Summary

Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection(요추 수조 주입을 통한 어린 쥐의 척수강내 벡터 전달)

Published: March 29, 2024
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Summary

어린 쥐의 요추 수조에 주사를 놓는 수술 절차가 설명되어 있습니다. 이 접근법은 유전자 치료 벡터의 척수강내 전달에 사용되어 왔지만, 이 접근법은 세포 및 약물을 포함한 다양한 치료제에 사용될 수 있을 것으로 예상됩니다.

Abstract

유전자 치료는 기능적 유전자를 도입하거나, 독성 유전자를 비활성화하거나, 질병의 생물학적 특성을 조절할 수 있는 유전자를 제공하는 등 질병 치료를 위해 환자에게 새로운 유전자를 전달하는 강력한 기술입니다. 치료 벡터에 대한 전달 방법은 전신 전달을 위한 정맥 주입에서 표적 조직에 직접 주입에 이르기까지 다양한 형태를 취할 수 있습니다. 신경퇴행성 질환의 경우, 뇌 및/또는 척수 쪽으로 transduction을 치우는 것이 바람직한 경우가 많습니다. 전체 중추신경계를 표적으로 하는 최소 침습적 접근법은 뇌척수액(CSF)에 주사하여 치료제가 중추신경계의 많은 부분에 도달할 수 있도록 하는 것입니다. 뇌척수액에 벡터를 전달하는 가장 안전한 방법은 척수의 요추 수조에 바늘을 삽입하는 요추 척수강내 주사입니다. 요추 천자라고도 하는 이 기술은 신생아 및 성인 설치류와 대형 동물 모델에 널리 사용되었습니다. 이 기술은 종과 발달 단계에 따라 유사하지만 척수강내 공간을 둘러싼 조직의 크기, 구조 및 탄성의 미묘한 차이로 인해 접근 방식에 적응이 필요합니다. 이 기사에서는 아데노 관련 혈청형 9 벡터를 전달하기 위해 어린 쥐에서 요추 천자를 수행하는 방법을 설명합니다. 여기에서 25-35 μL의 벡터를 요추 수조에 주입하고 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터를 사용하여 각 주입으로 인한 transduction profile을 평가했습니다. 이 접근 방식의 이점과 과제에 대해 설명합니다.

Introduction

바이러스 매개 유전자 치료의 가능성은 최근 몇 년 동안 척수성 근위축증, 망막 이영양증, 인자 IX 혈우병, 암 등에 대한 치료법에 대한 FDA 승인으로 마침내 실현되었습니다 1,2,3,4. 현재 수많은 다른 치료법이 개발 중입니다. 유전자 치료는 환자의 세포에 치료용 유전자를 전달하는 것을 목표로 합니다. 이 새로운 유전자의 산물은 결핍된 내인성 유전자에서 누락된 활성을 대체하거나, 독성 유전자를 억제하거나, 암세포를 죽이거나, 다른 유익한 기능을 제공할 수 있습니다.

중추신경계(CNS)에 영향을 미치는 질환의 경우, 유전자 치료 벡터를 표적 조직에 직접 전달하는 것이 바람직한 경우가 많습니다. 비체계적 접근법은 두 가지 이점을 제공합니다: 말초 transduction에 의해 야기될 수 있는 off-target 부작용을 최소화하고, target tissue에서 적절한 수준의 transduction을 달성하는 데 필요한 벡터의 양을 크게 줄입니다5.

유전자 치료 벡터를 중추신경계에 전달하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 벡터를 척수 또는 뇌 조직에 직접 주입하는 실질내 주사는 정의된 영역으로 전달하기 위해 사용할 수 있습니다. 그러나 많은 질병의 경우 중추신경계의 광범위한 전달이 필요합니다. 이는 뇌와 척수 안팎을 흐르는 뇌척수액(cerebrospinal fluid, CSF)5에 벡터를 전달하여 달성할 수 있습니다. CSF에 벡터를 전달하는 세 가지 주요 방법이 있습니다. 가장 침습적인 접근법은 뇌내주사 전달로, 두개골을 통해 버 구멍을 뚫고 뇌를 통해 측심실로 바늘을 전진시키는 것입니다. 이것은 뇌 전체에 형질전환을 일으킨다. 그러나, 이 시술은 두개내 출혈을 유발할 수 있으며, 이 접근법은 일반적으로 척수의 제한된 형질도입만을 생성한다6. 두개골 기저부에 있는 수조에 주입하는 것은 덜 침습적이지만 뇌간에 손상을 줄 위험이 있습니다. 동물연구에서 자주 사용되지만5, 수조 마그나(cisterna magna)에 주입하는 것은 더 이상 클리닉에서 일상적으로 사용되지 않는다7. 요추 천자는 뇌척수액에 접근하기 위한 가장 덜 침습적인 접근 방식입니다. 이것은 두 개의 요추 사이에 바늘을 삽입하고 요추 수조에 넣는 것을 포함합니다.

