القياس الكمي السريع للأشكال المؤكسدة والمخفضة من الجلوتاثيون باستخدام أورثو فثالدهيد في خلايا الثدييات المستزرعة في المختبر
Summary
تم تحقيق القياس الكمي لكل من الأشكال المؤكسدة والمخفضة من الجلوتاثيون (GSSG و GSH ، على التوالي) من خلال استخدام أورثو فثالدهيد (OPA). يصبح OPA شديد الفلورسنت بمجرد اقترانه ب GSH ولكنه غير قادر على اقتران GSSG حتى يتم تقليله. هنا ، نصف مقايسة متعددة المعلمات لتحديد كليهما باستخدام القياس الكمي للبروتين للتطبيع.
Abstract
منذ فترة طويلة يعتبر الجلوتاثيون علامة حيوية رئيسية لتحديد استجابة مضادات الأكسدة للخلية. وبالتالي ، فهي علامة أساسية لدراسات أنواع الأكسجين التفاعلية. تستخدم الطريقة أورثو فثالدهيد (OPA) لتحديد التركيز الخلوي للجلوتاثيون (ق). يترافق OPA مع الجلوتاثيون المختزل (GSH) عبر ارتباط سلفهيدريل لتشكيل إيزوإندول لاحقا ، مما ينتج عنه اقتران شديد الفلورسنت. للحصول على نتيجة دقيقة لكل من الجلوتاثيون المؤكسد (GSSG) و GSH ، يلزم الجمع بين عوامل التقنيع وعوامل الاختزال ، والتي تم تنفيذها في هذا البروتوكول. قد تؤثر العلاجات أيضا على الصلاحية الخلوية. ومن ثم ، يتم تقديم التطبيع عن طريق مقايسة البروتين في هذا الفحص متعدد المعلمات. يوضح الفحص نطاق الكشف الخطي الزائف من 0.234 – 30μM (R2 = 0.9932±0.007 (N = 12)) خاص ب GSH. يسمح الفحص المقترح أيضا بتحديد الجلوتاثيون المؤكسد مع إضافة عامل التقنيع N-ethylmaleimide لربط الجلوتاثيون المختزل ، ويتم إدخال عامل الاختزال tris (2-carboxyethyl) الفوسفين لشق رابطة ثاني كبريتيد في GSSG لإنتاج جزيئين من GSH. يتم استخدام الفحص مع مقايسة حمض bicinchoninic التي تم التحقق من صحتها لقياس كمية البروتين ومقايسة كيناز أدينيلات لتقييم السمية الخلوية.
Introduction
أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) هي محفز أساسي للإجهاد التأكسدي. تم تأسيس الإجهاد التأكسدي بشكل جيد في توليد طفرات الحمض النووي ، والشيخوخة الخلوية / الموت ، والسرطانات المختلفة ، والسكري ، والأمراض العصبية (مثل باركنسون والزهايمر) ، والعديد من الحالات الأخرى المنهكة للحياة1،2،3،4،5. الدفاع الرئيسي ضد أنواع الأكسجين التفاعلية هو مضادات الأكسدة غير الأنزيمية ، والتي هي قادرة على الحد من المؤكسدات أو الجذور من خلال العمل كمتبرعين للبروتون 6,7. الجلوتاثيون (GSH) والسيستين هما الثيول الأكثر انتشارا الموجود في الثدييات8 ، في حين توجد العديد من الثيول منخفض الوزن الجزيئي (مثل الإرغوثيونين) ، GSH والسيستين هما أكثر مضادات الأكسدة غير الأنزيمية شيوعا الموجودة في الأدبيات9،10،11 ولهما أهمية أكبر لمكافحة أنواع الأكسجين التفاعلية8،12،13،14.
عند استخدام GSH كمضاد للأكسدة ، يتم ربط جزيئين من GSH تساهميا معا عبر رابطة ثاني كبريتيد لصنع ثاني كبريتيد الجلوتاثيون (GSSG). غالبا ما يستخدم استنفاد GSH كمؤشر للإجهاد التأكسدي 15,16. يمكن أيضا الجمع بين هذا التقييم والكشف عن GSSG ، على الرغم من أن الزيادات في GSSG في الخلايا غالبا ما تكون محدودة بسبب عمليات التصدير النشطة لأن GSSG يمكن أن يكون تفاعليا نسبيا في الخلايا ، مما يؤدي إلى تكوين رابطة ثاني كبريتيد مع ثيول البروتينالآخر 16.
