مقايسة تكميلية قائمة على الإشريكية القولونية لدراسة وظيفة المرافقة لبروتين الصدمة الحرارية 70
Summary
يوضح هذا البروتوكول نشاط المرافقة لبروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70). تعمل خلايا E. coli dnaK756 كنموذج للفحص لأنها تؤوي Hsp70 الأصلي ، مما يجعلها عرضة للإجهاد الحراري. الإدخال غير المتجانس ل Hsp70 الوظيفي ينقذ نقص نمو الخلايا.
Abstract
بروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70) هو بروتين محفوظ يسهل طي البروتينات الأخرى داخل الخلية ، مما يجعله مرافقا جزيئيا. في حين أن Hsp70 ليس ضروريا لخلايا الإشريكية القولونية التي تنمو في ظل الظروف العادية ، يصبح هذا المرافق لا غنى عنه للنمو في درجات حرارة مرتفعة. نظرا لأن Hsp70 محفوظ بشكل كبير ، فإن إحدى طرق دراسة وظيفة المرافقة لجينات Hsp70 من الأنواع المختلفة هي التعبير عنها بشكل غير متجانس في سلالات E. coli التي إما ناقصة في Hsp70 أو تعبر عن Hsp70 الأصلي الذي تم اختراقه وظيفيا. خلايا E. coli dnaK756 غير قادرة على دعم الحمض النووي للبكتيريا. علاوة على ذلك ، يظهر Hsp70 (DnaK) الأصلي نشاط ATPase مرتفعا مع إظهار تقارب منخفض ل GrpE (عامل تبادل النوكليوتيدات Hsp70). نتيجة لذلك ، تنمو خلايا E. coli dnaK756 بشكل كاف في درجات حرارة تتراوح من 30 درجة مئوية إلى 37 درجة مئوية ، لكنها تموت في درجات حرارة مرتفعة (>40 درجة مئوية). لهذا السبب ، تعمل هذه الخلايا كنموذج لدراسة نشاط مرافقة Hsp70. هنا ، نصف بروتوكولا مفصلا لتطبيق هذه الخلايا لإجراء فحص مكمل ، مما يتيح دراسة وظيفة مرافقة السليلو في Hsp70.
Introduction
تلعب بروتينات الصدمة الحرارية دورا مهما كمرافقين جزيئيين من خلال تسهيل طي البروتين ، ومنع تراكم البروتين ، وعكس اختلال البروتين 1,2. بروتين الصدمة الحرارية 70 (Hsp70) هو واحد من أبرز المرافقين الجزيئيين ، ويلعب دورا مركزيا في توازن البروتين 3,4. DnaK هو نظير E. coli Hsp705.
تم تطوير العديد من المقايسات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية والخلوية لاستكشاف نشاط المرافق ل Hsp70 وفحص مثبطات تستهدف هذا المرافق6،7،8. Hsp70 هو بروتين محفوظ للغاية. لهذا السبب ، تم الإبلاغ عن العديد من Hsp70s من الكائنات حقيقية النواة ، مثل Plasmodium falciparum (العامل الرئيسي للملاريا) ، لتحل محل وظيفة DnaK في E. coli 6,9. وبهذه الطريقة ، تم تطوير مقايسة تكميلية قائمة على الإشريكية القولونية تتضمن التعبير غير المتجانس ل Hsp70s في الإشريكية القولونية لاستكشاف وظيفتها الواقية للخلايا. عادة ، يتضمن هذا الفحص استخدام خلايا الإشريكية القولونية التي تعاني من نقص في DnaK أو التي تعبر عن DnaK الأصلي الذي تم اختراقه وظيفيا. في حين أن DnaK ليس ضروريا لنمو الإشريكية القولونية في ظل الظروف العادية ، إلا أنه يصبح ضروريا عندما تنمو الخلايا في ظل ظروف مرهقة مثل درجات الحرارة المرتفعة أو أشكال أخرى من الإجهاد10,11.
