Ensaio de Complementação Baseado em Escherichia coli para Estudo da Função Chaperone da Proteína de Choque Térmico 70
Summary
Este protocolo demonstra a atividade de chaperona da proteína de choque térmico 70 (Hsp70). As células de E. coli dnaK756 servem de modelo para o ensaio, pois abrigam uma Hsp70 nativa funcionalmente prejudicada, tornando-as suscetíveis ao estresse térmico. A introdução heteróloga de Hsp70 funcional resgata a deficiência de crescimento das células.
Abstract
A proteína de choque térmico 70 (Hsp70) é uma proteína conservada que facilita o enovelamento de outras proteínas dentro da célula, tornando-a uma chaperona molecular. Enquanto Hsp70 não é essencial para células de E. coli crescendo em condições normais, esta chaperona torna-se indispensável para o crescimento em temperaturas elevadas. Uma vez que a Hsp70 é altamente conservada, uma maneira de estudar a função de chaperona de genes de Hsp70 de várias espécies é expressá-los heterologamente em cepas de E. coli que são deficientes em Hsp70 ou expressam uma Hsp70 nativa que está funcionalmente comprometida. As células de E. coli dnaK756 são incapazes de suportar o DNA do bacteriófago λ. Além disso, sua Hsp70 nativa (DnaK) exibe atividade ATPase elevada, enquanto demonstra afinidade reduzida por GrpE (fator de troca de nucleotídeos Hsp70). Como resultado, as células de E. coli dnaK756 crescem adequadamente em temperaturas que variam de 30 °C a 37 °C, mas morrem em temperaturas elevadas (>40 °C). Por esta razão, essas células servem de modelo para o estudo da atividade de chaperona da Hsp70. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a aplicação dessas células na realização de um ensaio de complementação, possibilitando o estudo da função da chaperona in cellulo da Hsp70.
Introduction
As proteínas de choque térmico desempenham um papel importante como chaperonas moleculares, facilitando o enovelamento de proteínas, prevenindo a agregação proteica e revertendo o mau enovelamento de proteínas 1,2. A proteína de choque térmico 70 (Hsp70) é uma das chaperonas moleculares mais proeminentes, desempenhando um papel central na homeostase proteica 3,4. DnaK é o homólogo 5 de E. coli Hsp70.
Vários ensaios biofísicos, bioquímicos e baseados em células foram desenvolvidos para explorar a atividade de chaperona de Hsp70 e rastrear inibidores direcionados a essa chaperona 6,7,8. Hsp70 é uma proteína altamente conservada. Por essa razão, vários Hsp70s de organismos eucarióticos, como o Plasmodium falciparum (o principal agente da malária), têm sido relatados para substituir a função DnaK em E. coli 6,9. Desta forma, um ensaio de complementação baseado em E. coli foi desenvolvido envolvendo a expressão heteróloga de Hsp70s em E. coli para explorar sua função citoprotetora. Normalmente, este ensaio envolve a utilização de células de E. coli que são deficientes para DnaK ou que expressam um DnaK nativo que está funcionalmente comprometido. Embora a DnaK não seja essencial para o crescimento de E. coli em condições normais, ela se torna essencial quando as células são cultivadas sob condições estressantes, como temperaturas elevadas ou outras formas de estresse10,11.
Cepas de E. coli que foram desenvolvidas para estudar a função Hsp70 usando um ensaio de complementação incluem E. coli dnaK103 (BB2393 [C600 dnaK103(Am) thr::Tn10]) e E. coli dnaK756. As células dnaK103 de E. coli produzem um DnaK truncado que não é funcional e, como tal, as células crescem adequadamente a 30 °C, enquanto a cepa é sensível ao estresse térmico e ao frio12,13. Da mesma forma, a cepa de E. coli dnaK756/BB2362 (dnaK756 recA::TcR Pdm1,1) não cresce acima de 40 °C14,15. A cepa de E. coli dnaK756 expressa um DnaK nativo mutante (DnaK756) caracterizado por três substituições de glicina para aspartato nas posições 32, 455 e 468, dando origem a resultados proteostáticos comprometidos. Consequentemente, essa cepa é resistente ao DNA λ do bacteriófago14. Além disso, E. coli dnaK756 exibe elevada atividade da ATPase, enquanto sua afinidade pelo fator de troca de nucleotídeos, GrpE, é reduzida16. E. coli Linhagens mutantes de DnaK servem como modelos ideais para investigar a atividade de chaperona de Hsp70 através de uma abordagem de complementação. Como a DnaK só é essencial sob condições estressantes, o ensaio de complementação é tipicamente conduzido em temperaturas elevadas (Figura 1). Algumas vantagens do uso de E. coli para este estudo incluem seu genoma bem caracterizado, crescimento rápido e baixo custo de cultivo e manutenção17.