الطرق التقليدية لقياس GSH و GSSG ليست عمليات بسيطة وتتطلب خطوات عديدة ، بما في ذلك الاستخراج الخلوي باستخدام الكواشف lytic17,18. يبسط البروتوكول الموضح هنا هذه الطرق ويسمح بالقياس الدقيق للثيولات غير الأنزيمية والتطبيع باستخدام محتوى البروتين الخلوي أو إطلاق كيناز أدينيلات. بالإضافة إلى ذلك ، من الممكن قياس الجدوى الخلوية قبل استخراج GSH / GSSG. حاولت عدة طرق سابقا استهداف وقياس الثيولات غير الأنزيمية المختزلة والمؤكسدة بكفاءة. طرق تشمل استخدام HPLC19،20،21 ، مقايسة الألواح (الكيمياء الحيوية) 22،23،24،25 ، والتي تستخدم الكواشف الشائعة لاقتران الثيول ، مثل 5،5-ديثيو مكرر (2-حمض النيتروبنزويك) (DTNB / كاشف إيلمان) 19 ، أحادي كلوروبيمان (mBCI) 26،27،28. كما أعدت عدة شركات مجموعات مسجلة الملكية للكشف عن الجلوتاثيون. ومع ذلك ، فإنها لا تنشر عدم توافق الكاشف ، مما يمثل مشكلات تعتمد على العلاجات المستخدمة29.
يحدد هذا البروتوكول مقايسة متعددة المعلمات تكتشف الثيول المختزل (مثل GSH) عبر اقتران أورثو فثالدهيد (OPA) لإنتاج إشارة فلورية يمكن اكتشافها عند 340/450 Ex / Em ، على التوالي. يسهل هذا الفحص الكشف عن كل من GSH و GSSG في وقت واحد (في الصفيحة) ، من خلال استخدام عوامل التقنيع (N-ethylmaleimide) وعوامل اختزال GSSG (tris (2-carboxyethyl) phosphine). يوفر بروتوكول العلامات الحيوية المتعددة هذا أيضا فرصة خلال مرحلة التحلل الخلوي لتحديد البروتينات عبر مقايسة حمض bicinchoninic لتطبيع العينات عند الانتهاء من القياس النهائي أو عن طريق مقايسة كيناز أدينيلات من وسائط الخلية. يمكن إجراء هذا الفحص باستخدام العديد من الكواشف المتوفرة بسهولة في معظم المختبرات ولا يتطلب سوى عدد قليل من المواد الكيميائية الإضافية غير الشائعة لأداءها. العملية بسيطة ويمكن الوصول إليها ويمكن إجراؤها دون مراحل شاقة في أقل من 2 ساعة.
في هذا البروتوكول ، تم اختيار العديد من المواد النانوية التي ثبت سابقا أنها تحفز أنواع الأكسجين التفاعلية أو يشتبه في أنها تحفز الإجهاد التأكسدي30,31. تم استكشاف نطاق التركيز لمعرفة آثار التعرض لهذه المواد النانوية على خطوط الخلايا المختلفة وفعالية الفحص في تحديد كمية الثيول المضاد للأكسدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
كما ذكرنا ، فإن الحاجة إلى فهم الأكسدة والاختزال الخلوي ، ومراقبة حالات الإجهاد التأكسدي ، والاستجابة المضادة للأكسدة كانت دائما حاسمة في فهم ومنع عدد لا يحصى من الأمراض ، مثل السرطانات والتنكس العصبي33,34. يوضح هنا وسيلة لتحسين المشهد الانتقالي من خلال زيادة إمكانية الوصول إلى GSH: كشف GSSG الدقيق مع إعداد سريع وبأقل قدر ممكن.
يوضح هذا البروتوكول تسلسلا متعدد المعلمات من المقايسات لتحديد أنواع الجلوتاثيون / الثيول داخل الخلايا (المختزلة والمؤكسدة) ، مع 2 وسيلة للتطبيع عبر مقايسة بروتين BCA و / أو مقايسة AK. يمكن أيضا تعديل هذا الفحص للكشف عن العديد من العلامات الأخرى من خلال خطوة استخراج الوسيط الأولية ويمكن تبسيطه بطريقة تعطي ببساطة نسبة ثيول مؤكسدة / مخفضة مع استبعاد نطاق المعايرة.
