培養哺乳類細胞における オルト -フタルアルデヒドを用いたグルタチオンの酸化型および還元型グルタチオンの迅速な定量(英語)

注:次のプロトコルは、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイおよびアデニル酸キナーゼ(AK)アッセイと組み合わせて使用 され、サンプルを治療に正規化するために利用できる能力で設計されています。材料の準備と使用を通じて、オペレーターが適切な服装と必要な安全装置(Howieラボコート、ニトリル手袋、クラスI安全メガネなど)を着用していることを確認してください。プロトコルはいくつかの段階に分かれています。 1. ストックとワーキングソリューションの準備 1 mM HCl 中に 100 mM GSH 標準試料のストック溶液を調製します(37% HCl を二重蒸留水(ddH2O)で調製)。注:37%HClなどの高濃度の酸から希釈する場合は、クラスIのヒュームフードで水に酸を添加する正しいプロセスを確認してください。 無水エタノール中に22.35 mM OPAのストックを調製します。この手順は、クラスIのヒュームフードで実行します。ddH2O中に25 mM N-エチルマレイミド(NEM)を調製します。このステップはクラスIのヒュームフードで行ってください。注:これら3つの溶液は、-20°Cで最大3か月間保存できます。 0.01 Mトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン(TCEP)を、100ウェルに必要な総容量500 μLまで調製します。100 mM GSH標準試料100 μLを調製し、ddH2Oを使用して100 mMストックから希釈します。 免疫沈降(IP)溶解バッファーを使用するか、次の製剤を使用します:394 mgのTris-HCl(最終濃度25 mM)、877 mgのNaCl(最終濃度150 mM)、29 mgのEDTA(最終濃度1 mM)、1 mLの100%NP-40またはIGEPAL CA-630(最終濃度1% V / V)、5 mLのグリセロール(最終濃度5%V / V)、 84 mLのddH2Oを穏やかに攪拌しながら成分を混合し、pHを7.4に調整します。100 mLメスフラスコにデカンタし、残りの容量のddH2Oを加えて最終容量100 mLにします。滅菌フィルターを0.22μmフィルターに通し、2〜8°Cで最大6ヶ月間保存します。注:溶解溶液は、このアッセイで汚染物質/干渉物として機能します。したがって、上記の定式化が指定されています。 エチレンジアミン四酢酸(PBS-EDTA)を添加した0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水を1 L、具体的には7.2、8.5、9.0の3種類のpH値で調製します。市販の0.1 M PBS緩衝液に1 mM EDTA(292.24 mg/L)または以下の10x(1 L)製剤を添加してください:80 g NaCl、2.0 g KCl、14.4 g Na2HPO4、2.4 g KH2PO4、800 mLのddH2Oを添加して混合します。1 Lまで補充し、無菌状態のために溶液をオートクレーブし、室温で12ヶ月間保存します。10倍ストック溶液からPBSの作業溶液を作り、EDTA(前述の濃度)を添加します。注:pHは非常に重要です。プロトコールを開始する前に、pHが正確であることを確認してください。 ddH2O (1 mM、500 μM、250 μM、125 μM、62.5 μM、31.25 μM、15.625 μM、および 7.8125 μM) を使用して、1 mM GSH の 1:2 段階希釈を実行します。各濃度の10 μLを標準ウェルに加えます(2回に分けて行います)。サンプルは溶解バッファーでさらに希釈されます。したがって、濃度はその後、元の濃度(200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625μM)の1/5thになります。注:キャリブレーションの最終濃度は、30 μm、15 μm、7.5 μm、3.75 μm、1.875 μm、937.5 nm、468.8 nm、および234.4 nmです。 2. アッセイ調製 注:このプロトコルは、ATCCから市販されたヒト細胞株HepG2、A549、およびJ774を使用します。これらの細胞株は、本学の動物・組織培養法および規則で概説されている承認されたガイドラインに基づいて利用されました。 アッセイ開始の24時間前に、 表1に示す濃度のシード細胞;ただし、使用する細胞株/種類や治療方法によっては、必要に応じて密度を調整してください。