벡터 전달을 위한 요추 천자는 성인 쥐와 마우스 및 신생아 마우스에서 일상적으로 수행된다 8,9. 이 연구의 저자들은 최근 어린 쥐(생후 28-30일)에서 요추 천자를 수행하여 아데노 관련 바이러스 혈청형 9(AAV9) 벡터를 전달했습니다. 성체 쥐에서, 신생아 요추 천자 바늘을 L3 및 L4 척추9 사이에 수직으로 배치하였다. 적절하게 배치하면 꼬리가 튕기고 CSF가 바늘 저장소로 흘러 들어갑니다. 하지만 어린 쥐에서는 이러한 판독 결과 중 어느 것도 달성되지 않았습니다. 그런 다음 저자들은 L5와 L610 사이의 각도로 삽입된 27G 인슐린 주사기를 사용하여 성체 마우스 절차를 적용하려고 시도했습니다. 일반적으로 P28 쥐보다 작은 성체 마우스에서는 꼬리 튕김이 발생하지 않지만 주사액의 역류로 인해 잘못된 바늘 배치가 분명합니다. 그러나 어린 쥐에서는 이러한 접근 방식이 균일하게 주사액이 경막외 투여되도록 유도했는데, 이는 성체 쥐와 어린 쥐 사이의 척수를 둘러싼 조직층의 탄성이 다르기 때문일 수 있습니다. 다음으로 카테터 접근법을 평가했습니다. 구체적으로, 카테터는 요추 수조의 경막의 절개를 통해 중앙 흉부 척수까지 도입되었습니다. 그러나 이 접근법은 분만 중 주사액이 절개 부위 밖으로 상당히 역류하는 결과를 낳았습니다. 가이드 바늘을 사용하여 경피적으로 카테터를 척수강 내 공간에 삽입하려는 시도도 성공하지 못했습니다. 층간 폭이 좁기 때문에 카테터가 로스트랄 층에 부딪혀 전진하지 못할 가능성이 높습니다.

여기에서, 어린 쥐에서 요추 천자를 통해 성공적이고 재현 가능한 용액 전달을 달성하기 위한 방법이 설명됩니다. 이 접근법은 바이러스 벡터에 사용할 수 있으며 세포, 의약품 및 기타 치료제에도 사용할 수 있습니다.

Protocol

이 연구는 에모리 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 Sprague-Dawley 쥐(생후 28-30일, 약 90-135g 범위의 질량, 수컷 및 암컷)를 사용했습니다. 1. 벡터의 준비 절차를 시작할 때 AAV9 벡터( 재료 표 참조)를 얼음에서 해동합니다. 벡터가 포함된 마이크로 원심분리기 튜브를 탁상형 원심분리기에서 잠시…

Representative Results

주입 기술의 정확성을 결정하기 위해, 염료인 트리판 블루(trypan blue)를 치료제의 대리물로 사용하였다. 이 염료는 단백질에 쉽게 결합하므로 일반적으로 주입된 구조 내에 머뭅니다. 이는 염료가 치료제의 주사 후 분포를 정확하게 예측하지 못할 수 있음을 의미합니다. 단순히 주입의 정확도를 밝히는 데 사용됩니다. 요추 수조에 성공적으로 주입되면 트리판 블루가 경막에 결합하여 척수 주변을 …

Discussion

다양한 질병이 중추신경계에 영향을 미칩니다. 바이러스 벡터를 통해 관련 유전자의 기능적 사본을 제공하는 것은 척수성 근위축증과 같이 본질적으로 열성 및 단일 유전자 질환에 매력적인 치료 전략입니다. 그러나 혈액-뇌 장벽(BBB)은 정맥 주사로 투여되는 대부분의 유전자 치료 벡터를 제외합니다11. AAV9와 같이 BBB를 통과할 수 있는 것들은 말초 transduction으로 인한 벡터 손실?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자들은 척수강내 주사를 위해 어린 쥐가 제기하는 도전에 대해 생산적인 토론을 해준 UT Southwestern의 Steven Gray, Matthew Rioux, Nanda Regmi 및 Lacey Stearman에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 연구는 Jaguar Gene Therapy(JLFK로)의 자금 지원으로 부분적으로 지원되었습니다.

Materials

200 µL filtered pipette tips MidSci PR-200RK-FL Pipetting virus
AAV9-GFP Vector Builder P200624-1005ynr AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 – 0 Braided McKesson J422H Suture
Bench pad VWR 56616-031 Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8'' Fisher Scientific 50-195-4664 Maintains body temperature
Buprenorphine McKesson 1013922 Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL) Zoopharma Extended-release analgesic
Cotton swabs Fisher Scientific 19-365-409 Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration Steris 1212CPSTF Surgical drape
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11251-20 Forceps
Electric Blanket CVS Health CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL Eppendorf 3123000055 Pipetting virus
Fine Scissors Fine Science Tools 14059-11 Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs Fine Science Tools 16121-14 Laminectomy
Halsey Needle Holders Fine Science Tools 12001-13 Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc BD 328431 Syringe
Isoflurane McKesson 803250 Anesthetic
Isopropanol wipes Fisher Scientific 22-031-350 Skin disinfection
Lidocaine, 1% McKesson 239935 Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL Fisher Scientific 05-408-137 Loading the syringe
Povidone-iodine Fisher Scientific 50-118-0481 Skin disinfection
Scalpel Handle – #4 Fine Science Tools 10004-13 Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber Braintree Scientific EZ-17 Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped McKesson 4-111 #11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment Alcon Eye ointment
Trypan Blue VWR 97063-702 Injection

References

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Cite This Article
Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. Intrathecal Vector Delivery in Juvenile Rats via Lumbar Cistern Injection. J. Vis. Exp. (205), e66463, doi:10.3791/66463 (2024).

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