عند النظر في تقييم التحليلات ، تم استكشاف كل من mBCI و OPA ومقارنتهما للاستخدام. بينما أظهر mBCl في البداية إمكانات إشارة جيدة ، تم اكتشاف قيود كبيرة في الاستخدام. في المقام الأول ، يوضح استخدام الخلايا الحية أفضل استخدام ل mBCl. ومع ذلك ، بعد تحلل الخلية ، وجد أن الإشارة قد تم إخمادها وتتضاءل بشكل عام بتنسيق متعدد الآبار مقارنة ب OPA35. هناك مشكلة أخرى تتمثل في قياس GSSG عبر mBCl ، والأدبيات قليلة فيما يتعلق بهذا الأمر ، ومن خلال تحسين / استكشاف البروتوكول ، لم يتم تحقيق الكشف الدقيق عن GSSG من خلال mBCl.
لقد أثبتنا أن مقايسة OPA تقدم نطاقات معايرة موثوقة بشكل كبير ، بمتوسط R2 من 0.9932 ± 0.007 (N = 12) عبر نطاق تركيز 0.234 – 30 μM GSH. تم اختيار هذا النطاق بسبب النطاقات المرجعية السابقة الموجودة في الأدبيات35. من الممكن نظريا اكتشاف الجلوتاثيون خارج هذه النطاقات ولكنه سيتطلب تعديلا لتركيز الكواشف ووقت الحضانة وربما المعدات المستخدمة في الكشف. وتجدر الإشارة إلى أن كل لوحة تتطلب نطاقها القياسي الخاص للقياس الكمي ؛ يمكن أن يكون لأدنى تباين في الوقت بين اللوحات التي يتم إجراؤها في أيام مختلفة تأثير كبير على القيم التي تم الحصول عليها أثناء القياس.
يعتمد الحصول على بيانات دقيقة وموثوقة من هذا البروتوكول على عدة خطوات حاسمة يتم الالتزام بها بدقة. عند إنشاء المخازن المؤقتة المختلفة المطلوبة في البروتوكول ، من الأهمية بمكان أن يكون الرقم الهيدروجيني دقيقا. وبالتالي ، يجب ألا يكون للمخازن المؤقتة التي تتطلب درجة حموضة 9 أي انحراف يتجاوز ± 0.1 من هذه القيمة. ويرجع ذلك إلى احتمال أن تترسب المكونات العازلة من المحلول في الرقم الهيدروجيني الخاطئ ؛ سيؤدي اتباع هذا البروتوكول بالضبط إلى منع هذه المشكلة.
تعد الإزالة الكاملة للمعالجة والغسيل الدقيق قبل التحلل أمرا بالغ الأهمية أيضا لمنع القطع الأثرية والحصول على البيانات غير الدقيقة أثناء مرحلة قراءة اللوحة. بمجرد تحليل الخلايا (الخطوة 4.8) ، لا يمكن إزالة العلاج ، ولن تكون اللوحة قابلة للإنقاذ. نظرا لأحجام المخازن المؤقتة / الكواشف التي تتم إضافتها في جميع أنحاء البروتوكول والتي تختلف بين العينات والمعايير ، فمن الأهمية بمكان أن يكون المستخدم على دراية بالأحجام المتنوعة ، في الخطوة 4.12 و 4.13. يتم أيضا إطلاع مشغل الفحص على هذه الأحجام المتنوعة ويطلب منه التأكد من أن جميع الأحجام هي نفسها للسماح بتحقيق قياس دقيق. نظرا لأن الأحجام بين العينات والمعايير ليست ذات أهمية واضحة ، فقد يكون من السهل ارتكاب خطأ فيما يتعلق بوجود محلول زائد في بئر العينة.