تشمل سلالات الإشريكية القولونية التي تم تطويرها لدراسة وظيفة Hsp70 باستخدام مقايسة تكميلية E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103 (Am) thr::Tn10]) و E. coli dnaK756. تنتج خلايا E. coli dnaK103 DNA مقطوعا غير وظيفي ، وعلى هذا النحو ، تنمو الخلايا بشكل كاف عند 30 درجة مئوية ، في حين أن السلالة حساسة للبرودة والإجهاد الحراري12,13. وبالمثل ، فإن سلالة E. coli dnaK756 / BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) لا تنمو فوق 40 درجة مئوية14,15. تعبر سلالة E. coli dnaK756 عن DnaK الأصلي الطافر (DnaK756) الذي يتميز بثلاثة بدائل من الجلايسين إلى الأسبارتات في المواضع 32 و 455 و 468 ، مما يؤدي إلى نتائج بروتينية معرضة للخطر. وبالتالي ، فإن هذه السلالة مقاومة للبكتيريا λ DNA14. بالإضافة إلى ذلك ، تظهر E. coli dnaK756 نشاطا مرتفعا ل ATPase ، بينما يتم تقليل تقاربها لعامل تبادل النوكليوتيدات ، GrpE ،16. الإشريكية القولونية تعمل سلالات DnaK الطافرة كنماذج مثالية للتحقيق في نشاط مرافقة Hsp70 من خلال نهج التكامل. نظرا لأن DnaK ضروري فقط في ظل الظروف العصيبة ، يتم إجراء اختبار التكملة عادة في درجات حرارة مرتفعة (الشكل 1). تشمل بعض مزايا استخدام الإشريكية القولونية في هذه الدراسة الجينوم المميز جيدا والنمو السريع والتكلفة المنخفضة للزراعة والصيانة17.
في هذه المقالة ، وصفنا بالتفصيل بروتوكولا يتضمن استخدام خلايا E. coli dnaK756 لدراسة وظيفة Hsp70. Hsp70s التي استخدمناها في الفحص هي DnaK من النوع البري ومشتقه الخيمري ، KPf (يتكون من مجال ATPase ل DnaK المنصهر في مجال ربط الركيزة C-terminal من Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). تم التعبير عن KPf-V436F بشكل غير متجانس كعنصر تحكم سلبي لأن الطفرة تمنعه بشكل أساسي من ربط الركائز ، وبالتالي إلغاء نشاط مرافقه9.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوضح البروتوكول فائدة خلايا E. coli dnaK756في استكشاف وظيفة chaperone ل Hsp70 المعبر عنه بشكل غير متجانس. يمكن اعتماد هذا الفحص لفحص مثبطات استهداف وظيفة Hsp70 في السليلو. ومع ذلك ، فإن أحد قيود هذه الطريقة هو أن Hsp70s غير قادر على استبدال DnaK في الإشريكية القولونية غير متوافق مع هذا الفحص. قد ي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل بتمويل منحة تم الحصول عليها من رقم منحة المركز الدولي للهندسة الوراثية والتكنولوجيا الحيوية (ICGEB) ، HDI / CRP / 012 ، مديرية البحوث بجامعة فيندا ، المنحة I595 ، قسم العلوم والابتكار (DSI) والمؤسسة الوطنية للبحوث (NRF) في جنوب إفريقيا (أرقام المنح ، 75464 و 92598) الممنوحة ل AS.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
- Bukau, B., Deuerling, E., Pfund, C., Craig, E. A. Getting newly synthesized proteins into shape. Cell. 101 (2), 119-122 (2000).
- Shonhai, A. Plasmodial heat shock proteins: targets for chemotherapy. FEMS Microbiol. Immunol. 58 (1), 61-74 (2010).
- Mogk, A., et al. Identification of thermolabile Escherichia coli proteins: prevention and reversion of aggregation by DnaK and ClpB. EMBO J. 18 (24), 6934-6949 (1999).
- Edkins, A. L., Boshoff, A., Shonhai, A., Picard, D., Blatch, G. L. General structural and functional features of molecular chaperones. Heat shock proteins of malaria. Adv Exp Med Biol. , (2021).