完全増殖培地(Eagles modified essentials medium(EMEM))と10%熱不活化ウシ胎児血清(HIFS)、1%ペンストレップ(10,000U/mLペニシリン/10mg/mLストレプトマイシン)、および1%非必須アミノ酸を含む細胞を増殖させます。 従来の細胞播種方法を用いた播種細胞32.アッセイ後の顕微鏡を使用しない場合は、完全に黒いプレートで細胞を播種します。T75フラスコの細胞の密度と一般的な健康状態を、使用前に顕微鏡で評価します。 清潔で無菌のクラスII生物学的安全キャビネットで、厳格な無菌技術に従って、細胞培地を廃棄し、~15mLの滅菌室温(RT)PBSで細胞を穏やかに洗浄し、廃棄します。 細胞フラスコに滅菌済みの1xトリプシン5 mLを加え、細胞単層が覆うように穏やかに揺さぶり、細胞の剥離を促進するために37°Cのインキュベーターに5分間入れます。 熱不活化ウシ胎児血清(10%)を含む増殖培地、約10mLを添加してトリプシン化を停止します。 細胞を50 mLの遠心チューブに移し、200 x g のペレットで5分間移します。メディアを廃棄し、同じメディア5mLと交換します。細胞が均一になり、凝集が観察されなくなるまで、チューブ内に細胞を再懸濁します。 20 μLの細胞懸濁液を取り出し、血球計算盤に入れてカウントします。必要な細胞数を計算したら、希釈を行って正しい細胞密度の溶液を作ります。 96ウェルプレート(容量350μL)に細胞を含む培地をピペットで、ウェルあたり最大容量は200μLです。細胞を5% CO2 を入れた37°Cインキュベーターに24時間置き、プレート表面に接着します。 総グルタチオンとGSSGの両方を評価するには、両方の条件のサンプルを処理します。6つのウェルを播種して処理し、GSHとGSSGをそれぞれ2セットずつ提供し、3つのテクニカルリピートを行います(図1 はレイアウトを示しています)。 アッセイを開始する前に、すべての試薬が適切に調製されていることを確認してください。pH 7.4 PBS(EDTAなし)を除き、バッファーの構築またはアッセイでの使用を開始する前に、すべてのバッファー成分と試薬がRTであることを確認してください。ただし、pH 7.4 PBS(EDTAなし)は、使用するまで氷上または冷蔵保存する必要があります。注:アッセイ内で所望の反応が発生し、プレートリーダーによる正確な定量を可能にするために、気泡形成を最小限に抑えることが非常に重要です。 細胞株 播種密度(96ウェルプレート) ヘップG2 10,000細胞/ウェル A549 5,000細胞/ウェル J774の 10,000細胞/ウェル 表1:選択した細胞株の推奨播種密度。 示されたのは、表現されたデータで使用されている3つの異なる細胞株、具体的にはA549、J774、およびHepG2の異なる播種密度です。 図1:総グルタチオンとグルタチオンジスルフィドの同時測定のための96ウェルプレートの播種のための提案されたレイアウト。 キャリブレーションと制御用のウェルも実演されています。利用されていない井戸は十字で表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 3. ナノマテリアル処理 ナノ材料(特にZnO、TiO2、CuO、およびAg)をμg対応の重量スケールで秤量します。ナノ材料あたり1 mg/mLの初期濃度を達成するための計算を実行します。 ナノ材料溶液をソニケーターに移し、ソニケーションバス(38W)を使用して16分間ソニケーションし、均質な溶液を生成します。各ナノ材料について、125、62.5、31.25、15.625μg/mLで一連の希釈を行います。 インキュベーターから細胞を取り出し、RT PBSで軽く洗浄します。すべてのPBSが除去されたことを確認した後、コントロール(HIFSを含まない培地)を使用して、プレートに100μLの処理を追加します。細胞に処理を適用した後、37°Cのインキュベーター(5%CO2)でナノ材料と4時間インキュベートします。その後、以下のプロトコルを使用してGSH(GSSG、タンパク質濃度、およびAK放出)を定量化します。 4. アッセイプロトコール 治療への曝露後(図2A)、アデニル酸キナーゼ(AK)活性(オプション)を介して生存率を評価します。このアッセイには、製造元の指示に従って市販のキットを使用してください。 200 x g の遠心分離機でプレートを5分間回転させ、処理と細胞破片を軽くペレット化します(図2B)。 各サンプルとコントロールウェルから20 μLの培地上清を静かに取り除き(上記で指定)、同じレイアウト形式で隣接する96ウェルの白色プレートにピペットで移します(図2C)。 AKキットから各ウェルに100 μLの作業溶液を加え、プレートを光から遮蔽し、室温で10分間現像します。プレートリーダーを使用して1000カウント/秒で発光を記録します。 