Neste artigo, descrevemos em detalhes um protocolo envolvendo o uso de células de E. coli dnaK756 para estudar a função da Hsp70. As Hsp70s que empregamos no ensaio são DnaK selvagens e seu derivado quimérico, KPf (composto pelo domínio ATPase da DnaK fundido ao domínio C-terminal de ligação ao substrato C-terminal Hsp70-1 6,18). O KPf-V436F foi heterologamente expresso como um controle negativo, uma vez que a mutação essencialmente o bloqueia de substratos de ligação, revogando assim sua atividade de chaperona9.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo demonstra a utilidade das células dnaK756 de E. colina exploração da função chaperona de Hsp70 heterologamente expressa. Este ensaio pode ser adotado para rastrear inibidores visando a função de Hsp70 em celulose. No entanto, uma limitação deste método é que Hsp70s incapazes de substituir DnaK em E. coli não são compatíveis com este ensaio. A falta de modificação pós-traducional21 de algumas Hsp70s não-nativas pode explicar sua falta de fun?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado com financiamento obtido do International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology (ICGEB) grant number, HDI/CRP/012, Research Directorate of the University of Venda, grant I595, Department of Science and Innovation (DSI) e da National Research Foundation (NRF) da África do Sul (grant numbers, 75464 & 92598) concedido à AS.
Materials
| 2-β-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | 8,05,740 | Constituent for sample loading dye |
| Acetic acid | Labchem | 101005125 | Constituent of destainer |
| Acrylamide | Sigma-Aldrich | 8008300100 | Component of SDS |
| Agar | Merck | HG000BX1.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Agarose | Clever Scientific | 14131031 | Certified molecular biology agarose |
| Ammonium persulfate | Sigma-Aldrich | 101875295 | Constituent for SDS-PAGE gel |
| Ampicillin | VWR International | 0339—EU—25G | Selective antibiotic |
| Bis | Sigma-aldrich | 1015460100 | Component of SDS |
| Bromophenol | Sigma-Aldrich | 0449-25G | Constituent for sample loading dye |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | For competent cells preparation |
| Coomassie brilliant blue | VWR International | 443293X | SDS-PAGE dye |
| Dibasic sodium phosphate | Sigma-Aldrich | RB10368 | Constituent of PBS buffer |
| ECL | Thermofischer Scientific | 32109 | Western blot detection reagent |
| Ethidium Bromide | Thermofischer Scientific | 17898 | DNA intercalating dye |
| Glycerol | Merck | SAAR2676520L | Constituent for sample loading dye |
| Glycine | VWR International | 10119CU | Component of SDS |
| IPTG | Glentham life sciences | 162IL | inducer |
| Kanamycin | Melford | K0126 | Selective antibiotic |
| Magnesium Chloride | Merck | SAAR4123000EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Methanol | Labchem | 113140129 | Constituent of destainer |
| Monobasic potassium phosphate | Merck | 1,04,87,30,250 | Constituent of PBS buffer |
| Peptone | Merck | HG000BX4.250 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Potassium chloride | Merck | SAAR5042020EM | Constituent of PBS buffer |
| PVDF membrane | Thermofischer scientific | PB7320 | Western blot membrane |
| Sodium Chloride | Merck | SAAR5822320EM | Constituent of medium and liquid growth assay |
| Sodium dodecyl sulphate | VWR International | 108073 | To resolve expressed proteins |
| Spectramax iD3 | Separations | 373705019 | Automated plate reader |
| TEMED | VWR international | ACRO420580500 | Component of SDS gel |
| Tetracycline | Duchefa Biochemies | T0150.0025 | Selective antibiotic |
| Tris | VWR International | 19A094101 | Component of SDS gel |
| Tween20 | Merck | SAAR3164500XF | Constituent for Western wash buffer |
| Western transfer chamber | Thermofisher Scientific | PB0112 | Transfer of protein to nitrocellulose membrane |
| Yeast extract | Merck | HG000BX6.500 | Constituent of medium and liquid growth assay |
| α-DnaK antibody | Inqaba | BK CAC09317 | Primary antibody |
| α-rabbit antibody | Thermofischer scientific | 31460 | Secondary antibody |
References
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