Test di complementazione basato su Escherichia coli per studiare la funzione chaperone della proteina da shock termico 70
Summary
Questo protocollo dimostra l’attività chaperone della proteina da shock termico 70 (Hsp70). Le cellule dnaK756 di E. coli fungono da modello per il test in quanto ospitano un Hsp70 nativo e funzionalmente compromesso, che le rende suscettibili allo stress termico. L’introduzione eterologa di Hsp70 funzionale salva il deficit di crescita delle cellule.
Abstract
La proteina da shock termico 70 (Hsp70) è una proteina conservata che facilita il ripiegamento di altre proteine all’interno della cellula, rendendola uno chaperone molecolare. Mentre Hsp70 non è essenziale per le cellule di E. coli che crescono in condizioni normali, questo chaperone diventa indispensabile per la crescita a temperature elevate. Poiché Hsp70 è altamente conservato, un modo per studiare la funzione chaperone dei geni Hsp70 di varie specie è quello di esprimerli eterologamente in ceppi di E. coli che sono carenti di Hsp70 o che esprimono un Hsp70 nativo che è funzionalmente compromesso. Le cellule dnaK756 di E. coli non sono in grado di supportare il DNA del batteriofago λ. Inoltre, il loro Hsp70 nativo (DnaK) mostra un’elevata attività ATPasica mentre dimostra una ridotta affinità per GrpE (fattore di scambio nucleotidico Hsp70). Di conseguenza, le cellule di E. coli dnaK756 crescono adeguatamente a temperature comprese tra 30 °C e 37 °C, ma muoiono a temperature elevate (>40 °C). Per questo motivo, queste cellule fungono da modello per lo studio dell’attività chaperone di Hsp70. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per l’applicazione di queste cellule per condurre un saggio di complementazione, consentendo lo studio della funzione chaperone nella cellulo di Hsp70.
Introduction
Le proteine da shock termico svolgono un ruolo importante come chaperoni molecolari facilitando il ripiegamento delle proteine, prevenendo l’aggregazione proteica e invertendo il misfolding proteico 1,2. La proteina da shock termico 70 (Hsp70) è uno dei più importanti chaperoni molecolari, che svolge un ruolo centrale nell’omeostasi proteica 3,4. DnaK è l’omologo5 di E. coli Hsp70.
Sono stati sviluppati vari saggi biofisici, biochimici e cellulari per esplorare l’attività chaperone di Hsp70 e per lo screening degli inibitori che hanno come bersaglio questo chaperone 6,7,8. Hsp70 è una proteina altamente conservata. Per questo motivo, diversi Hsp70 di organismi eucarioti, come il Plasmodium falciparum (il principale agente della malaria), sono stati segnalati per sostituire la funzione del DnaK in E. coli 6,9. In questo modo, è stato sviluppato un saggio di complementazione basato su E. coli che coinvolge l’espressione eterologa di Hsp70s in E. coli per esplorare la loro funzione citoprotettiva. Tipicamente, questo test prevede l’utilizzo di cellule di E. coli che sono carenti di DnaK o che esprimono un DnaK nativo che è funzionalmente compromesso. Sebbene il DnaK non sia essenziale per la crescita di E. coli in condizioni normali, diventa essenziale quando le cellule vengono coltivate in condizioni di stress come temperature elevate o altre forme di stress10,11.
I ceppi di E. coli che sono stati sviluppati per studiare la funzione di Hsp70 utilizzando un saggio di complementazione includono E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) ed E. coli dnaK756. Le cellule dnaK103 di E. coli producono un DnaK troncato che non è funzionale e, come tale, le cellule crescono adeguatamente a 30 °C, mentre il ceppo è sensibile allo stress da freddo e da caldo12,13. Analogamente, il ceppo di E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) non cresce oltre i 40 °C14,15. Il ceppo dnaK756 di E. coli esprime un mutante nativo di DnaK (DnaK756) caratterizzato da tre sostituzioni glicina-aspartato nelle posizioni 32, 455 e 468, dando luogo a esiti proteostatici compromessi. Di conseguenza, questo ceppo è resistente al batteriofago λ DNA14. Inoltre, E. coli dnaK756 mostra un’elevata attività dell’ATPasi, mentre la sua affinità per il fattore di scambio nucleotidico, GrpE, è ridotta16. Coli I ceppi mutanti di DnaK fungono da modelli ideali per studiare l’attività chaperone di Hsp70 attraverso un approccio di complementazione. Poiché il DnaK è essenziale solo in condizioni di stress, il test di complementazione viene generalmente condotto a temperature elevate (Figura 1). Alcuni vantaggi dell’utilizzo di E. coli per questo studio includono il suo genoma ben caratterizzato, la rapida crescita e il basso costo di coltura e manutenzione17.
In questo articolo, descriviamo in dettaglio un protocollo che prevede l’uso di cellule dnaK756 di E. coli per studiare la funzione di Hsp70. Gli Hsp70 che abbiamo impiegato nel saggio sono DnaK wild-type e il suo derivato chimerico, KPf (costituito dal dominio ATPasi di DnaK fuso al dominio di legame del substrato C-terminale di Plasmodium falciparum Hsp70-1 6,18). KPf-V436F è stato eterologamente espresso come controllo negativo poiché la mutazione gli impedisce essenzialmente di legare i substrati, abrogando così la sua attività chaperone9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo dimostra l’utilità delle cellule dnaK756 di E. colinell’esplorare la funzione chaperone di Hsp70 espressa eterologamente. Questo test potrebbe essere adottato per lo screening di inibitori che mirano alla funzione di Hsp70 nella cellulo. Tuttavia, una limitazione di questo metodo è che gli Hsp70 che non sono in grado di sostituire il DnaK in E. coli non sono compatibili con questo test. La mancanza di modificazione post-traduzionale21 di alcuni Hsp70 non …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto con sovvenzioni ottenute dal Centro Internazionale per l’Ingegneria Genetica e la Biotecnologia (ICGEB) numero di sovvenzione, HDI/CRP/012, Direzione della Ricerca dell’Università di Venda, sovvenzione I595, Dipartimento di Scienza e Innovazione (DSI) e dalla National Research Foundation (NRF) del Sud Africa (numeri di sovvenzione, 75464 e 92598) assegnati ad AS.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
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