסינים סטילבנואידים בבוטנים בודדים (Arachis spp.) זרעים

1. הכנת זרעים לאתגר פטרייתי לדגור את Aspergillus flavus NRRL 3357 aflatoxigenic על שיפוע של תפוח אדמה דקסטרוז אגר (PDA) במבחנה במשך 6 ימים ב 30 ° C. קצרו נבגי פטריות מהמבחנה עם 10 מ”ל מים עם טווין 20 (100 מיקרוליטר טווין ב 1 ליטר מים סטריליים מזוקקים), סננו דרך צמר זכוכית שהונח במשפך וספרו את הנבגים עם המוציטומטר המתייחס למדריך למשתמש. יש לדלל את תרחיף הנבגים במים סטריליים לריכוז של 1,000 נבגים/μL. אשר את הריכוז עם המוציטומטר.הערה: הכינו את מתלה הנבגים לא לפני שעתיים לפני הניסויים המאתגרים. לפצח בעדינות את תרמילי בוטנים ולהסיר את הקליפות. מניחים את הזרעים בכד סטרילי כך שנפח הזרעים לא יעלה על 1/5 מנפח הכד, מוסיפים 0.05% תמיסת מי חמצן לכ-70% מנפח הכד, ומאפשרים לזרעים לספוג מים במשך 3 שעות. רוקנו את תמיסת מי החמצן מהזרעים והוסיפו בערך פי 3 מהכמות של תערובת אתנול-מים (V/V) של 80% כדי לכסות את הזרעים. אפשר לעמוד במשך דקה אחת ולאחר מכן לשטוף את הזרעים 2x עם כמויות שוות של מים מזוקקים סטריליים. הוסיפו לכוס נפח של 3% מי חמצן פי 5 עם הזרעים המעוקרים באתנול ואפשרו להם לעמוד במשך 5 דקות, ואז רוקנו את הנוזל ושטפו את הזרעים פעמיים עם כמויות שוות של מים סטריליים (איור 2A). איור 2: הכנת זרעי בוטנים לחיסון, דגירה ומיצוי של שברי אפלטוקסין ופיטואלכסין. (A) עיקור זרעים טבולים במי חמצן 3%; (ב) הסרת טסטה (עור) מזרעים; (ג) חיתוך חלק הציר העוברי; (D,E) חלל קידוח בחצי קוטילדון עם מקדח; (ו) הנחת חלקי זרעים קדוחים על אגר; (G) מריחת נבגי פטריות לתוך החלל הקדוח. (H) צלחת פטרי עם זרעים לאחר הדגירה; (I) הנחת זרעים בודדים מודגרים (צילום דגימות ביקורת) לתוך צינורות חרוזים מחוזקים; (י) הוספת נפח מדוד של מיצוי ממס; (יא) כתישת דגימות בקרע חרוזים; (L) צנטריפוגה של תרחיף כתוש. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. הניחו את הזרעים על מגבת נייר סטרילית, הסירו את טסטה הזרעים בעזרת מלקחיים, וחתכו כ-1/3 מהזרע המכיל את הציר העוברי בעזרת אזמל (איור 2B,C). השליכו את החלק הזה של הזרע או השתמשו בו כדי לגדל צמח במבחנה עם מדיום צמיחה (איור 1B,E). מפצלים את החלק הנותר של הזרע לשני קוטילדונים, מניחים אותם בצלחת פטרי, מכסים את חלקי הזרעים בנייר סינון סטרילי לח, מחליפים את המכסה כדי למנוע התייבשות וממשיכים מיד לשלב החיסון. לפני ביצוע הניסויים המאתגרים, הכינו כמות מספקת של צלחות פטרי עם מדיום דגירה של זרעים על ידי שפיכת 26 מ”ל של אגר סטרילי 1.5% במים לתוך הכלים בגודל 100X15 מ”מ ואפשרו להם להתמצק למשך הלילה. באמצע הצד החיצוני של כל קוטילדון שנותר, צור חלל בעומק 1.5-2 מ”מ על ידי קידוח ידני של הזרע עם מקדח סטרילי חד בקוטר 1.6-2.34 מ”מ. נדרשות ~2-5 שניות כדי ליצור חלל (איור 2D,E). מניחים 4 עד 6 חתיכות “קדוחות” של הזרעים לתוך צלחת פטרי עם אגר ולהחיל 2 μL מתוך 1,000 נבגים / μL תרחיף לתוך החלל הקדוח של כל חתיכת חצי cotyledon עם צינור 10 μL. במקום תרחיף הנבגים, מרחו מים סטריליים על זרעי הבקרה (איור 2F,G). מכסים את כל צלחות הפטרי במכסים ודגרים בטמפרטורה של 30°C ללא אור למשך 72 שעות. 2. דגימה והכנה של חתיכות זרעים מודגרים עבור ניתוח aflatoxin ו phytoalexin אספו חתיכות זרעים במהירות של 72 שעות על-ידי הסרתן מהאגר בעזרת מלקחיים והנחתן בבקבוקוני חרוזים מסומנים של 7 מ”ל עם 13 חרוזי קרמיקה זירקוניום (12 בקוטר 2.8 מ”מ ו-1 בקוטר 6.5 מ”מ) (איור 2H,I).