هناك قيود على هذا البروتوكول تعتمد على خطوات حاسمة ، والتي تعتبر ضرورية للحصول على بيانات دقيقة وموثوقة. يحتاج المستخدمون الذين يقومون بإجراء هذا الفحص إلى امتلاك مستوى معقول من المهارات المختبرية لمنع المشاكل غير المرغوب فيها ، مثل تكوين الفقاعة. تكوين الفقاعات له تأثير جذري على كل من القدرة على حدوث التفاعلات داخل الصفيحة الدقيقة وقياس التألق. يحتوي عامل التحلل المستخدم في هذا البروتوكول على منظف ، مما يمثل صعوبة للباحث المبتدئ الذي قد يكافح لمنع تكوين الفقاعة. قد ينقذ الطرد المركزي الفوري هذا الخطأ. من المحتمل أيضا أن يكون البروتوكول محدودا فيما يتعلق بنوع الخلية. تم استخدام خطوط الخلايا A549 و J774 و HepG2 لتحسين وإنتاج البيانات لهذا البروتوكول. قد تتطلب خطوط الخلايا الأخرى كثافات بذر مختلفة وتحسين البروتوكول للحصول على بيانات دقيقة.
يوفر هذا البروتوكول العديد من المزايا مقارنة بالعديد من المقايسات الحالية. في حين أن الكشف عن الثيول باستخدام الفثالدهيد ليس مفهوما جديدا ، فإن الاستخدام في شكل فحص مشترك مثل هذا ، في صفيحة دقيقة ، مع مواد ومعدات محدودة مطلوبة ، يوفر إمكانات كبيرة لجميع المختبرات للوصول إلى هذا البروتوكول. لا تكشف معظم مجموعات Thiol / GSH من الموردين التجاريين عن تكوين الكواشف الخاصة بهم. وبالتالي ، قد يكون من الصعب التنبؤ باحتمال عدم التوافق / التداخل. هنا ، نقدم كل مكون من جميع الكواشف المستخدمة للحد من هذه الإمكانات.
يتم تنفيذ هذا البروتوكول أيضا بسرعة كبيرة عند الانتهاء من فترة العلاج الأولية. عند حساب معالجة المستخدم بين مراحل الحضانة ، يمكن إجراء جانب القياس الكمي للثيول لهذا البروتوكول في أقل من 1 ساعة. يتم تحليل العينات وربطها في وقت واحد لمنع الأكسدة الذاتية للعينات ، وهو الأمثل لهذه الأنواع من التفاعلات. على الرغم من عدم تحديد ذلك في البروتوكول ، يمكن تحليل العينات تقنيا في لوحة وإغلاقها ، مما يسمح بتجميدها لتحليلها في المستقبل. ومع ذلك ، لم يتم استكشاف هذا التغيير في البروتوكول.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل المشاريع الأوروبية GRACIOUS (GA760840) و SUNSHINE (GA952924). ويود المؤلفون أيضا أن يعربوا عن تقديرهم للجهود التي بذلها جميع الذين ساعدوا، بطريقة ما، في وضع هذا البروتوكول.
Materials
| 0.22µm filter (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 12561259 | |
| 100mL volumetric flask | Fisher scientific | 15290866 | |
| 1L Volumetric flask | Fisher scientific | 15230876 | |
| 250mL beaker (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 15409083 | |
| 8-Channel micropipette (20-200µL) | SLS | FA10011D2 | |
| 8-Channel micropipette (2-20µL) | SLS | B2B06492 | |
| 96 well plates – black with clear bottom, TC treated | Fisher scientific | 10000631 | Preferred plate for seeding and fluoresence, use TC treated clear if unavailable |
| 96 well plates – clear (TC treated and untreated) | Fisher scientific | 10141161 | If black plates with clear bottom is not available/ suitable use TC treated clear |
| 96 well plates – white, Not TC treated | Fisher scientific | 11457009 | |
| A549 (lung carcinoma) cell line | ATCC | CCL-185 | |
| Absolute ethanol | Merck (Sigma-Aldrich) | 1.08543 | |
| Aluminium foil | Fisher scientific | 11779408 | For protecting plates from light |
| BCA Assay Kit | Thermo | 23225 | |
| Benchtop Centrifuge (with 96 plate rotor) | Eppendorf | 5804 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck (Sigma-Aldrich) | E9884 | |
| Glutathione (GSH) | Merck (Sigma-Aldrich) | G6013 | |
| Glutathione disulfide (GSSG) | Merck (Sigma-Aldrich) | G4501 | |
| Glycerol | Merck (Sigma-Aldrich) | G5516 | |
| HCl, 37% | Merck (Sigma-Aldrich) | 258148 | Dilute to 1mM for GSH stock, pH adjustment also |