- Bertelsen, E. B., Chang, L., Gestwicki, J. E., Zuiderweg, E. R. Solution conformation of wild-type E. coli. Hsp70 (DnaK) chaperone complexed with ADP and substrate. PNAS. 106 (21), 8471-8476 (2009).
- Shonhai, A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Plasmodium falciparum heat shock protein 70 is able to suppress the thermosensitivity of an Escherichia coli DnaK mutant strain. Mol Genet Genomics. 274, 70-78 (2005).
- Shonhai, A., Botha, M., de Beer, T. A., Boshoff, A., Blatch, G. L. Structure-function study of a Plasmodium falciparum Hsp70 using three-dimensional modelling and in vitro analyses. Protein Pept Lett. 15 (10), 1117-1125 (2008).
- Cockburn, I. L., Boshoff, A., Pesce, E. -. R., Blatch, G. L. Selective modulation of plasmodial Hsp70s by small molecules with antimalarial activity. Biol Chem. 395 (11), 1353-1362 (2014).
- Makhoba, X. H., et al. Use of a chimeric Hsp70 to enhance the quality of recombinant Plasmodium falciparum s-adenosylmethionine decarboxylase protein produced in Escherichia coli. PLoS One. 11 (3), 0152626 (2016).
- Bukau, B., Walker, G. C. Cellular defects caused by deletion of the Escherichia coli dnaK gene indicate roles for heat shock protein in normal metabolism. J Bact. 171 (5), 2337-2346 (1989).
- Makumire, S., Revaprasadu, N., Shonhai, A. DnaK protein alleviates toxicity induced by citrate-coated gold nanoparticles in Escherichia coli. PLoS One. 10 (4), 0121243 (2015).
- Spence, J., Cegielska, A., Georgopoulos, C. Role of Escherichia coli heat shock proteins DnaK and HtpG (C62. 5) in response to nutritional deprivation. J Bact. 172 (12), 7157-7166 (1990).
- Mayer, M. P., et al. Multistep mechanism of substrate binding determines chaperone activity of Hsp70. Nat Struct Biol. 7 (7), 586-593 (2000).
- Georgopoulos, C. A new bacterial gene (groP C) which affects λ DNA replication. Mol Genet Genomics. 151 (1), 35-39 (1977).
- Tilly, K., McKittrick, N., Zylicz, M., Georgopoulos, C. The dnaK protein modulates the heat-shock response of Escherichia coli. Cell. 34 (2), 641-646 (1983).
- Buchberger, A., Gassler, C. S., Buttner, M., McMacken, R., Bukau, B. Functional defects of the DnaK756 mutant chaperone of Escherichia coli indicate distinct roles for amino-and carboxyl-terminal residues in substrate and co-chaperone interaction and interdomain communication. J Biol Chem. 274 (53), 38017-38026 (1999).
- Taj, M. K., et al. Escherichia coli as a model organism. Int J Eng Res. 3 (2), 1-8 (2014).
- Sato, S., Wilson, R. I. Organelle-specific cochaperonins in apicomplexan parasites. Mol Biochem Parasitol. 141 (2), 133-143 (2005).
- Molecular characterisation of the chaperone properties of Plasmodium falciparum. heat shock protein 70. Rhodes University Available from: https://commons.ru.ac.za/vital/access/manager/Repository/vital:3977?site_name=Rhodes+University (2007)
- Makumire, S., et al. Mutation of GGMP repeat segments of Plasmodium falciparum Hsp70-1 compromises chaperone function and Hop co-chaperone binding. Int J Mol Sci. 22 (4), 2226 (2021).
- Nitika, P. C. M., Truman, A. W., Truttmann, M. C. Post-translational modifications of Hsp70 family proteins: Expanding the chaperone code. J Biol Chem. 295 (31), 10689-10708 (2020).
- Knighton, L. E., Saa, L. P., Reitzel, A. M., Truman, A. W. Analyzing the functionality of non-native Hsp70 proteins in Saccharomyces cerevisiae. Bio Protoc. 9 (19), e3389 (2019).