הערה: בשלב זה, אם לא מעבדים אותם מיד, ניתן להכניס את הבקבוקונים למקפיא בטמפרטורה של -80°C ולשמור אותם עד חודשיים לפני עיבוד נוסף. Phytoalexins ו aflatoxins נקבעים באותה תמצית זרעים. למיצוי, בהתאם לגודל הזרעים החזותי (קטן, בינוני או גדול), הוסיפו 2 או 4 מ”ל של תערובת מתנול-מים שנמדדה במדויק (90:10, v/v) לבקבוקוני החרוזים וכתשו במהירות של 5.5 מ’ לשנייה למשך 45 שניות. הכניסו את הבקבוקונים עם הזרעים המרוסקים לצנטריפוגה ולצנטריפוגה במשקל של 1,860 × למשך 3 דקות (איור 2J – L).הערה:17,22 הנגזרות הסטילבנואידיות החשובות הבאות נקבעות (כולן בתצורת טרנס): רסברטרול, ארכידין-1, ארכידין-2, ארכידין-3, 3′-איזופנטדיאניל-3,5,4′-טריהידרוקסיסטילבן (IPD) ו-SB-1. עבור ניתוחי אפלטוקסין, לפני ביצוע הניסויים המאתגרים, הכינו מספר מספיק של עמודות ניקוי כדלקמן. מניחים פוליאתילן נקבובי תואם (20 μL) frit לתוך עמוד פוליפרופילן 1.5 מ”ל בעזרת מוט זכוכית לחתוך בזווית 90o . הכניסו 50 מ”ג של ג’ל מגנזיום סיליקה (100-200 רשת) לתוך העמוד בעזרת כף מדידה בהתאמה אישית, וכסו את העמוד עם חלק זהה על-ידי דחיפתו כלפי מטה בעזרת מוט זכוכית (איור 3A – E).הערה: כמות זו של ג’ל סיליקה מגנזיום תופסת נפח 75 μL, ואת גובה שכבת adsorbent הוא 3 מ”מ. איור 3: הכנת עמודות ניקוי ומסננים. (A,B) הנחת פריטה נקבובית לתוך חבית; (C,D) מילוי חבית בג’ל מגנזיום סיליקה; (E) אריזת חומר הספיגה והכנסת פריטה נקבובית עליונה לחבית. (ו) הנחת עיגול סיבי זכוכית בקוטר 11.5 מ”מ על גבי פיפטה של פסטר. (ז,ח) דוחפים את מרכז העיגול עם מוט פלסטיק או עץ לתחתית חבית פיפטת פסטר ודוחסים היטב את סיבי הזכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. בשלב זה, הכינו מספר תואם של מסננים בהתאמה אישית כפי שמוצג באיור 3F – H. עבור ניתוח אפלטוקסין, למדוד במדויק עד 0.5 מ”ל aliquot של supernatant (המתקבל כמתואר בשלב 2.2), להעביר אותו לתוך minicolumn ארוז בהתאמה אישית, ולאפשר תמצית להתנקז על ידי כוח הכבידה לתוך בקבוקון זכוכית 4 מ”ל. העבירו 1.0 מ”ל של תערובת מתנול-מים (90:10, v/v) לעמוד כדי לשטוף זיהומים באמצעות כוח הכבידה לתוך אותו בקבוקון של 4 מ”ל (איור 4A). איור 4: טיהור תמציות זרעים והכנה לניתוחי UPLC. (A) ארון תקשורת עם עמודים ארוזים. (B) אידוי ממס עם גז N2 משישה בקבוקונים של 4 מ”ל עם תמצית מטוהרת שנלקחה מעמודי ניקוי. (C) הבאת בקבוקונים ומסננים לטמפרטורה מתחת לאפס במיכלי קצף (1 ו-2) עם קרח לפני ואחרי הוספת ממס ההזרקה (MeOH-H2O 9:1, v/v) לבקבוקונים של 4 מ”ל. (D) סינון תמצית מקוררת מבקבוקון של 4 מ”ל לתוך בקבוקון דוגם אוטומטי של 400 μL. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה. השליכו את האלוטות המשולבות. האטו את מקטע האפלטוקסין על ידי כוח הכבידה מהעמוד לתוך בקבוקון זכוכית נקי של 4 מ”ל עם תערובת של 1.2 מ”ל אצטון-אצטוניטריל-מים-88% חומצה פורמית (65:31:3.5:0.5, v/v) (איור 4A). לחלופין, יש למרוח אפלטוקסינים מהעמוד עם תערובת של 2.0 מ”ל אצטוניטריל-מים-88% חומצה פורמית (96:3.5:0.5, v/v), ולהזריק אליציטוט של האלואט, עד 2 μL, ישירות למערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית בעלת הביצועים הגבוהים במיוחד (UPLC) (ללא אידוי הממס עם N2).הערה: במקרה זה, צפה למגבלת כמות נמוכה עד פי 10 עבור אפלטוקסינים; ברוב המקרים ירידה כזו של רגישות מקובלת שכן ריכוזי אפלטוקסין בזרעים מאותגרים הם לעתים קרובות גבוהים. הסר את הממס מהבקבוקונים בזרם של N2 בבלוק מחומם ב 45 מעלות צלזיוס. מכסים את הבקבוקון ומניחים אותו במיכל עם קרח כתוש למשך 30-45 שניות כדי למזער אידוי של הממס שנוסף בשלב הבא. הכניסו מסננים בהתאמה אישית למבחנות חד-פעמיות והכניסו את המבחנות לקרח במיכל אחר כדי למזער התאדות של ממס בעת סינון (איור 4B,C). לאחר אידוי הממס, יש להמיס את השאריות היבשות ב-0.25-1.0 מ”ל של תערובת מתנול-מים (90:10, v/v) ומערבולת במשך 1-2 שניות. הכניסו בקבוקונים עם תמציות מטוהרות לתוך הדוגם האוטומטי של UPLC והזריקו 0.1 עד 3.0 μL למערכת UPLC (איור 5A,B).הערה: אם התמיסה לאחר מערבולות חשודה שיש בה חלקיקים מרחפים מסוימים, סנן את התמיסה דרך המסנן המקורר (איור 4D). איור 5: התהליך והתוצאות של ניתוחי UPLC של תמציות מטוהרות. (A) הצבת ארון תקשורת עם תמציות דגימה מטוהרות בדוגמית אוטומטית של UPLC. (ב) ביצוע הניתוחים האינסטרומנטליים, קבלת נתונים ופירוש התוצאות. (C) UPLC של ארבעה אפלטוקסינים עיקריים; פסגות העניין העיקריות, אפלטוקסינים B1 ו-B2 מייצגים 0.04 ו-0.004 ננוגרם, בהתאמה. (D) UPLC של אפלטוקסינים B1 ו-B2; שיא 2 מייצג אפלטוקסין B1 ברמה של 2 pg (עם תא זרימה של 8 μL). (E) UPLC של תמצית מטוהרת של זרע שנקצר משדה בוטנים מקומי עם זן ארכיס פראי. (F) UPLC של תמצית של זרע בוטנים מאותגר מטוהר עם מיני-עמוד תחמוצת אלומיניום בסיסי. (G) UPLC של תמצית זרעי בוטנים מאותגרים מטוהרים עם עמוד פלוריסיל; כרומטוגרמה כחולה מציגה זיהומים שנשטפים מהטור עם 1 מ”ל של תערובת מתנול-מים (90: 10 V/V); כרומטוגרמה שחורה מראה פסגות של אפלטוקסינים M1 ו- B1. רמת אפלטוקסין B1 היא 48 ננוגרם/גרם. (H) כרומטוגרמה טיפוסית של סטילבנואידים בוטנים מזרע מאותגר; קיצור: IPD = 3′-isopentadienyl-3,5,4′-trihydroxystilbene. הערה: כל הסטילבנואידים בתמציות זרעים הם בתצורת טרנס. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.  עבור ניתוח phytoalexin, מכל בקבוקון חרוזים, להעביר 200 μL של supernatant לתוך מסנן פיפטה פסטר לעיל. השתמשו בגז N2 ממיכל חנקן דחוס כדי לזרז את הסינון לתוך בקבוקון דוגם אוטומטי UPLC של 400 μL וסגרו את הבקבוקון עם מכסה תואם עם מחיצת PTFE (איור 4D). 