| HepG2 (Hepatocarcinoma) cell line | ATCC | HB-8065 | |
| IGEPAL CA-630 | Merck (Sigma-Aldrich) | 18896 | Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both |
| IP lysis buffer | Fisher scientific | 11825135 | |
| J774 (monocyte, macrophage) cell line | ATCC | TIB-67 | |
| KCl | Merck (Sigma-Aldrich) | P3911 | |
| KH2PO4 | Merck (Sigma-Aldrich) | P0662 | |
| Micropipette (20-200µL) | SLS | B2B06482 | |
| Micropipette (2-20µL) | SLS | B2B06478 | |
| Microplate shaker | VWR | 444-0041 | |
| Na2HPO4 | Merck (Sigma-Aldrich) | S9763 | |
| NaCl | Merck (Sigma-Aldrich) | S9888 | |
| NaOH, 10M | Merck (Sigma-Aldrich) | 72068 | For pH adjustment only |
| N-Ethylmaleimide (NEM) | Merck (Sigma-Aldrich) | E3876 | |
| NP-40 | Merck (Sigma-Aldrich) | 492016 | Use either IGEPAL CA-630 or NP-40 for solution, not both. NP-40 alternative suggested |
| Ortho -Phthaldialdehyde (OPA) | Merck (Sigma-Aldrich) | P1378 | |
| PBS 0.1M | Merck (Sigma-Aldrich) | P2272 | PBS can either be acquired pre-made or made in house, see notes |
| Plate reader (with fluoresence capacity) | Tecan | SPARK | |
| Stir bar (optional-For lysis buffer) | Fisher scientific | 16265731 | |
| Toxilight bioassay kit (AK assay) | Lonza | LT17-217 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) 0.5M in H2O | Alfa Aesar | H51864 | Can also be purchased crystalised and suspended |
| TRIS-HCl | Merck (Sigma-Aldrich) | 93363 | |
| X100 phosphatase and protease cocktail | Fisher scientific | 10025743 |
References
- Barnham, K. J., Masters, C. L., Bush, A. I. Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Nat Rev Drug Discov. 3 (3), 205-214 (2004).
- Arfin, S., et al. Oxidative stress in cancer cell metabolism. Antioxidants. 10 (5), 642 (2021).
- Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
- Ghezzi, P., Jaquet, V., Marcucci, F., Schmidt, H. H. H. W. The oxidative stress theory of disease: levels of evidence and epistemological aspects. Br J Pharmacol. 174 (12), 1784-1796 (2017).
- Bhattacharyya, A., Chattopadhyay, R., Mitra, S., Crowe, S. E. Oxidative stress: An essential factor in the pathogenesis of gastrointestinal mucosal diseases. Physiol Rev. 94 (2), 329-354 (2014).
- Yin, F., Sancheti, H., Cadenas, E. Mitochondrial thiols in the regulation of cell death pathways. Antioxi Redox Sig. 17 (12), 1714-1727 (2012).
- Balcerczyk, A., Bartosz, G. Thiols are main determinants of total antioxidant capacity of cellular homogenates. Free Rad Res. 37 (5), 537-541 (2003).
- McBean, G. J. Cysteine, glutathione, and thiol redox balance in astrocytes. Antioxidants. 6 (3), 62 (2017).
- Nimse, S. B., Pal, D. Free radicals, natural antioxidants, and their reaction mechanisms. RSC Adv. 5 (35), 27986-28006 (2015).
- Nordberg, J., Arnér, E. S. J. Reactive oxygen species, antioxidants, and the mammalian thioredoxin system1. Free Rad Biol Med. 31 (11), 1287-1312 (2001).
- Pham-Huy, L. A., He, H., Pham-Huy, C. Free radicals, antioxidants in disease and health. Int J Biomed Sci. 4 (2), 89 (2008).
- Harris, I. S., DeNicola, G. M. The complex interplay between antioxidants and ROS in cancer. Trend Cell Biol. 30 (6), 440-451 (2020).
- Traverso, N., et al. Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance. Oxid Med Cell Longev. 2013, 972913 (2013).
- Day, R. M., Suzuki, Y. J. Cell proliferation, reactive oxygen and cellular glutathione. Dose-Resp. 3 (3), 425-442 (2005).