GSH標準試料については、各ウェルに40 μLの総グルタチオンバッファーを添加します(図2D;オプション、定量に必要)。 プレートから残った媒体を吸引し、氷冷した0.1 M PBS、pH 7.2で3回洗浄し、標準試料を除き、各洗浄(図2E)を廃棄します。GSHキャリブレーションがプレートにロードされるまで、最終洗浄をプレートに残しておきます。 各グルタチオン濃度とブランク(ddH2O)を各10 μLをウェルに3回加えます。 最終的なPBS洗浄液を取り出し、表2に従って混合物を各ウェルに加えて、目的のターゲット定量を行います(図2E)。この手順を開始する前に、完全なバッファーでは時間的制約のあるアクティビティーの損失のため、必要なボリュームを計算してください。アッセイプロセスを開始する前に、これらの試薬ミックスが作成されていることを確認してくださいが、使用前に30分以上放置しないでください。 オービタルプレートシェーカーに置き、プレートを300RPMで2分間振とうします(図2F)。 シェーカーから取り出し、NEMコントロールウェルを除く各ウェルに5μLの0.01M TCEP溶液を加えます。プレートをシェーカーに戻し、10分間インキュベートします(図2F)。 プレートを遠心分離機に移し、200 x g で5分間遠心します。各サンプルウェルから25 μLを別の96ウェルプレート(透明)に移します。これは、タンパク質の濃縮に利用されます(ステップ4.15を参照。 図2G)。標準物質やアッセイコントロールを移管しないでください。 各ウェルの最終容量が30μLであることを確認してください。この要件を満たすために、コントロールと標準からボリュームを削除します(図2H)。 170 μLの作業用OPA溶液を各ウェルに加え、プレートを光から遮蔽し、シェーカーに15分間置きます(図2I)。 プレートリーダーを使用して、Ex340/Em450で蛍光を読み取ります(図2J)。測定段階で気泡が存在しないことを確認します。これらは、プレートリーダーによる反応と定量の両方に悪影響を及ぼします。 溶解した細胞のタンパク質含有量を定量するには、市販のBCAアッセイキットを使用します。ステップ 4.12 で採取したサンプルを、新しい 96 ウェルプレート (透明) にウェルあたり 25 μL で移します。 IP溶解バッファーで希釈したウシ血清アルブミン(BSA)標準試料を使用し、ウェルあたり25 μLでプレートに3回添加します。正確な濃度は、BCAキットのプロトコルで定義されています。 BCAキットから50:1の比率の試薬AとBからなるワーキング溶液を調製し、サンプル、標準、およびコントロールを含む各ウェルに200μLを加えます。プレートを光から遮蔽し、37°Cで30分間 インキュベートします(図2K)。 インキュベーターからサンプルを取り出し、室温で5分間平衡化した後、562 nmのプレートリーダーで吸光度を読み取ります(図2L)。 総グルタチオン濃度溶解試薬ミックス コンポーネント 容積 溶解バッファー 50μL 総容量/井戸 50μL 酸化グルタチオン濃度溶解試薬ミックス コンポーネント 容積 溶解バッファー 49.5μL NEM(25mM) 0.5μL 総容量/井戸 50μL 混合物の組成から30分以内に両方の溶液を使用してください OPA検出ソリューションコンポーネント 容積 OPA 3mg/mL 5μL PBS(pH 9.0) 165μL 総容量/井戸 170μL 表2:プロトコールを実行するために必要な試薬の量。 総グルタチオン、グルタチオンジスルフィド、および必要な作業試薬の測定にウェルごとに必要な量。必要なボリュームが計算され、転送によるボリューム損失を考慮して超過分が含まれていることを確認します。 図2:プロトコールの概略図(A)細胞の初期播種、インキュベーションおよび処理。(B)懸濁物質から媒体を分離するための遠心分離。(C)アデニル酸キナーゼアッセイのための培地移入。(D)キャリブレーション範囲のためのグルタチオン濃度の添加。(E)洗浄段階と溶解試薬の添加。(F)バッファー添加およびトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン添加、振とうステップ。(G)タンパク質分析のための培地除去のための溶解細胞の遠心分離。(H)プレート全体のボリュームを均等にするためのメディアの除去。(I)オルト-フタルアルデヒド作業溶液の添加と振とうインキュベーション。(J)プレートリーダーによるオルトフタルアルデヒド蛍光の測定。(K)タンパク質測定のためのビシンコニン酸アッセイのインキュベーションステージ。(L)グルタチオンの正常化を可能にするタンパク質濃度の測定:グルタチオンジスルフィド値。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。