3. ניתוח אפלטוקסין להפרדות של אפלטוקסינים בתמציות זרעים, השתמש במערכת UPLC המצוידת בדוגם אוטומטי, משאבה רבעונית, גלאי פלואורסצנטי, UPLC BEH C18 3.0 מ”מ x 100 מ”מ, עמוד 1.7 מיקרומטר עם קדם-עמודה תואמת, וכור פוטוכימי פוסט-טור (PHRED) עם סליל PTFE סרוג סטנדרטי בקוטר פנימי של 0.25 שנחתך ל-25% מאורכו המקורי.הערה: מכשיר UPLC והציוד המשויך המשמש את המחברים מפורטים בטבלת החומרים. השתמשו במים (A), מתנול (B) ואצטוניטריל (C) בשיפוע הבא: התנאים הראשוניים, 62.7% A, 24% B, 13.3% C, השתנו באופן ליניארי ל-30% A, 45% B, 25% C ב-3.75 דקות, השתנו ל-0% A, 64.4% B, 35.6% C ב-3.751 דקות, החזיקו איזוקרטי במשך 3.249 דקות, ואז השתנו לתנאים התחלתיים תוך 0.01 דקות והחזיקו איזוקרטי במשך 2.499 דקות לפני הזריקה הבאה. הגדר את קצב הזרימה ל- 0.45 מ”ל לדקה ואת זמן הפעולה ל- 9.5 דקות. שמור על העמוד בטמפרטורה של 40°C במחמם עמודת המערכת. השתמש ב- 362 ננומטר ו- 440 ננומטר כאורכי גל העירור והפליטה, בהתאמה, עבור אפלטוקסינים B1, B2, G1, G2 ו- M1 . המבנים של אפלטוקסינים עיקריים מוצגים באיור 6A.הערה: בתנאי הניסוי, רק אפלטוקסינים B1 ו- B2 צפויים להיות מיוצרים על ידי A. flavus NRRL 3357; אם זן A. parasiticus משמש לאתגר זרעים, צפוי ייצור של אפלטוקסינים B1, B2, G1 ו- G2 . קבע ריכוזים של אפלטוקסינים תוך התייחסות לאזורי שיא של תקנים אותנטיים תואמים (עקומת כיול) כמתואר במדריך למשתמש של התוכנה.הערה: מאחר שהליך UPLC מציג רעש בסיסי בהגדרות הרגישות הגבוהה עבור הגלאי הפלואורסצנטי, מגבלת זיהוי (LOD) ומגבלת כימות (LOQ) עבור אפלטוקסינים מוערכים באמצעות יחס אות לרעש המקובל של 3:1 עבור LOD ו- 10:1 עבור LOQ. במערך הניסוי השגרתי לניתוח זרעי בוטנים, המתואר בסעיפים 2 ו-3, גבולות הכימות עבור אפלטוקסינים G1 ו-B1 צפויים להיות קטנים או שווים ל-0.8 ו-0.08 ננוגרם/גרם עבור אפלטוקסינים G2 ו-B2, בהתאמה. 4. ניתוח פיטואלכסין סטילבנואיד להפרדת סטילבנואידים, יש להשתמש במים (A), מתנול (B) ו-88% חומצה פורמית (C) בשיפוע הבא: תנאים התחלתיים, 53% A, 42% B, 5% C, השתנו באופן ליניארי ל-35% A, 60% B, 5% C ב-2.0 דקות, הוחזקו איזוקרטיים במשך 4 דקות, השתנו ל-0% A, 95% B, 5% C ב-0.5 דקות, הוחזקו איזוקרטיים במשך 2.5 דקות, לאחר מכן השתנה לתנאים התחלתיים תוך 0.1 דקות והחזיק איזוקרטי במשך 2.9 דקות לפני הזריקה הבאה. הגדר את קצב הזרימה ל- 0.5 מ”ל לדקה ואת זמן הפעולה ל- 12.0 דקות. לקבוע ריכוזים של סטילבנואידים על ידי התייחסות לאזורי שיא של תקנים אותנטיים תואמים (עקומת כיול) ו/או למקדמים שפורסמו של הכחדות מולאריות כמתואר במדריך למשתמש של התוכנה. המבנים של פיטואלכסינים עיקריים שמקורם בסטילבן מוצגים באיור 6B.הערה: הפרדת פיטואלקסינים מושגת באמצעות אותה מערכת אך ללא גלאי פלואורסצנטי וכור PHRED. במקום זאת, גלאי מערך דיודות משמש לזיהוי וכימות של סטילבנואידים בוטנים. למגבלת הכימות (LOQ) עבור הפיטוקסינים העיקריים של סטילבנואיד אין משמעות מעשית מכיוון שריכוזי סטילבנואידים עולים על ריכוזי אפלטוקסינים באותה תמצית בכמה סדרי גודל; לאחר 3 ימים של דגירה, סטילבנואידים מכומתים באופן אמין.