- Aquilano, K., Baldelli, S., Ciriolo, M. R. Glutathione: new roles in redox signaling for an old antioxidant. Front Pharmacol. 5, 196 (2014).
- Zitka, O., et al. Redox status expressed as GSH: GSSG ratio as a marker for oxidative stress in paediatric tumour patients. Onco Lett. 4 (6), 1247-1253 (2012).
- Childs, S., Haroune, N., Williams, L., Gronow, M. Determination of cellular glutathione: glutathione disulfide ratio in prostate cancer cells by high performance liquid chromatography with electrochemical detection. J Chrom A. 1437, 67-73 (2016).
- Giustarini, D., et al. glutathione disulfide, and S-glutathionylated proteins in cell cultures. Free Rad Biol Med. 89, 972-981 (2015).
- Özyürek, M., et al. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
- Zhang, L., Lu, B., Lu, C., Lin, J. Determination of cysteine, homocysteine, cystine, and homocystine in biological fluids by HPLC using fluorosurfactant-capped gold nanoparticles as postcolumn colorimetric reagents. J Sep Sci. 37 (1-2), 30-36 (2014).
- Tsiasioti, A., Georgiadou, E., Zacharis, C. K., Tzanavaras, P. D. Development and validation of a direct HPLC method for the determination of salivary glutathione disulphide using a core shell column and post column derivatization with o-phthalaldehyde. J Chromat B. 1197, 123216 (2022).
- Huang, D., Ou, B., Prior, R. L. The chemistry behind antioxidant capacity assays. J Agri Food Chem. 53 (6), 1841-1856 (2005).
- Berker, K. I., Güçlü, K., Tor, &. #. 3. 0. 4. ;., Demirata, B., Apak, R. Total antioxidant capacity assay using optimized ferricyanide/prussian blue method. Food Anal Meth. 3 (3), 154-168 (2010).
- Rahman, I., Kode, A., Biswas, S. K. Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nat Prot. 1 (6), 3159-3165 (2007).
- Kampa, M., et al. A new automated method for the determination of the Total Antioxidant Capacity (TAC) of human plasma, based on the crocin bleaching assay. BMC Clin Pathol. 2 (1), 3 (2002).
- Fernández-Checa, J. C., Kaplowitz, N. The use of monochlorobimane to determine hepatic GSH levels and synthesis. Anal Biochem. 190 (2), 212-219 (1990).
- Nauen, R., Stumpf, N. Fluorometric microplate assay to measure glutathione S-transferase activity in insects and mites using monochlorobimane. Anal Biochem. 303 (2), 194-198 (2002).
- Stevenson, D., Wokosin, D., Girkin, J., Grant, M. H. Measurement of the intracellular distribution of reduced glutathione in cultured rat hepatocytes using monochlorobimane and confocal laser scanning microscopy. Toxicol in vitro. 16 (5), 609-619 (2002).
- McBeth, C., Stott-Marshall, R. J. Interference of reversible redox compounds in enzyme catalysed assays–Electrochemical limitations. Anal Biochem. 662, 114972 (2023).
- Yu, Z., et al. Reactive oxygen species-related nanoparticle toxicity in the biomedical field. Nanoscale Res Lett. 15 (1), 115 (2020).
- Boyles, M., et al. Development of a standard operating procedure for the DCFH2-DA acellular assessment of reactive oxygen species produced by nanomaterials. Toxicol Mech Meth. 32 (6), 439-452 (2022).
- Segeritz, C. P., Vallier, L. Cell culture: Growing cells as model systems in vitro. Basic Sci Meth Clin Res. , 151-172 (2017).
- Ma, Q. Role of nrf2 in oxidative stress and toxicity. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 53, 401-426 (2013).
- Calabrese, V., Cornelius, C., Dinkova-Kostova, A. T., Calabrese, E. J., Mattson, M. P. Cellular stress responses, the hormesis paradigm, and vitagenes: novel targets for therapeutic intervention in neurodegenerative disorders. Antioxid redox Signal. 13 (11), 1763-1811 (2010).
- Ishkaeva, R. A., Zoughaib, M., Laikov, A. V., Angelova, P. R., Abdullin, T. I. Probing cell redox state and glutathione-modulating factors using a monochlorobimane-based microplate assay. Antioxidants. 11 (2), 391 (2022).
